微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング

このプロトコルにより、無傷またはソフトなラボミクロンの解像度の非破壊イメージングが可能になります。動物の生理学、解剖学、および発生のメカニズムを理解するために使用できます。ハエは組織解剖を必要とせずに無傷の状態で画像化されるため、組織や臓器の空間構造は本来の状態に保たれ、観察が容易です。

マイクロCTは、ハエのヒト疾患のモデル化を目的とした研究や、生活の質に影響を与える発達障害の理解に理想的なツールです。また、工学、物理学、材料科学、地質学、人類学などの他の分野でも役立つことが証明されています。イメージングの対象となる発生時点を選択した後、5〜20匹の動物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内の1ミリリットルのPBSTに移し、チューブを室温で5分間インキュベートし、定期的なタッピングで疎水性コーティングの除去を支援し、動物を完全に沈めるようにします。

インキュベーションの終わりに、PBSTを1ミリリットルのBouin溶液と交換し、チューブを軽くたたいてハエを完全に沈めます。幼虫および蛹のサンプルについては、室温で2時間のインキュベーション後、動物を5分間3回洗浄し、1回の洗浄につき1ミリリットルの新鮮なPBSを洗浄します。最後の洗浄後、サンプルを解剖顕微鏡でウェルごとに新鮮なPBSを含むマルチウェル解剖皿に移し、ホルダーに取り付けられた小さな細いピンを使用して、下にある軟組織を破壊しないように注意しながら、各サンプルの前後のキューティクルに穴を開けます。

キューティクルに浸透した後、サンプルを新しい1.5ミリリットルチューブ内の1ミリリットルの新鮮なブイン溶液で室温で24時間インキュベートしてから、サンプルを30分間3回洗浄し、1回の洗浄につき1ミリリットルのマイクロCT洗浄バッファー1ミリリットルを洗浄します。最後の洗浄後、1ミリリットルの適切な染色溶液をチューブに加え、サンプルを室温で2〜7日間インキュベートします。より長い画像保存が必要な場合は、示されているように、1ミリリットルのエタノールで上昇エタノールシリーズ内のサンプルを脱水し、臨界点乾燥のためにサンプルを準備します。

臨界点乾燥サンプルをマウントするには、サンプルをプラスチックまたはガラスのキャピラリーチューブに入れてから、チューブを回転ステージホルダーに取り付けます。水和サンプルを埋込する場合は、P10ピペットチップに水を入れ、狭い方の端をパラフィンフィルムで固定します。鉗子を使用して1つの検体をピペットチップに移し、細長い物体を使用して、サンプルがチップの壁にちょうど接触するまで試料を慎重にチップに押し下げてサンプルを所定の位置に保持します。

ピペットの開放端を覆った後、P10ピペットを回転ステージのチョック内に収まるように設計されたホルダーに取り付けます。スキャンするには、スキャナーソフトウェアのオープンドアアイコンをクリックして回転ステージチョックにアクセスし、サンプルホルダーのベース周りのカラーを締めてサンプルを取り付けます。ソフトウェアでスキャンパラメータを設定して最適な解像度とコントラストを確保し、[オプション]と[X線源]をクリックしてX線源の電力制御を開きます。

スライダーバーを使用して、X線電圧を30〜40キロボルトに、電流を100〜110マイクロアンペアに設定して、3〜4ワットの電力と小さなスポットサイズのX線ビームを生成します。スキャン中に取得する投影画像の数を設定するには、[オプション]と[取得モード]を選択してカメラの露出時間を500〜800ミリ秒に設定し、スライダーバーを使用してカメラの設定と位置に応じて目的の画像ピクセルサイズを設定します。スライダーバーをクリックしてドラッグすると、サンプルが視野内に保たれたまま、サンプルが360度の回転パスに沿って移動します。

「取得開始」アイコンをクリックします。ダイアログボックスが表示され、追加のスキャンパラメータを設定できます。スキャンを保存するファイルと出力フォルダに名前を付けます。

ランダム移動を 10 に設定し、平均を 4 から 6 フレームに設定します。回転ステップは、使用するカメラの設定に応じて自動的に計算され、[OK]をクリックして取得を開始します。スキャン時間を示すプログレスバーのダイアログボックスが表示され、スキャナーは回転経路に沿った試料の一連の投影画像の取得を開始します。

断層撮影を生成するには、再構成ソフトウェアで投影画像を開き、シフト補正アルゴリズムを選択して初期画像アライメントを実行します。投影画像を適切に位置合わせする最適な値を選択し、[微調整] をクリックして各再構成パラメーターを微調整します。一連のプレビューが生成され、それを使用して正しい値を選択できます。

[設定]タブに最適なパラメータ値が表示されていることを確認し、[出力]タブでビット深度、ファイル名、データを保存するフォルダなどのファイルパラメータを調整します。対象領域は、対象構造のみを再構築するために使用できます。複数の再構築が必要な場合は、[開始] と [バッチに追加] をクリックして現在のイメージをバッチ マネージャーに追加し、残りのイメージに対して再構築を繰り返します。

再構成された画像の形態測定解析を行うには、適切な形態解析ソフトウェアプログラムの「セグメント」タブで、「基本」および「新規」をクリックし、画像に新しい名前を付けて、適切な色を選択します。[範囲の定義] チェックボックスをオンにしてスライダーを調整し、対象の構造を囲む閾値範囲を調整します。しきい値で定義された領域をペイントするには、Control キーを押したままマウスの左キーを押したままにします。

領域を削除するには、Shift キーを押しながらマウスの左キーを押したままにします。関心領域のメッシュの測定値が、基本的な形態計測解析の情報パネルに表示されていることを確認します。メッシュオブジェクトとトモグラム画像全体をレンダリングし、結果の画像を3Dで視覚化し、右クリックして[ムービーメーカーを表示]を選択し、ビューアの個々のフレームを使用してオブジェクトのビデオを生成します。

これらの画像では、胚、第3幼虫、受精成体期の蛹、およびヨウ素で染色され、市販のベンチトップスキャナーを使用して水中で画像化された成虫の雌のハエを観察できます。デリケートな組織の優れた保存と均一な染色が明らかであり、すべての主要な臓器を容易に識別することができます。ここでは、低速投影スキャンモードと高速投影スキャンモードの両方で取得した同じ成虫のフライヘッドケースの比較を示します。

重要なことは、低速画像の解像度は高くなりますが、形態測定分析は低速スキャンと高速スキャンで変わらないことです。レンダリングソフトウェアを使用すると、関心のある組織や臓器のシステムをセグメント化し、形態解析や3Dビジュアライゼーションに使用できます。これらの画像では、リンタングステン酸で染色したハエ腹部を水和させた状態で、またはX線顕微鏡で臨界点乾燥させた状態で画像化することができます。

リンタングステン酸を使用すると、精巣内の中腸の個々の上皮細胞と精子束を容易に分解できます。臨界点乾燥画像は、水和したサンプルと比較してわずかに高い解像度を示していますが、甘皮近くの脂肪細胞などの水和したサンプルでは、デリケートな組織の超微細構造のより良い保存が達成されます。最高の分解能を得るには、サンプルの動きと過剰な振動を制限します。

これには、サンプルをステージに固定することが重要ですが、これを達成するためには創造性と機知が必要になる場合があります。光学顕微鏡や電子顕微鏡などの追加のイメージング法をイメージングワークフローの一部として使用して、ナノスケールから生物全体までの特定の遺伝子変異を理解することができます。