Name: 静脈奇形に対する患者由来異種移植片モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶ静脈奇形の患者由来異種移植片モデル作成法。TIE2またはPIK3CA変異を持つ内皮細胞を用いてマウスに皮下注入し、病態組織学的特徴を再現する迅速かつ信頼性の高いin vivoシステムを構築します。

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著者らは、ノラ湖の校正に感謝したいと考えています。この原稿で報告された研究は、国立衛生研究所の一部である賞番号R01 HL117952(E.B.)の下で、国立心臓、肺、血液研究所によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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</ol>

著者らは開示する利益相反を持っていません。

ここでは、VMの患者由来異種移植片モデルを生成する方法について説明する。このマウスモデルは、研究者が病理学的ルーメンの拡大をより深く理解することを可能にする優れたシステムを提示し、VMの治療のためのより効果的で標的療法の開発に役立ちます。これは、毛細血管リンパ性静脈奇形16のような他のタイプの血管異常を調査するために容易に適応することができる。再現性のある血管病変の生成を成功させるために重要ないくつかのステップがあります。まず、患者由来の内皮細胞は純粋で(他の細胞タイプの存在を除く)、かつ注射時に指数関数的に増殖する必要がある。汚染線維芽細胞または他の間葉非ECは、細長い形態によって容易に認識することができる。まれに、抗CD31抗体を結合した磁気ビーズを用いて精製した後でも、培養中に非ECの数が少ない場合があります。これらの培養は、内皮特異的細胞表面マーカーを用いてさらに精製を必要とする。別のアプローチとして、内皮細胞の単一細胞クローン拡張が可能である。これは、1つの培養物内のすべての細胞が1つの単一の細胞から派生するので、変異ECの均質性を再確認するであろう。しかし、細胞は増殖能力を上回...

血管系の発達における欠陥は静脈奇形(VM)を含む多くの疾患の根本的な原因である。VMは、静脈の異常な形態形成および拡張を特徴とする先天性疾患である。VM組織および内皮細胞(EC)に関する重要な研究は、チロシンキナーゼ受容体TIE2をコードするTEKとPIK3CAの2つの遺伝子における機能獲得変異を同定2,3,4,した。これらの体細胞変異は、PI3K/AKTを含む主要な血管新生/増殖シグナル伝達経路のリガンド非依存性ハイパー活性化をもたらし、それによって拡張された拡張静脈3をもたらす。これらの重要な遺伝的発見にもかかわらず、異常な血管新生を引き起こすその後の細胞および分子メカニズムと拡大した血管チャネルの形成はまだ完全には理解されていない。
正常および病理学的血管新生の間に、既存の血管ネットワークおよびECから新しい血管が芽生える、増殖、移動、細胞外マトリックス(ECM)リモデリングおよび管腔形成6を含む重要な細胞プロセスの配列を受ける。ECの2次元および3次元(2D/3D)インビトロ培養は、これらの細胞特性を個別に調査するための重要なツールです。それにもかかわらず、宿主微小環境内で病理学的血管の拡大を再現するマウスモデルの需要は明確であり、翻訳研究のための標的薬の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。
最新の状態では、TIE2機能獲得変異に関連するVMのトランスジェニックマウスモデルは報告されていない。現在のトランスジェニックVMマウスモデルは、活性化変異PIK3CA p.H1047R p.H1047R33,55のユビキタスまたは組織制限発現に依存する。これらのトランスジェニック動物は、このホットスポットPIK3CA突然変異の全身または組織特異的な効果に関する重要な洞察を提供する。これらのモデルの限界は、初期致死をもたらす病理学的血管ネットワークの形成である。したがって、これらのマウスモデルは、突然変異事象の散発的な発生およびVM病理の局在的性質を完全に反映していない。
反対に、患者由来の異種移植片モデルは、患者由来の病理組織または細胞を免疫不全マウス7に移植または注入することに基づいている。異種移植片モデルは、疾患の発症と新しい治療薬8の発見に関する知識を広げるための強力なツールです。さらに、患者由来の細胞を使用すると、科学者は突然変異異質性を再現して患者の異型のスペクトルを研究することができます。
ここでは、アチミックヌードマウスの後ろに、TIE2および/またはPIK3CAの変異体を構成的に活性な形態を発現する患者由来VM ECを皮下に注入するプロトコルについて説明する。注入された血管細胞は、以前の血管異種移植片モデル9、10、1110に記載されているように血管新生9を促進するためにECMフレームワークに懸濁される。,11これらのVM ECは、重要な形態形成を受け、支持細胞の不在時に肥大した、浸透した病理学的血管を生成する。VMの記載された異種移植片モデルは、制御不能な内腔の膨張を阻害する能力に対する標的薬物の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。

<table><tbody><tr><td>無痛性ヌードマウス、(Foxn1-nu); 5-6週、雄</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1065</td><td>Histological anlaysis</td></tr><tr><td>Bottle top filter (500 ml; 0.2 &micro;M)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>974106</td><td>細胞培養</td></tr>ウ<tr><td>シ血清アルブミン(BSA)</td><td>BSA</td><td>A7906-50MG</td><td>細胞培養;組織学的分析</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2.2H2O)</td><td>シグマ</td><td>C7902-500G</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>キャリパー</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>50996491</td><td>病変プラグ測定</td></tr><tr><td>CD31-共役磁気ビーズ (Dynabeads)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11155D</td><td>EC 分離</td></tr><tr><td>セルストレーナー (100 &mu;M)</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Conical Tube; polypropylene (15 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 241</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Conical Tube; polypropylene (50 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 239</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Coplin staining jar</td><td>Ted Pella</td><td>21029</td><td>Histological anlaysis</td></tr><tr><td>カバーガラス (50 X 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545E</td><td>Histological anlaysis</td></tr><tr><td>DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td>Histological anlaysis</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-027-CV</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>EC separation</td></tr><tr><td>耳パンチ</td><td>VWR</td><td>10806-286</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地-2 (EGM2) Bulletkit (基礎培地およびサプリメント)</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Eosin Y (アルコールベース)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>71211</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコンラボ</td><td>2716</td><td>組織学的anlaysis</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)、HyClone</td><td>GEヘルスケア</td><td>SH30910.03</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>フィルターチップ1,250 &mu;L</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td><td>マルチステップ</td></tr><tr><td>フィルターチップ 20 &mu;L</td><td>VWR</td><td>10017-064</td><td>マルチステップ</td></tr><tr><td>フィルターチップ 200 &mu;L</td><td>VWR</td><td>10017-068</td><td>マルチステップ</td></tr><tr><td>ホルマリン緩衝液 (10%)</td><td>Sigma</td><td>F04586</td><td>病変プラグ解剖</td></tr><tr><td>血球計算計 (INCYTO;使い捨て)</td><td>SKCフィルム</td><td>DHCN015</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>ベクター ヘマトキシリン</td><td>H-3401</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>ヒト血漿フィブロネクチン精製タンパク質(1mg / mL)</td><td>シグマ</td><td>FC010-10MG</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>過酸化水素溶液(30%w / w)</td><td>シグマ</td><td>H1009</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td></td><td></td><td>分析</td></tr><tr><td>イソフルラン、USP</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-106-01</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物 (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>基底膜マトリックス (フェノールレッドフリー;LDEVフリー)</td><td>コーニング</td><td>356237</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ(1.5mL)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>EC分離</td></tr><tr><td>顕微鏡スライドスーパーフロスト(75mm x 25mm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1255015-CS</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>針、26G x 5/8インチサブQ滅菌針</td>ベ<td>クトンディキンソン(BD)</td><td>BD305115</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>正常馬</td>血清 <td>Vector Laboratories</td><td>S-2000</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン (100X)</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>永久封入培地 (VectaMount)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>乳棒 サイズ C、プレーン</td><td>トーマス サイエンティフィ</td>ック <td>3431F55</td><td>EC</td></tr><tr><td>分離 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP3994</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>スケール</td><td>VWR65500-202</td><td></td>皮<td>下注射</td></tr><tr><td>血清ピペット(10ml)</td><td>VWR89130-898</td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>血清ピペット(5ml)</td><td>VWR89130-896</td><td></td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム(Na2CO3)</td><td>シグマ</td><td>223530</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、濃縮物、IHC</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5004</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>シリンジ(60ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>Cel培養</td></tr><tr><td>シリンジフィルター(0.2 &micro;M)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>シリンジ(1 mL、ルアーロック付き)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD-309628</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>組織培養処理プレート(100 X 20 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>細胞</td></tr><tr><td>培養組織培養処理プレート(145X20 mm)</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td>細胞</td></tr><tr><td>培養組織培養処理プレート(60 X 15)mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>トリスベース (Trizma base)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4 %)</td> <td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>トリプシン EDTA, 1X (0.05% トリプシン/0.53mM EDTA)</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Biorad</td><td>170-6531</td><td>組織学的分析</td></tr><tr><td>ウィートンのびん</td><td>VWR</td><td>16159-798</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャー科学</td><td>X3P-1GAL</td><td>の組織学的なanlaysis</td></tr></tbody></table>

静脈奇形に対する患者由来異種移植片モデル

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

静脈奇形(VM)は、拡張され、しばしば機能不全の静脈をもたらす静脈ネットワークの発達障害から生じる血管異常である。本稿の目的は、ヒトVMを模倣し、患者の異質性を反映することができるマウス異種移植片モデルの確立を慎重に説明することである。内皮細胞(EC)における非遺伝性(体性 )TEK(TIE2) および PIK3CA 突然変異を超活性化することは、VMにおける病理学的血管拡大の主な要因として同定されている。以下のプロトコルは、変異体TIE2および/またはPIK3CAを発現する患者由来ECの分離、精製および拡張について説明する。これらのECは、免疫不全性の高胸腺マウスの後部に皮下に注入され、神経血管チャネルを生成する。TIE2またはPIK3CA変異株ECで発生した病変は、VM患者組織の注射および再構成の7\u20129日以内に目に見えて血管化される。このVM異種移植モデルは、VMの形成と拡張を推進する細胞および分子メカニズムを調査するための信頼性の高いプラットフォームを提供します。また、このモデルは、ヒトVMに見られる異常な血管拡大を防止する新規薬剤候補の有効性をテストする翻訳研究に役立つ。

本プロトコルは、免疫不全ヌードマウスの後部への患者由来ECの皮下注射に基づいてVMのマウス異種移植片モデルを生成するプロセスを説明する。内皮細胞コロニーは、VM組織または病変血液から最初の細胞分離後4週間以内に収穫することができる(図1A、B)。注射の翌日、異種移植病変プラグは約80\u2012100 mm2の表面積をカバーする。私たちの手の中では、TIE2/PIK3CA変異ECを有する病変プラグは、注射14、15から7\u20129日以内に目に見えて血管化され、15浸透している(図1C-E)。しかしながら、病変の成長の程度は可変であり、患者およびサンプルの不均一性を反映する。
病変プラグは、ヒトVM組織の組織病理学的特徴を密接に再現する:内皮細胞の薄い層によって並ぶ拡大された血管チャネル(<strong class=...

静脈奇形のマウス異種移植片モデルを生成するための詳細なプロトコルを提示する。このモデルは、超活性化TIE2および/またはPIK3CA遺伝子変異を含む患者由来内皮細胞の皮下注射に基づいている。異種移植病変はVM患者組織の組織病理学的特徴を密接に再現する。

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

このプロトコルは、静脈奇形の組織病理学を再現する患者由来の異種移植片を作成するために使用することができる。これはさらに、私たちの前臨床治療試験を運ぶことが許されました。この技術は患者直接内皮細胞の成長および実験療法への応答の毎日の監視を可能にする速く、信頼できるNVivoシステムを提供する。この方法は、他のタイプの血管またはリンパ管異常を調査するために容易に適応することができる。まず、細胞懸濁液を注射用に準備します。5ミリリットルのプレ温め 0.05%のトリプイン-EDTAを摂氏37度で2分間トリプシンします。トリップインを中和し、EGMの5ミリリットルを追加し、150ミリリットルの円錐管に細胞を収集します。遠心分離機を5分間Gの400倍にし、上清を吸引し、細胞を3ミリリットルのEGMで再懸濁する。ヘモサイトメーターで細胞を数えます。望ましい細胞数を持つ体積を新しい50ミリリットルの円錐形チューブにベンチャーし、遠心分離によって細胞を再びペレットにします。上清を吸引し、小容量を残して細胞ペレットを緩める。細胞ペレットを1回の注射につきBMEMの220マイクロリットルで再懸濁する。泡を作らないように氷の上に細胞懸濁液を十分に混ぜます。BMEM細胞培養物を吸引し、プランジャーを引っ張って1ミリリットルのシリンジ開口部に混ぜる。26ゲージの無菌針を注射器にロックし、注射前に準備した注射器を氷の上に平らに保ちます。マウスが適切に麻酔をしていることを確認した後、その胃の上に置き、70%エタノールで注射領域を消毒します。準備したシリンジをそっとロールし、落ち着いた細胞を再中断します。フレークは、注射器の端に気泡し、細胞懸濁液の少量を排出します。注射部位で皮膚をつまんで、構造のようなテントを作ります。その後、皮膚のすぐ下に針を挿入し、針が筋肉組織への注入を防ぐためにピンチ皮膚を放出することによって皮膚の深さだけであることを確認します。針を保持し、慎重に慎重に細胞懸濁液の200マイクロリットルを注入し、小さな球状の塊を作成します。細胞の懸濁液を筋肉に注入しないように注意してください。キャリパーで各プラグの長さと幅を測定します。解剖された異種移植片プラグを定規の横のまな板の上に合わせ、画像を撮って病変の総血管を記録します。その後、室温で一晩10%ホルマリンに浸してプラグを固定します。解剖後、病変プラグは組織学的分析のために処理され、UEA-1がプラグ内のヒト由来の内皮細胞を検出するために染色される。重なりを避けるために、病変部内のX面パターンで20 X倍率で明視野顕微鏡で病変部あたり5つのHPF画像を取る。撮影した画像にスケールバーを必ず含めます。画像のHPF画像を開き、スケールバーのピクセルを調整J.To、直線ツールを使用してスケールバーを通過します。次に、[分析]と[スケールを設定]をクリックして、測定されたピクセルをミリメートルに変換します。次に、[セットの計測値を解析]をクリックし、領域を選択してオーバーレイに追加します。分析を使用してHPFの合計フィールド面積を測定し、定量のためにこの測定を保存します。フリーハンド選択ツールを使用して、UEA-1陽性血管チャネルを手動で概説します。[解析と測定] をクリックして、アウトライン領域を数値化します。HPF内のすべての血管チャネルを測定します。各セクション内で取得した 5 つの HPF に対してこのプロセスを繰り返し、さらに分析するために値を Excel に転送します。次に、原稿の方向に従って血管面積と血管密度の割合を計算します。このプロトコルを使用して、TIE2またはPIK3CAの多動性変異体内皮細胞を有する病変プラグは、注射後7〜9日以内に目に見えて血管化され、浸透する。病変プラグは、ヒトVM組織の組織病理学的特徴と、内皮細胞の薄い層によって整列された大きな血管チャネルが見えるのをよく似ている。これらの血管構造は、典型的には、宿主マウス血管系を用いて機能的吻合を確認する赤血球を含む。UEA-1ヒト特異的レクチンを用いた免疫構造染色は、血管領域を裏打ちする細胞がマウス血管構造ではなくヒト移植細胞に由来することを確認する。この手順に従って、増殖またはアポトーシスのマーカーに対する病変セクションの追加染色を行い、実験的治療の特定の効果を分析することができる。このセノミックモデルは、VM患者に対するいくつかの臨床試験で有効性を示しているmTOR阻害剤ラパマイシンのような静脈奇形の新しい治療法の前臨床試験に使用されています。

a-patient-derived-xenograft-model-for-venous-malformation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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細胞および分子新組織形成の我々の知識を向上させるために、TEVGのマウスモデルは、最近開発されました。グラフトは、C57BL / 6マウスにおける大動脈大静脈介在移植片として移植した。このモデルは、私たちの臨床研究で達成されるものと同様の結果を達成するが、はるかに短縮され、時間経過とともに。...

マウスモデルにおける下大静脈介在移植の移植

我々は、単離され、十分に特徴付けられた環境で、in vivoで血管新生を分析するためのモデルとして動静脈（AV）ループの生成のための顕微的なアプローチを説明します。このモデルだけでなく、血管新生の研究のために有用であるだけでなく、最適なエンジニアリングを軸方向に血管および移植組織に適しています。...

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

このビデオは、ラットの静脈介在手術後の筋内膜過形成の発症を研究するモデルを示しています。...

静脈介在モデル：バイパスグラフト開存を研究するための適切なモデル

患者由来異種移植片(PDX)は、黒色腫の分子および生物学的特徴をより強固に要約し、従来のプラスチック組織培養ベースのアッセイと比較して治療応答のより予測的である。ここでは、新しいPDXモデルの確立と既存のPDXモデルの特性/実験のための標準的な動作プロトコルについて説明します。...

黒色腫患者由来異種移植片モデル

大器内膜瘻は、両方の壁を通して下の静脈カバに尿の赤外線大腸を穿刺することによって作成され、その後、劣った静脈カバの部分的なライゲーションを介してその流出における狭窄の作成が行われた。この再現可能なモデルは、中央静脈狭窄症の研究に使用することができる。...

流出狭窄を伴う大軌道瘻を用した中枢静脈狭窄のマウスモデル

本プロトコルは、静脈移植片を用いた血管形成手術後の静脈内膜過形成を減衰させる戦略を開発するための動脈血圧に静脈を与えることによって、静脈内膜過形成を実験的に作り出すことを目的とする。...

静脈移植を用いた血管形成術を模したウサギ静脈間位置モデルによる動脈血圧下の内膜過形成の評価

このプロトコルでは、新規豚静脈バイパス移植は、心肺バイパスなしで左胸壁の小さな切開を通して行われました。術後病理検査を行い,内膜肥厚を認めた.

ブタ静脈移植病モデルの確立と評価

学ぶ静脈奇形の患者由来異種移植片モデル作成法。TIE2またはPIK3CA変異を持つ内皮細胞を用いてマウスに皮下注入し、病態組織学的特徴を再現する迅速かつ信頼性の高いin vivoシステムを構築します。

静脈奇形に対する患者由来異種移植片モデル

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