げっ歯類における虚血性網膜症の酸素誘導網膜症モデル

その開発後、酸素誘発性網膜症モデルは、血管新生網膜疾患の前臨床研究で広く使用されるようになりました。これは、低酸素症に応答した病理学的血管新生を研究するためのモデルとして使用されてきました。このモデルの主な利点は、再現性があり、簡単に定量化できる堅牢な神経血管反応を誘導することです。

このモデルは、可能な治療候補の効果を研究するための前臨床モデルとして使用できます。これは、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、滲出性加齢黄斑変性症など、いくつかのヒト疾患の関連モデルと考えられています。低酸素症誘発の前後、および犠牲時の動物の体重を記録します。

ケージの底に十分な食物があることを確認し、ろ過システムを使用しないときに過剰な二酸化炭素を吸収するために、チャンバーの底にカラーインジケーター付きのソーダライムを追加します。チャンバー内の湿度と温度を監視し、湿度を40〜65%に保ちます必要に応じて、水を入れた皿を底に置いてチャンバーの湿度を上げます。酸素センサーを通常の室内空気と100%酸素で校正します。

次に、P7マウスをチャンバーに入れ、酸素レベルを75%に設定しますP12までマウスをチャンバーに5日間保持し、誘導中に動物を監視します。終了したら、マウスをチャンバーから取り出します。動物の体重を量り、尾や耳に識別マークを付けます。

動物に麻酔をかけた後、つま先をつまんでください。小さな反射は許容されます。治療中は動物を加熱パッドの上に置いてください。.

IVT注射には、33〜34ゲージの針が付いたガラスシリンジを使用します。.ヨウ素を一滴垂らしてから、まぶたを押し下げ、鉗子で眼球をつかみます。注射を輪部の後方に、視神経を指す約45度の角度で行います。.

注射液の逆流を避けるために、薬物を注射した後30秒間針を所定の位置に保ちます。.針を抜いた後、出血や網膜の損傷などの合併症がないか眼を調べます。注射後、目の上に抗生物質軟膏を塗布します。

必要に応じて、追跡期間中に生きた動物でin vivoイメージングを実施し、血管新生応答中に網膜に発生する変化を記録します。スペクトル領域光干渉断層撮影法を使用して、in vivoで網膜層を視覚化します。目の周りの組織を切断し、湾曲した鉗子で眼球の後ろをつかみ、眼窩から目を持ち上げて、動物の目を集めます。

作りたての濾過した4%パラホルムアルデヒドで眼球を1〜4時間インキュベートします。固定剤を取り除き、眼球をPBSで3回、1回の洗浄につき10分間洗浄します。網膜をすぐに解剖するか、摂氏4度のPBSに保存します。

網膜フラットマウントを準備して、血管新生の量と無血管領域またはAVAのサイズを定量化します。マイクロハサミと鉗子を使用して、実体顕微鏡で網膜を解剖します。眼球をPBSに入れて湿らせ、23ゲージの針で輪部に穴を開けてから、湾曲したマイクロハサミで輪部の周りを切り取り、虹彩と角膜を取り除きます。

ハサミの先端をRPEと神経網膜の間に慎重に置き、RPE脈絡膜強膜複合体を視神経に向かって切断します。眼球の反対側にも同じことを行います。次に、網膜カップが露出するまで組織をそっと切断または引き裂きます。

レンズをレチナールカップから引き出し、PBSをカップに加えます。網膜を傷つけることなく、すべての硝子体血管、硝子体、および破片を取り除きます。網膜をまっすぐなマイクロハサミで4回切開し、花のような構造を作ります。

柔らかい絵筆または転写ピペットを使用して、染色のためにウェルプレートに移します。網膜血管系をイソレクチンB4で標識し、内皮細胞の表面を染色します。網膜をブロッキングバッファーで1時間インキュベートし、TBS中の1%NGSおよび0.1%Tritonで10分間洗浄します。

光から保護しながら、5〜10マイクログラム/ミリリットルの蛍光色素結合イソレクチンB4を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、TBS中の1%NGSと0.1%Tritonで網膜を3回、1回の洗浄につき10分間洗浄します。網膜を顕微鏡スライドの内側の網膜を上に向けて置きます。

次に、柔らかい絵筆を使用して網膜を慎重に広げ、残っているヒアロイド血管や破片を取り除きます。サンプルの上に封入剤を追加し、スライドの上にカバースリップを置きます。網膜は光から保護されて摂氏4度で保管してください。

10倍対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して、網膜フラットマウントを画像化します。表在性血管神経叢と網膜前血管新生に焦点を当てます。タイルスキャン画像を作成して網膜全体をキャプチャし、タイルスキャンをマージします。

画像処理プログラムを使用して、AVA、血管新生領域、および総網膜領域を測定することにより、画像を定量化します。フリーハンドの描画ツールを使用してAVAと総網膜領域を描画し、選択ツールを使用して血管新生領域を選択します。マウス酸素誘発網膜症モデルでは、血管閉塞は網膜中心で発生します。

ラットモデルでは、ヒトROPと同様に周辺で発生します。網膜前血管新生は、無血管領域、特にマウスの中央網膜およびラットの末梢付近で発生します。クロスセクションまたはフラットマウントを使用した組織学的解析は、OIR網膜の形態学的変化または目的の細胞タイプ(炎症細胞など)の存在を評価するために行うことができます。

任意選択で、OIRの追跡期間中に非侵襲的なin vivoイメージングを実施することができます。網膜および硝子体の血管系はフルオレセイン血管造影法で視覚化でき、スペクトル領域光干渉断層撮影法を使用して網膜の構造変化を評価できます。機能変化は網膜電図法で測定できます。

可溶性VEGF-Trapであるアフリベルセプトは、OIRの血管新生と生理学的血行再建術の両方を阻害します。高用量のアフリベルセプトをP14に注射したOIR眼は、未治療の眼よりもさらに大きな網膜AVAを示し、アフリベルセプトが低酸素症によって引き起こされる生理学的網膜血行再建術もブロックすることを示唆しています。このプロトコルを試すときは、事前に実験に適した同腹児数を考慮し、酸素チャンバー内の母犬と子犬の健康状態を監視することを忘れないでください。

出生後の体重増加がモデルの結果に影響を与えることを考慮に入れてください。このモデルから得られたレチナールサンプルは、免疫組織化学、遺伝子またはタンパク質発現分析などの分析方法や、潜在的な治療候補がレチナリーに及ぼす影響を分子レベルで測定するために使用できます。