マウス網膜色素上皮の光誘発電気応答を記録するための直接結合電解電解(DC-ERG)

DC-ERG技術は、網膜色素上皮機能の非回避評価に使用して、加齢に伴う変化や疾患の進行を監視し、薬理学的介入効果を評価することができる。この技術は、キャピラリー電極の調製を簡素化することにより、DC-ERGの再生能力と使いやすさを向上させます。また、分析を容易にするために標準オームソフトウェアアプリケーションで補完することができます。

まず、25ゲージの注射針をシリコンゴムガスケットを通して電極ホルダーの背面壁まで慎重にスライドさせることから始めます。電極ホルダーのベースに脱気したHBSSを充填し、ゆっくりと針を引っ込めながら、気泡を導入しないように気をつけ、締め付けることなくネジキャップを交換します。HBSSでギャップ内の空きスペースを埋めるために注射針を再挿入し、他の端から溶液が逃げるのを防ぐために充填しながら、キャピラリーを水平に保持します。

曲がった端で充填されたキャピラリーをつかみ、緩んだキャップを通してもう一方の端をゆっくりと挿入し、スクリューキャップを所定の位置に締めます。毛細血管電極を上に向けて電極ホルダーを傾けて、気泡が流出し、真空チャンバー内の毛細血管を5~10分間脱気できるようにします。次に、真空をゆっくりと放出し、実演したように電極ホルダとガラスキャピラリーを補充する。

マイクロ電極ホルダーのカスタムスタンドを作るためには、8本のTクリップの片側から黒いポリアセタールクリップを取り外し、磁気ボールジョイントを半分に加工したシリンダーベースを使用して高さを調整します。M3サイズのナットで磁気ボール取り付けネジに修正されたTクリップを固定し、綿先端のクリーニングスティックから修正された約1インチのテーパード木製ハンドルのスライドをスタンドに角度で固定し、マイクロ電極ホルダーをカスタムメイドのTクリップ磁気ボールジョイントスタンドに固定します。次に、希土類磁石シリンダーベースを使用して、カスタマイズされた電極ホルダーをステージの金属板にしっかりと配置し、180度軸上で360度回転を可能にします。

電極試験を行うために、まず、完全に組み立てられたHBSS充填された毛細管マイクロ電極をHBSSの小さな容器にそっと下げる。針挽き電極と銀の塩化銀中心ペレット参照電極を同じHBSSに入れて回路を完成させ、検査するマウスを記述する適切な識別子を選択または作成します。実行する直接結合された電気レティノグラムプロトコルを選択するには、プロトコルをクリックしてDC-ERGを選択します。

[実行] をクリックします。ダイアログ ボックスが表示され、患者の情報が表示されます。情報が正しい場合は、[はい] をクリックして、手順 6 の 1 に進みます。

ファラデーケージのドアを閉め、インピーダンスをクリックしてインピーダンスモードを表示します。口参照、テールグラウンド、および記録電極の値が許容可能であることを確認し、ステップをクリックしてステップ4/6に進み、ベースラインの安定性をテストします。トレースの表示を開始するには、[プレビュー] をクリックします。

トレースは、ピークからピークへの振幅が 200 マイクロボルト未満の低ノイズである必要があります。実験のためにマウスと電極を位置づけるために、鎮静したマウスの角膜を5%プロパラカイン塩酸の低下で麻酔してから、角膜を2.5%フェニレフリンHCLおよび5%トロピックアミドの低下で拡張する。ERG システム ソフトウェアで、正しい患者が選択されていることを確認します。

プロトコルをクリックします。[プロトコルの説明] で、[DC-ERG] を選択し、[実行] をクリックします。[はい] をクリックして、正しいテストが実行されていることを確認します。

ドーム内の薄暗い赤色光を点灯し、加熱された記録テーブルの上にマウスを置くために6のステップ1を使用してください。鉗子を使用して、後ろ脚の皮膚を慎重にテントに入れる。片手で針の電極をしっかりと保持し、もう一方の手を使用して電極を後部脚に皮下に挿入して電極を所定の位置に固定します。

中央のペレットが後頬に沿って置かれ、歯の後ろに所定の位置に保持されるように、動物の口に参照銀、塩化銀電極を置きます。毛細管電極を目の上に置く前に、電極ホルダーをガラスの毛細血管を垂直に向けて配置し、電極ホルダーを人差し指でフリックして、導入された気泡を取り除きます。25ゲージの針を使用して毛細血管の先端をHBSSで満たし、毛細血管を検査して、先端に気泡が閉じ込められないようにします。

HBSS充填キャピラリーの開いた先端が角膜に優しく接触するように電極ホルダーを置きます。気泡を導入しないように注意して、初期の滴を捨てる潤滑剤の目ゲルディスペンサーを反転します。次に、各目に潤滑剤の目のゲルを滴下して導電性を維持し、記録中の乾燥を防ぎます。

DC-ERG を記録するには、ステップをクリックして 6 つのステップ 5 を選択し、インピーダンスをクリックしてインピーダンス チェック画面を使用して左右の目の抵抗を調べます。各目の記録電極のインピーダンス値は類似している必要があります。また、接地電極と基準電極の両方のインピーダンス値は10キロ未満でなければなりません。

[プレビュー] をクリックして、左右の目のトレースを表示し、安定したベースラインが達成されるまで最大 10 分待ちます。次に、[stop] をクリックしてトレース プレビューを終了し、[実行] をクリックして記録を開始します。ここでは、条件付きノックアウトおよび野生型マウスからのサンプルデータセットを示します。

この分析では、微量は電極内の微小気泡に苦しんだ。これは、トレース内のピークからピークへのノイズを増加させます。別の分析では、電極ホルダースタンド内の微小電極を組み立てる前に、真空チャンバを使用して気泡を除去した。

初期25秒までの最適フィットラインを計算することで、ドリフト補正応答を再描画し、DC-ERG成分の振幅を特定することができます。予想通り、RPEにおける硬化7.1カリウムチャネルの発現低下は、c波および速発振を大きく減衰させ、網膜色素上皮上皮の電気的特性の著しい障害を示す。ここで、DC-ERG成分の相対振幅を、野生型に正規化し、相対2つの最大光誘発波振幅に対してプロットした、図示されている。

この形式の分析は、RPEの電気応答の低下を、光受容体活性の低下単独で考慮することができるかどうかを決定することができる。または、RPE に起因する根本的な欠陥がある場合。マウス記録に移る前に安定したベースラインを達成し、導入された気泡がないか定期的に電極を再検査することを忘れないでください。

暗く適合したERGは、DC-ERGより前に記録して、コーン駆動のレチナル機能を測定することができます。光適合性ERGは、DC-ERGの後にコーン駆動のレチナル応答を評価するためにも行うことができる。