チミジン類似体BrdUを用いたラットの細胞増殖と神経新生を解析するための免疫組織化学技術
2020年9月9日
この論文では、ラットの成体神経新生を測定するためにBrdU陽性細胞を視覚化するための最も一般的な4つの技術を紹介します。この作業には、試薬調製、チミジンアナログ投与、経心灌流、組織調製、ペルオキシダーゼ免疫組織化学反応、免疫蛍光、シグナル増幅、対比染色、顕微鏡イメージング、および細胞分析の指示が含まれます。
これは、成人の神経新生分野における重要なプロトコルです。ここでは、染色を成功させるために必要な手順について詳しく説明します。この技術により、組織の完全性を維持しながら、分裂中の細胞で共発現する特定のタンパク質を同時に同定することが可能になります。
事前に組織の抗体と条件をテストすることをお勧めします。重要なステップは、膜の透過化、慎重なDNA変性、ブロッキングと洗浄のステップの時間テストです。この技術を標準化することは、新しい研究室にとって困難です。
げっ歯類におけるチミジンアナログの試薬調製と投与は、成功した結果にとって重要です チミジンアナログBrdU投与のために、実験ラットを拘束するために下腹部腔を固定し、23ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、新たに調製された50ミリグラム/キログラムのBrdU溶液を動物に腹腔内注射します。適切な実験エンドポイントで、脳を採取し、脳を凍結して、クライオスタットミクロトームを使用して厚さ40 μmの冠切片を取得できるようにし、切片をクライオ保護溶液中の24ウェル細胞培養プレートの個々のウェルに収集順に配置します。すべての切片を採取したら、サンプルをマイナス20°Cで最大数ヶ月間保管します。
BrdU染色を評価するには、ペルオキシダーゼ反応を用いて、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体と併用し、サンプルが室温に達するまでクライオ保護溶液から0.1モルPBSにスライスを移し、洗浄ごとに新鮮な0.1モルPBSで組織を10分間3回すすぎます。最後の洗浄後、切片を内因性ペルオキシダーゼブロッキング溶液中で室温で30分間インキュベートし、続いて0.1モルPBSで10分間3回洗浄します。最後の洗浄後、切片を摂氏37度で20分間インキュベートし、2モルの塩酸で20分間インキュベートし、続いて0.1モルのホウ酸緩衝液で10分間すすぎます。
氷冷した0.1モルのPBSで3回洗浄した後、サンプルを室温で2時間PBS+ブロッキング溶液でインキュベートし、続いてマウス抗BrdU一次抗体をPBS+で4°Cで一晩インキュベートします。0.1モルPBSを3回洗浄した後、適切なマウスビオチン化二次抗体と2〜4時間、室温でPBS+でインキュベートします。洗浄後、切片をABC溶液で室温で1時間処理し、続いて0.1モルPBSを3回洗浄します。
最後の洗浄後、スライスをDAB-ペルオキシダーゼ基質溶液に移し、スライスが濃い灰色になるまで2〜10分間インキュベートします。陽性細胞を可視化できる場合は、15分間の水道水洗浄を3回行い、続いて0.1モルPBS洗浄を3回行い、サンプルをすすぎます。最後の洗浄後柔らかいブラシを使用して、スライスをゼラチン化したスライドに慎重に取り付け、室温で一晩風乾します。
翌朝、恒久的な封入剤を使用して、サンプルにカバースリップを置きます。BrdU陽性細胞を定量するには、まず、顕微鏡で4倍倍を使用して歯状回を同定し、Z軸に沿った顆粒細胞層でBrdU標識核を慎重に検索します。歯状回全体にわたる細胞検索のインターバルセクションを選択した後、すべてのBrdU陽性細胞をカウントします。
標識された核の形態は、細胞が取り込まれたBrdUの量によって変化する可能性があります。Z軸上をゆっくりと移動して、クラスターを統合する動物ごとに少なくとも10個のセクション、およびグループごとに少なくとも5匹の動物からすべての核を定量化します。画像のデコンボリューションの場合は、回折点拡散関数3Dプラグインを開き、必要なデータをすべて入力して、[OK]をクリックしてファイルを保存します。
次に、DeconvolutionLab2プラグインを開き、一致したZスタック画像とPSFファイルを対応するウィンドウスロットにドラッグします。デコンボリューション アルゴリズムと反復回数を選択し、[実行] をクリックします。デコンボリューションされた画像を 1 つの Z スタック画像に結合するには、[画像とスタック] を選択し、[Z プロジェクト] をクリックします。
投影タイプメニューから、[最大強度]を選択します。[OK] をクリックして、ファイルを保存します。RGB画像を作成するには、[画像]と[カラー]を選択し、[チャネルの結合]をクリックして、ドロップダウンメニューから対応する画像を目的のカラーチャネルに設定します。
次に、[複合データを作成]ボックスのチェックを外します。[OK] をクリックして、ファイルを保存します。すべてのチャネル画像が作成されたら、少なくとも 2 つの画像ファイルを開き、画像ファイルごとに異なるカラーチャネルを選択して RBG 画像を作成します。
これらの画像では、BrdU標識細胞を有する代表的な歯状回切片を観察することができます。これらの切片の拡大画像で観察されるように、標識された細胞は強い暗色染色を示しています。余談ですが、身体活動を受けなかった対照ラットと身体活動に曝露された実験グループとの間には、BrdU陽性細胞数に大きな差があり、身体活動が成体の歯状回の細胞増殖を増加させることを実証した他の報告結果と一致しています。
このプロトコールを試みるときは、新たに調製した溶液を使用し、組織を優しく取り扱います。海馬は、海馬を介して治療すると、他のスライドから分離しやすく、見逃される可能性があります。この手順は、DNA合成のDNA標識およびインデックス評価、および細胞増殖の倍加染色研究に適応できます。
この取り組みが科学界に役立ち、免疫組織化学技術の細胞増殖の研究における新たな疑問に答えることを容易にすることを願っています。
概要
本研究では、ラットにおける成体神経新生を測定するための、BrdU陽性細胞の可視化技術に焦点を当てます。本論文では、歯状回における細胞増殖を評価するための、試薬調製、チミジンアナログの投与、組織処理、および顕微鏡イメージングのプロトコルについて詳述します。
研究の主要構成要素
研究分野
- 成体脳神経発生
- 細胞増殖
- 免疫組織化学
背景
- 分裂細胞のヘミ接合体標識は、神経新生を理解する上で重要である。
- 身体活動は、歯状回におけるBrdU陽性細胞数に影響を及ぼす。
- 染色技術の標準化は、新しい研究室にとって課題となる。
使用された手法
- 細胞標識のためのBrdUの腹腔内投与
- 標準的な免疫組織化学プロトコル
- 画像解析および定量のための顕微鏡観察
主な結果
- このプロトコルは、脳組織におけるBrdU陽性細胞を効果的に同定します。
- 対照群と実験群の間で、細胞増殖に有意な差が認められました。
- 記述された手法は、さまざまな細胞研究に適応させることが可能です。
結論
- 本研究は、成体神経新生を評価するための信頼性の高い手法を提供します。
- 結果は、神経新生を促進する上での身体活動の重要性を強調しています。
よくある質問
業界における重要性
細胞増殖と神経新生の正確な定量化は、CNS創薬におけるターゲット検証に不可欠であり、機序的なリスク低減は再生能力の再現性のあるバイオマーカーに基づいています。標準化されたBrdU免疫組織化学染色は、組織学的な定量的リードアウトを提供することで、前臨床モデルにおける予測の信頼性を高め、初期創薬段階でのgo/no-go判断を支援します。この手法は、機能的なターゲットエンゲージメントを海馬の神経新生における測定可能な変化に結びつけることで、ポートフォリオ選別の重要な転換点に対応します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：神経原性経路に関連する治療仮説の検証および、疾患関連システムにおける機能的ターゲットの妥当性確認を可能にする。
- 運用上の価値：分裂細胞の直接的な可視化を通じて生物学的なリスク低減をサポートし、ターゲットエンゲージメント研究におけるメカニズムの曖昧さを軽減する。
- 予測的価値：前駆細胞活性に関する定量的なデータを生成し、ポートフォリオの優先順位付けおよびリード化合物特定戦略に情報を与える。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況：ハイコンテンツイメージングおよび自動細胞計数ワークフローに適した、標準化され再現性のある組織切片を作製します。
- 定量的な出力：測定可能なBrdU陽性細胞数を提供し、増殖経路における用量反応解析および化合物スクリーニングを可能にします。
- プラットフォームの再利用：一貫したターゲットバリデーションキャンペーンに向けて、さまざまな齧歯類モデルに適用可能な転用可能な組織学プラットフォームを確立します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：げっ歯類歯状回におけるメカニズム的な知見を、認知障害や気分障害に関連するヒトの神経新生経路へと結びつけます。
- トランスレーショナルな連続性：保存された増殖バイオマーカーを通じて、探索段階の標的変調と前臨床での有効性評価を橋渡しします。
- リスク調整済み進展：標的を介した神経新生の変化と行動モデルにおける機能的アウトカムを相関させることで、go/no-go判断の根拠を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、標的仮説の検証からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに統合され、リード候補化合物への多大な投資を行う前に、メカニズム上のリスク低減を裏付ける組織学的なバリデーションを提供します。
- 探索生物学：増殖ニッチにおけるBrdUと細胞型特異的マーカーの共検出を可能にし、パスウェイの解明とターゲットバリデーションを促進します。
- スクリーニング：再現性の高い定量的な免疫組織化学的アウトプットを提供し、スクリーニングキャンペーン全体でのアッセイ標準化を支援します。
- 分析：標準化された細胞数および形態計測データを生成し、実験条件や治療効果の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：齧歯類からヒトの病態生理へ変換可能な、保存された神経新生リードアウトを確立することで、バイオマーカーの整合性をサポートします。
- エンタープライズでの再利用：一貫したターゲットバリデーションのために、施設やプロジェクト間で標準化可能な、再利用可能な組織学プラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 神経新生領域における細胞増殖を直接かつ定量的に測定することにより、ターゲットバリデーションに対する予測の信頼性を提供する。
- 運用的価値： 詳細な組織処理、抗原賦活化、および検出ステップを通じて、アッセイの再現性と標準化を確保する。
- 戦略的価値： 神経新生ターゲットの早期リスク低減を可能にし、後続ステージにおける失敗率を低下させることで、資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： ターゲットの変調を海馬神経新生の測定可能な変化に結びつけることで、リスク調整後の優先順位付けをサポートする。
実施上の検討事項
- 組織処理および抗原検出を成功させるには、組織学、免疫組織化学、および顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- 切片作成および定量化のためには、クリオスタットミクロトーム、蛍光顕微鏡、および画像解析ソフトウェアへの確実なアクセスに依存します。
- ユーザー間での再現性を確保するために、抗体のバリデーション、ブロッキング条件、およびDNA変性の標準化されたプロトコルが必要です。
- 異なる組織型や固定法に適用する場合、インキュベーション時間および抗原賦活化ステップの調整が必要です。
- 切片作成およびマウント時の組織の脆弱性に制限があるため、海馬の完全性を維持するための慎重な取り扱いが必要です。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Thymidine Analog (5‐Bromo‐2'‐Deoxyuridine) BrdU Administration and Tissue Preparation
2:02
BrdU Detection
4:40
Cell Quantification
5:33
Image Deconvolution
6:59
Results: BrdU‐Labeled Cell Identification and Quantification in Representative DG Tissue Section
7:46
Conclusion
