Name: 出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶ出生後の筋線維単離法。Lamin Δ8-11変異マウスから脆弱な筋線維を分離し、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーの筋肉幹細胞動態と再生メカニズムを解明する。

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私たちは、アンドレア・ビアンキ、イタリアのラミノパシーネットワーク、および研究室のメンバーに、サポートとすべての建設的なコメントに感謝します。私たちは、共焦点顕微鏡で貴重な助けをしてくれたキアラ・コルディグリエリに感謝しています。著者らはベアトリス・ビフェラリ博士の助けを借りてフィギュアの写真を撮ってくれたことに感謝している。ここで紹介した作品は、私の最初のAIRCグラントnによってサポートされました。 18535年、AFMテレソンn.21030、イタリアの保健大臣n.GR-2013-02355413とカリプロ2017-0649 C.L.C.M.は、私の最初のAIRC助成金n.18993とAFMテレソンn 2249によってサポートされています。

すべての実験手順は、イタリア保健省および制度的動物管理使用委員会(認可n83/2019-PR)の倫理的承認の下で行われた。動物はイタリアのミラノのサン・ラファエレ病院の認可施設で維持された(認可n.N.127/2012-A)。
1. 筋解剖と筋繊維培養
<ol><li>機器の準備。<ol>
<li>開始する前に、表 1に記載されているとおりに、必要なソリューションをすべて準備します。これらのソリューションは、新たに準備する必要があります。</li>
		<li>70%エタノールで手順中に使用されるすべての表面とツールを洗浄します。</li>
		<li>マウスの犠牲を始める前に、馬の血清(HS)を使用して100ミリメートルと35ミリメートルペトリ皿のコーティングを行います。ミオファイバーがプラスチックに取り付けないように、すべての皿をコーティングします。1匹の100mm皿とマウスあたり4つの35mm皿を使用することを検討してください。</li>
		<li>HSの余分を除去した後、37°Cのインキュベーターに30分間コーティングされた料理を保管してください。次に、洗浄液または培養液(マウスあたり2つの35mm皿)で満たします。 注:または、Dulbeccoの変更されたイーグルの媒体(DMEM)の10%HSの溶液は皿をコーティングするために使用することができる。常にコーティングされた料理を使用してください。異なるサイズの文化料理を使用することは可能ですが、小さな次元のペトリ料理をお勧めします。</li>
		<li>繊維の分離のために、図2に示すように無菌パスツールピペットを準備する。各マウスに対して、筋肉処理と機械的分解用の1つの大きな穴孔ボアピペット(図2A)と繊維選択用の小孔ピペット1個を準備する(図2B)。ダイヤモンドペンを使用して各ガラスピペットを所望の長さにカットし、炎の上にピペットの縁を滑らかにします。</li>
		<li>使用前にHSで短時間濡らして各ピペットをコーティングします。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスの犠牲と筋肉解剖<ol>
<li>消化液を室温で10分間事前に温めてから、解剖手順を開始します。ポリプロピレンFACSラウンドボトムチューブは、目的に最も適した容器です。</li>
		<li>筋肉の検索の開始の直前に, 適切な国家IACUC勧告に従ってマウスを犠牲に.</li>
		<li>皮を切る前に70%エタノールで下半身を濡らして、毛髪の除去を容易にします。</li>
		<li>アルミニウム紙で覆われたポリスチレンの支持体にマウスを置き、背中の真ん中から脚の方向に皮膚を切ります。</li>
		<li>筋肉や腱に触れずに皮膚を慎重に取り除きます。すべての皮膚をはぎ取ることは可能です。</li>
		<li>マウスの2本の脚を切り、急速に解剖を進める。 注:より快適であれば、マウス全体の解剖を続けることは可能ですが、脚に取り組むことは後のカットでより多くの移動性と精度を可能にします。</li>
		<li>ピンを使用して足のレベルでサポートの脚を修正し、この順序で関心のある骨格筋の分離を開始:TA、EDL、胃腸およびソレウス。</li>
		<li>足首の高さで鋭いトゥイザーでTAの下腱を持ち上げて切り、TA筋肉の周りのすべての細かいはさみで膝蓋骨のレベルで他の腱に切ります(図3A)。消化液に移す。</li>
		<li>EDLの下側腱を持ち上げ、他の腱にそっと引き上げて他の筋肉から分離します。切って消化液に入れる。 メモ:EdLはTAとは別にカットする非常に小さいので、一緒に解剖することができます(図3B)。次に、筋肉全体が大きすぎる場合は、腱から始まり、繊維を縦方向に2〜3個に切ります(図3C)。</li>
		<li>背中の筋肉を示す脚を回転させ、ピンを使用して足を固定します。アキレ腱を持ち上げると、胃腸は自動的に他の筋肉から分離します。上腱は膝蓋骨の後ろに上がっています。それをカットし、消化に筋肉を追加します。</li>
		<li>脚の外部腱を持ち上げて(身体に関して)、ソレウスを手に入れる。ツイーザーで下をスクロールして、他の筋肉からそっと分離します。</li>
		<li>他の脚にも同じ操作を行います(1.2.7.から1.2.11へのステップ)。</li>
	</ol></li>
	<li>筋肉の消化<ol>
<li>37°Cの水浴中に全ての筋肉を含む消化液を約45~50分間インキュベートします。消化時間中に、定期的に過剰消化を避けるために筋肉をチェックします。10分ごとに消化管を10倍に反転し、エネルギッシュな動きをします(渦を避ける)。</li>
		<li>筋肉が緩み始め、筋線維が見えるとき、消化を止めます。</li>
		<li>消化時間の最後にサンプルを振ります。</li>
		<li>消化を止めるには、消化懸濁液を10mLの洗浄液であらかじめ温めた100mmペトリ皿に慎重に移します。 注:これは必然的に超収縮ミオファイバーの分離につながるので、筋肉の過剰消化を避けてください。通常、このプロトコルでは、ホモ接合変異マウスの筋肉は消化されるのに45分を要し、野生型マウスの筋肉は50〜55分かかります。</li>
	</ol></li>
	<li>単一のミオファイバー分離<ol>
<li>まず、コーティングされたP200ピペットまたは小さな穴パスツールで個別に摘み取ることによって解剖顕微鏡の下で解離した繊維を分離し、100 mmペトリから5 mLの事前温め洗浄液を備えた新しい35mmペトリ皿に移します。</li>
		<li>さらにミオファイバーを放出するために、繊維が機械的に放出されるまで、暖かい媒体を有する大孔孔孔ガラスピペットを用いて筋肉を上下にピペット化する。これは、繊維を損傷をもたらすので、あまりにも永続的にしないでください。</li>
		<li>皿が望ましい量を含むまで筋肉から筋繊維を放出し続ける。ペトリ皿を室温で8分以上保つ場合は、停止して37°Cで最低5分間インキュベーションを行い、5%CO2を培地2を再平衡化する。</li>
		<li>単一のミオファイバーを培養培地に移す前に、37°C、5%CO2を2洗浄皿に1時間以上放置する。これは、インビトロの状態に適応するためにミオファイバーを助けます. 注意:大人の筋繊維はストレスの影響を受けにくく、洗浄することができます〜2〜3倍。しかし、この状態(出生後19日で)は、ミオファイバーの損傷を防ぐために1つの洗浄工程のみを行う方が良い。そのため、常にデブリや高収縮繊維を運びないようにして、選択したミオファイバーを十分に清潔に保つように注意してください。</li>
	</ol></li>
	<li>単一のミオファイバー培養<ol>
<li>適切な培養培地を用いて個々のミオファイバーを新しいプリ温め皿に移す(高血清培地は、衛星細胞の活性化を可能にする、図1参照)。</li>
		<li>培地を単離されたミオファイバーに変え、新しい培養培地で新しいコーティングされた皿に移すことによって、48〜72時間後の培養後にのみ、筋繊維の過収縮および破壊につながるストレスを避ける。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 下流用途:ミオファイバー架橋と蛍光免疫
注意:ミオファイバー関連衛星細胞は、対象時に免疫蛍光(IF)で可視化することができます。公開されたプロトコルのほとんどは、成人の筋繊維上でIFを実行するように最適化されているので、ここでは、出生後の筋肉から隔離された筋繊維にも信頼性の高い結果を得るための詳細なプロトコルが提示されています。
<ol><li>ミオファイバー架橋<ol>
<li>開始する前に、表 2に記載されているとおりに、必要なソリューションをすべて準備します。</li>
		<li>サンプル数と同じ数のHSのマイクロ遠心分離管とのプレコート。続行する前に、必ずすべての HS を削除してください。架橋繊維は生きた繊維よりも厳しく、ピペットが難しいため、チューブごとに200~300本程度の繊維を別々に架橋するようにしてください。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で、健康と見なすことができるすべての繊維を収集し、マイクロ遠心チューブに移し、チューブをインキュベーターの内側に5分間垂直にして、繊維が落ち着くようにします。</li>
		<li>チューブから非常にゆっくりと上澄み出しを取り除く。</li>
		<li>4%パラホルムアルデヒド(PFA)の1 mLをチューブにRTに加えて架橋繊維。繊維の苦痛を避けるために穏やかにそれを行います。</li>
		<li>架橋時に繊維が織り交ぜるのを防ぐために、チューブを10分間非常に穏やかな攪拌状態に保ちます。</li>
		<li>繊維が沈降するようにRTで5分間垂直位置にチューブを保ち、PFAボリュームの大部分を除去することを保証する上清を捨てます。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を1 mL加え、繊維を沈積物にするためにRTで5分間チューブを垂直に保ちます。</li>
		<li>上清を取り除き、洗浄手順(ステップ2.1.8.)を2回繰り返します。</li>
		<li>クロスリンクされたサンプルを4°Cに保ちます。 メモ:4°Cで1週間、架橋したミオファイバーを保つことができます。この状態で繊維が1週間以上残っている場合、これは必然的にミオファイバーが絡み合う結果になります。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫蛍光<ol>
<li>繊維沈沈を可能にするために、少なくとも5分間RTで立っている繊維を含む管を保ちます。</li>
		<li>上清を取り除き、少量のボリュームを残して繊維を取り除かないようにします。</li>
		<li>PBSに0.5%トリトンX-100の1mLを加え、穏やかな攪拌で5分間インキュベートします。</li>
		<li>チューブを垂直に5分間置き、上清を取り除きます。</li>
		<li>PBSを1.5mL加え、5分間穏やかな攪拌でインキュベートします。</li>
		<li>チューブを垂直に5分間保持し、上清を取り除きます。</li>
		<li>1 mLのブロッキング溶液を加え、穏やかな攪拌でRTで1時間インキュベートします。</li>
		<li>チューブを垂直位置に5分置いてから、上清を取り除きます。</li>
		<li>ブロッキング溶液中の一次抗体を希釈し、チューブに加え、穏やかな攪拌で4°Cで夜を過ごしてインキュベートする(推奨濃度については材料表を参照)。 注:あるいは、一次抗体はRTで3時間インキュベートすることができます。しかし、一晩のインキュベーションは最適な染色を与えた。一次抗体と二次抗体の両方のインキュベーション体積は、沈み込み繊維が1.5 mLマイクロ遠心分離チューブの100 μLノッチに達すると300 μLになります。繊維の量が少ない場合は、100~200μLの体積をお勧めします。</li>
		<li>チューブを垂直位置に5分間放置してから、上清を取り除きます。</li>
		<li>PBSで0.25%Tween-20の1mLで3回の洗い物を行い、穏やかな攪拌で5分間インキュベートし、チューブを毎回5分間放置します。 注:ここから、フルオロクロムの漂白を避けるために、暗闇の中ですべての手順を実行します。</li>
		<li>ブロッキング溶液中の二次抗体を希釈し、チューブに加えて、RTで1時間、穏やかな攪拌を行ってインキュベートする(濃度については材料表を参照)。</li>
		<li>PBSで0.1%のTween-20の1mLで2回洗浄し、穏やかな攪拌で5分間インキュベートし、チューブを5分間放置します。</li>
		<li>上清を取り除き、DAPI溶液を1mL加え、穏やかな攪拌で5分間インキュベートします。</li>
		<li>チューブをラック内に5分間垂直に立たせてから、上清を取り外します。</li>
		<li>PBSを1 mLで洗浄し、穏やかな攪拌で5分間インキュベートし、チューブをラックに5分間放置します。</li>
		<li>上清を取り除き、約50μLのボリュームを残します。</li>
	</ol></li>
	<li>顕微鏡スライド上に蛍光標識されたミオファイバーの取り付け<ol>
<li>P200ピペットチップをカットし、ブロッキング溶液でコーティング 注:先端をコーティングするには、繊維を選ぶ前に溶液を数回上下にピペットし、先端の壁に繊維が付着するのを避けます。</li>
		<li>チューブから繊維を収集し、顕微鏡のガラススライド上に広げます。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で、ミラーによって反射された自然光のみを使用して、新しい(カットされていない)P200ピペットチップを使用して繊維を広げ、余分な液体溶液を除去する。</li>
		<li>非常に低い量の溶液が残るまで、スライドを暗闇の中で約10〜15分間乾燥させておきます。</li>
		<li>取り付け媒体をスライドに追加し(適切な土台量はカバースリップの寸法で較正する必要があります:24 x 40 mmカバースリップの場合は20 μLで十分です)、ゆっくりとカバーガラスをファイバーを含む領域に置きます。メガネの間に泡を作らないように注意してください。</li>
		<li>カバースリップを押して、繊維が単一の水平計画に置かるようにします。</li>
		<li>マニキュアを使用してカバースリップを固定します。</li>
		<li>サンプルを4°Cで最大4週間保存してください。</li>
		<li>蛍光標識されたミオファイバーの望ましい画像を共焦点顕微鏡で取得します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

競合する利益はありません。

無傷の単一の筋繊維の単一の分離は、主な目的は、健康で病理学的な条件下で、ニッチ内の筋肉幹細胞の細胞自律再生能力を特徴付ける場合、筋形成の分野で不可欠な方法である。しかし、生化学的またはゲノム研究が関心がある場合、FACSで単離された衛星細胞が最良の選択肢である可能性があります。
単一の筋繊維の単離は、元生体に従うことを可能にするが、最も生理学的な方法では、単一の衛星細胞が筋肉再生中に受けるすべてのステップのダイナミクス、すなわち活性化、細胞分裂(非対称および対称)、分化および自己再生による静止に戻る。ミオファイバーが浮遊状態で成長すると、単一の衛星細胞は活性化し、細胞のクラスターを形成し、すべてが同じ衛星細胞から派生して拡大します。増殖、分化、活性化または幹細胞マーカーの免疫蛍光分析は、細胞段階間の割合を定量するのに最適です。
実行可能で無傷の筋線維を得るためのプロトコルの重要なステップは、筋肉の損傷を避けるために、腱から腱への分離によって、急速だが穏やかな筋肉解離と考えることができます。私たちのアドバイスは、鋭いはさみと小さな鋭いピンセットのみを使用し、筋肉解剖手順全体を10分に制限することです。非常に小さな筋肉(EDLとTA)を分離することが困難な場合、それらを一緒に切断し、後で繊維に従って縦断計画に沿って切断細かいはさみを使用してそれらを分割することが可能です。この戦略は、最終的にはあまり無傷の筋繊維を与えますが、生存率は損なわれません。消化を容易にするために、Gastrocnemiusのような大きな筋肉にも同じを行う必要があります。経験的に検証する必要がある消化時間の最適化と、孤立した繊維の操作を最小限に抑えることも、その後の分析の肯定的な結果にとって重要な2つの側面です。
ここで報告されるプロトコルの利点は、筋肉が非常に壊れやすい場合でも、非常に小さなマウス(年齢および次元)に適用できることです。上記で述べなくても、この解剖のプロトコルに従って、地下膜被覆皿18,19,19を用いて長期間培養可能な筋繊維を培養することができる。この状況は、接着刺激と近接刺激が存在しない浮動状態とは全く異なることを考慮することが重要です。

骨格筋は、運動または外傷1後に再生する最も拡張された能力の1つを有する分化組織である。この特性は主に、筋繊維2の基底層層と血漿素間の末梢位置のために、衛星細胞と呼ばれる幹細胞の存在に起因する。出生後の発達の間、衛星細胞は増殖し、徐々に分化し、骨格筋の成長に寄与する。成人期になると、衛星細胞は可逆的な静止状態に入り、生理学的または病理学的外傷の際に、損傷した筋肉を修復するために活性化、増殖、分化する3。衛星細胞の能力の欠陥は、これらの異なる再生相を適切に通過し、自己再生を受,けるために、生理学的老化時に4、5、6、5,6または筋ジストロフィー77、8、9、108などの筋肉変性疾患において、筋肉の消耗にしっかりと関連している。9,10
衛星細胞を研究する2つの主な培養アプローチは、元生体細胞を研究するために存在する:単核細胞からの原発性筋由来培養、機械的および化学的に筋肉11、12,12から解離した;または分離されたミオファイバー,13、14、15、16、17、18、19、20,14,15,16,17,18,19の培養。20第1の場合において、衛星細胞の単離のプロセスは、マウスから抽出された筋肉全体の三分化、化学消化、濾過および蛍光活性化細胞選別(FACS)21を含む。この手順は、様々なモデルから衛星細胞を単離するのに有効であるが、サテライト細胞をストレスにさらし、それらの生理的ニッチ22、23,23を破壊するいくつかの変数を伴う。対照的に、筋繊維単離は、マトリックス分解酵素を有する筋肉組織の緩やかな消化と、幹細胞20に対する外傷の減少を引き起こす機械的な細断を伴う。この第2のアプローチは、基底層層とサルコレンマの間の筋繊維に物理的に付着したままの生存可能な衛星細胞のはるかに効率的な検索を可能にし、したがって、生理的ニッチ19、20,20内の分析を可能にする。
骨格筋から単一のミオファイバーを適切かつ効率的に分離するために、過去数年間に多くの異なるプロトコルが提案されている。すでに1986年にビショフは、フレクソール・デジトルムBrevis13以降から繊維を分離するプロトコルを提案し、1995年に、Rosenblattらは、ミオファイバー14のより効率的な分離を得るためにプロトコルを改変した。それ以来、他の多くの著者は、伸張ジテロムロンゴ(EDL)および,脛骨表(TA)15、16、17、18、19、20,17,18,19など、他15,16の筋肉に対する調整された手順を提案した。20次いで、分離された筋繊維を、接着性の両方で培養し、衛星細胞由来の筋芽細胞の拡張を可能にし、または浮遊状態で、最大96時間、単一衛星細胞19に由来する子孫に従うことができる(図1)。培養培地内の血清の可変濃度は、衛星細胞の活性化、増殖および/または分化を引き起こすために用いられ、これらの異なる相1を適切に通過する能力を研究する。
我々は最近、EDMDのマウスモデルにおける衛星幹細胞プールの枯渇の背後にあるエピジェネティックメカニズムについて述べた、ラミンΔ8-11-/-マウス7。これらのマウスは通常、重度の筋肉喪失のために24歳の4〜8週の間に死ぬので、出生後の筋肉の発達に関する我々の分析に焦点を当てることによって、疾患の早期発症の基礎となる分子欠陥を捕捉する試みがなされた。浮遊単一筋繊維を野生型およびラミンΔ8-11-/-変異体719日齢マウスから単離して培養した。この段階では、筋肉の欠陥はすでに明らかであるが、マウスはまだ実行可能である。しかし、単一のミオファイバー抽出のための上記のプロトコルはすべて成体マウスの骨格筋に最適化されていたので、我々は彼らの目的に適応する必要があった:年齢と大きさの用語で非常に小さいマウス、および非常に壊れやすい筋繊維。このように、我々は、出生後の発達中にマウスから、およびラミンΔ8-11−/-マウス24に由来するもののような重度のジストロフィー筋肉からかなりの数の単一の生存可能な筋線維を得るために、ルドニッキ研究所19によって提案されたプロトコルの再適応をここで説明する。このアプローチの最終目標は、出生後の発達の初期段階が関心がある場合、またはミオファイバーを機械的ストレスの影響を受けやすくする特定の疾患を運ぶマウスモデルの場合、他のマウスモデルにおける筋線維関連筋幹細胞の研究のための標準化された手順を提供することです。

<table><tbody><tr><td>4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインド</td>ール <td>Σ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>鶏胚エキス</td><td>Seralab</td><td>CE650-DL</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td>SIGMA</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ488抗体</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーR37118</td><td>使用 1:200</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルス培地</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>MyoG抗体</td><td>ミリポア</td><td>219998</td><td>1:100</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>SIGMA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 抗体</td><td>Developmental studies ハイブリドーマバンク</td><td></td><td>1:20</td></tr><tr><td>ペニシリンとストレプトマイシン</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>リン酸生理食塩水</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>プロロング ゴールド 退色防止剤 封入剤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン-20</td><td>シグマ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>ラボ機器</ストロング></td><td><ストロング>メーカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr>ナー共<tr><td>焦点顕微鏡</td>ライ<td>カ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドペン</td>バイオ<td>オプティカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖ピン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSポリプロピレンチューブファ</td><td>ル</td>コン<td></td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ(50および15 mL)</td><td>ファルコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップサー</td><td>モフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット(22cm)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラススライドサー</td><td>モフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖はさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット(1 mLおよび200 &micro;L)</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td>マイクロ</tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(直径100mmおよび35mm)</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックピペット(5mLおよび10mL)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゴムピペットバルブ</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャープピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トランスミッション付きステレオ解剖顕微鏡照明</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養フードまたはラミナフローキャビネット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター(加湿、37°C;C、5%CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37°Cのウォーターバス。C</td><td>VWRの</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

常染色体優勢のエメリー・ドレイフス筋ジストロフィー(EDMD)は、核エンベロープおよび核細胞の成分を維持するA型核ラミン、中間フィラメントタンパク質をコードするLMNA遺伝子の突然変異によって引き起こされる。我々は最近、EDMDにおける筋肉の消耗は、筋肉(衛星)幹細胞の再生能力に影響を与える固有のエピジェネティック機能不全に起因する可能性があることを報告した。単一のミオファイバーの単離および培養は、繊維とサルコレンマを取り巻く基底層の間に残っているため、ニッチ内の衛星細胞の挙動を監視するための最も生理学的な元生体アプローチの1つである。したがって、多様なマウスモデルから衛星細胞を研究する貴重な実験パラダイムを表す。ここでは、出生後の後肢筋肉(チビアリス・アンテリオール、伸張器ジジット・ロンガス、胃頭門、ソレウス)から無傷で生存可能な単一筋繊維を分離するための再適応方法について説明します。このプロトコルに従って、我々は生後わずか19日で、重度のEDMDマウスモデルであるラミンΔ8-11-/-マウスの衛星細胞を研究することができました。
我々は、分離手順、ならびに良好な量のミオファイバーおよび関連する衛星細胞由来の子孫を得るための培養条件を詳述する。増殖因子が豊富な培地で培養されると、野生型マウスに由来する衛星細胞が活性化し、増殖し、最終的に自己再生を受けたりする。ホモ接合ラミンΔ8-11-/-変異マウスにおいて、これらの能力は著しく損なわれる。
この技術は、厳密に従う場合、初期の出生後発達段階および脆弱な筋肉においても、筋線維関連衛星細胞に関連するすべてのプロセスを研究することを可能にする。

我々は通常、4つの異なる筋肉(TA、EDL、ソレウス、胃腸)を消化して、成長因子が豊富な培地で96時間生存できる長くて生存可能な繊維を大量に取り出す(図4A,B)。最も無傷の繊維だけが生き残るために培養培地に移されるべきである。差別や選択が容易な他のすべてのものは破棄する必要があります。
ミオファイバーが成長因子で維持され、野生型マウス由来の豊富な培地衛星細胞が活性化し増殖し始めると、図1を参照してください。48時間の培養時に、健康な状態(ラミンΔ8-11+/+)で、衛星細胞はMyoDをアップレクラルジな状態にし、その第1分裂を受ける。活性化されたPax7+/MyoD+衛星細胞は、培養中に増殖し、72時間までに、ミオファイバーに結合した細胞凝集体を生成し、96h(図5)でさらに目に見える。これらの分裂の間、それらのいくつかは、MyoD発現を抑制し、幹細胞プールを再設定するために自己再生を受けることができ、MyoDを維持するものはPax7発現をダウンレギュレーションすることによって分化にコミットするようになります。96時間後、衛星細胞クラスタは明らかに見えるMyoG+のコミットされた細胞を含み、新しいミオファイバーに分化することができる(図1および図6)。特に、この実験では、ホモ接合変異型ラミンΔ8-11マウス(-/-)における衛星細胞分化の遅延ダイナミクスを、野生型のマウス(+/+)と比較して説明した、図6参照。
各単一の実験の最終的な結果は、重度の筋ジストロフィーのこのモデルから単一のミオファイバーの分離と培養のために開発されたプロトコルは、すべてのさらなるアプリケーションのための良質の筋繊維を保証すると考えてみましょう。
<img alt="多核筋線維図;Pax7とMyoD/MyoGの筋分化タイムラインにおける役割" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1浮体筋繊維をモデルとした衛星細胞の再生相のグラフィカル表現成長因子が豊富な培地で48時間培養すると、Pax7+細胞が活性化され、最初の分裂を受け、Pax7+/MyoD+細胞の二重化が生じる。その後、MyoD陽性細胞は増殖して増殖し、培養の72時間で、単一の衛星細胞の子孫である複数の細胞のクラスターに上昇させる。96時間培養すると、Pax7+/MyoD+細胞はPax7-/MyoG+細胞を分化するようになります。拡張段階では、Pax7+/MyoD+細胞のサブセットが自己再生を受けたMyoD発現を静止状態にダウンレデンスする。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="実験室用ピペットシール法;ガラスピペットとシーリングの概要を使用した組み立て図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:ボアパスツールピペットの調製(A)大穴ボアピペットがどのように現れなければならないかの縦方向および正面図。(B)小孔ボアピペットが最終的にどのように現れなければならないかの縦方向および正面図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="TAおよびEDL腱の解剖プロセス。筋肉の抽出;解剖学的研究図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:単一筋肉解離の代表的な写真。(A) TA筋肉の分離。筋肉を覆う薄い層の除去を避けることは、内部の筋繊維を保護します。(B)TAとEDLの筋肉は、膝蓋骨のレベルで上腱に依然として付着している。(C)縦軸に沿って切ることによって分離後のTAとEDLの分割。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="生存可能な筋線維、壊れた繊維の顕微鏡画像。筋肉組織分析、構造比較。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:健康で生き生きとした筋繊維の例懸濁液中の生き生きとした筋繊維の代表的な位相コントラスト画像。(A) 赤い矢印は、可視サルコメア組織と衛星セルを持つミオファイバーを示します。オレンジ色の矢印は、壊れた筋繊維のいくつかの部分を示し、いくつかの破片は、文化のための最終的な選択の前に最初の皿に存在します。スケールバー100μm(B)より小さい倍率の下で他のミオファイバーのより完全な眺め。スケールバー500 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ラミンΔ8-11モデルにおけるDAPIおよびPax7染色の蛍光顕微鏡検査。細胞分化研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5:wtマウス及び変異型マウスにおける幹細胞クラスターの次元の相違。培養96時間後に19日のラミンΔ8-11マウス(+/+および-/-)から抽出した筋繊維の免疫蛍光染色。Pax7+衛星セルが表示されます。ほとんどの場合、細胞クラスターの次元は、ラミンΔ8-11+/+において、細胞数の点でラミンΔ8-11-/-----よりも有意に大きかった。スケールバー 10 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="筋細胞マーカー DAPI、Pax7、MyoG を示す蛍光顕微鏡。ラミンΔ8-11の比較。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図6:代表的な免疫蛍光実験。免疫蛍光実験は、培養96時間後、19日のラミンΔ8-11マウスから抽出された筋繊維上で実施した(+/+および-/-)。Pax7+/MyoG-(赤)およびPax7-/MyoG+(緑色)細胞が観察された。共焦点顕微鏡で得られる画像。スケールバー25 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>テキスト内のソリューションの名前</td>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>割合</td>
			<td>推奨される最終ボリューム/サンプル</td>
			<td colspan="2">ノート</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">洗浄液</td>
			<td>DMEM高グルコース</td>
			<td>90%</td>
			<td rowspan="2">4 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">無菌を保つ、使用するまで4°Cに保つ</td>
		</tr>
<tr>
<td>馬の血清 (HS)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">消化液</td>
			<td>DMEM高グルコース</td>
			<td>9.80%</td>
			<td rowspan="2">20 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">非常に有害な粉末。0.22μmフィルターを用いてフィルター溶液を使用し、滅菌を維持します。使用するまで4°Cに保つ</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼI</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">培養培地</td>
			<td>DMEM高グルコース</td>
			<td>78%</td>
			<td rowspan="4">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="4">無菌を保つ、使用するまで4°Cに保つ</td>
		</tr>
<tr>
<td>胎児ウシ血清(FBS)</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>鶏胚エキス(CEE)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペニシリンストレプトマイシン(P/S)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: セクション 1 で使用されるソリューションのレシピ。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>テキスト内のソリューションの名前</td>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>割合</td>
			<td>推奨される最終ボリューム/サンプル</td>
			<td colspan="2">ノート</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">4% PFA</td>
			<td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td>
			<td>4%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">粉末と溶液は非常に有害です</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0.5% トリトン X-100</td>
			<td>トリトンX-100</td>
			<td>0.50%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">トリトンX-100は非常に粘性であり、ピペットの先端をアリコートに優先的にカットする</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0.25% トゥイーン-20</td>
			<td>トゥイーン-20</td>
			<td>0.25%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tween-20は非常に粘性であり、ピペットの先端をアリコートに優先的に切断する</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.75%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0.1% トゥイーン-20</td>
			<td>トゥイーン-20</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tween-20は非常に粘性であり、ピペットの先端をアリコートに優先的に切断する</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ブロッキング ソリューション</td>
			<td>胎児ウシ血清(FBS)</td>
			<td>10%</td>
			<td rowspan="2">10 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">新鮮なソリューションを準備し、4°Cで3週間以上保管してください(常に使用前に明確さを確認してください)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ダピス</td>
			<td>ダピス</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">2-3 mL</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">暗闇の中で保つ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: セクション 2 で使用されるソリューションのレシピ。

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

成体マウスの骨格筋から単一のミオファイバーを単離するためのプロトコルが数多く存在する。私たちのプロトコルは、非常に若いマウスと非常に壊れやすい筋繊維を持つ小さなマウスのために考案されています。この標準化された手順は、出生後の発達中に筋線維支援筋肉幹細胞を研究したり、特に筋繊維を機械的ストレスの影響を受けやすい疾患のマウスモデルで使用することができます。この手順は、博士課程の学生であるグロリア・ペグリと、博士号を持つフェデリカ・ルチーニが研究室からデモンストレーションを行います。筋肉解剖と収穫のために、安楽死させた、非常に若いまたは非常に小さいマウスから解剖板に1つの後肢を固定するためにピンを使用し、鋭いピンセットを使用して脛取り前部の下腱を足首の高さまで持ち上げます。腱をカットし、膝蓋骨のレベルで腱に筋肉の周りのすべての方法をカットするために細かいはさみを使用しています。消化液のチューブに筋肉を入れ、伸長体の腱の下腱を持ち上げ、腱を優しく上に引っ張って伸び体長を他の筋肉から分離します。切断し、筋肉を収穫します。脚を回転させて背中の筋肉を見て、アキレス腱を持ち上げます。胃頭筋は自動的に他の筋肉から分離します。.膝蓋骨の後ろの上腱を切り、消化液に筋肉を入れる。脚の外部腱を持ち上げ、腱の下にピンセットを転がして腱を筋肉からそっと分離します。次に、切断して筋肉を収穫し、同じ方法で他の脚から同じ筋肉を集めます。すべての筋肉が収集されたら、コレクションチューブを摂氏37度の水浴に45〜50分間入れ、10分ごとに10回激しくチューブを反転させます。筋肉が緩み始め、筋繊維が見えるようになると、10ミリリットルの洗浄溶液を含む100ミリメートルのペトリ皿に消化懸濁液を慎重に移す前に、サンプルを最後に振ります。単一のミオファイバーを分離するには、皿を解剖顕微鏡の下に置き、馬の血清を200マイクロリットルピペットチップで使用して、個々の筋線維を離れて選びます。生き生きとしたミオファイバーを、5ミリリットルの事前温め洗浄液を含む35ミリメートルペトリ皿をコーティングした馬の血清に移します。すべての生菌性ミオファイバーが採取されたら、培養インキュベーター中のミオファイバーサンプルを5分間平衡化する。さらにミオファイバーが必要な場合は、大きなボアガラスピペットを使用して、残りの筋肉組織サンプルを、追加の繊維が機械的に放出されるまでトリチュレートします。十分なミオファイバーが採取されたら、さらに平衡期間のために1時間培養インキュベーターに皿を入れます。インキュベーションの終了時に、適切な培養培地を含む新しい、温め込まれた馬の血清被覆皿に個々のミオファイバーを移し、そのプレートを細胞培養インキュベーターに戻す。筋線維の免疫蛍光分析のために、架橋後、十分な上清以外のすべてを除去し、繊維を除去せず、PBSで0.5%トリトンX-100の1ミリリットルを同じチューブに加え、穏やかな攪拌で5分間インキュベーションする。インキュベーションの終わりに、上清をPBSの1.5ミリリットルに置き換える前に、繊維が5分間沈着するようにします。5分間の緩やかな攪拌の後、繊維がさらに5分間落ち着いてから、上清を1ミリリットルのブロッキング溶液に置き換えます。穏やかな攪拌の1時間後、穏やかな攪拌で摂氏4度で一晩インキュベーションのための関心のある一次抗体を含む新鮮なブロッキング溶液とブロッキング溶液を交換してください。翌朝、PBSで穏やかな攪拌と洗浄のための室温で5分間の堆積を使用して、新鮮な0.25%Tween 20の1ミリリットルで3つの5分間の洗浄で繊維を洗います。最後の洗浄後、示すように、光から保護されたPBS+0.1%Tweenの3回の洗浄を続け、穏やかな攪拌で室温で1時間ブロッキング溶液で希釈した適切なフルオロクロム共役二次抗体で繊維にラベルを付けます。最後の洗浄後、上清を1ミリリットルのDAPI溶液に交換し、光から保護された穏やかな攪拌で室温で5分間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、繊維を洗浄し、カットチップでピペットをコーティングしたブロッキング溶液を使用して繊維を収集し、慎重にガラススライドに繊維を広げます。スライドを解剖顕微鏡の下に置き、鏡で反射した自然光のみを使用して、新しい200マイクロリットルピペットチップを使用して繊維を穏やかに広げ、余分な溶液を取り除きます。余分な溶液を取り除いた後、非常に少量の溶液が残るまで、スライドを暗闇の中で10〜15分間乾燥させます。次に、組織の上にカバースリップを慎重に配置する前に、繊維に適切な土量の取り付け媒体を追加します。成長因子が豊富な培地で96時間生存できる十分な数の長い生存可能な繊維を取り出すために、4つの異なる筋肉が典型的に収穫され、消化される。最も無傷の繊維のみが培養培地に移されるべきである。壊れた繊維やその他の破片は廃棄する必要があります。72時間培養した後、活性化された衛星細胞は、ミオファイバーに結合した細胞凝集体を生成する。我々は、ラミンデルタ81二重陰性マウスに由来する細胞培養が、より少ない数の細胞によって形成されることを観察する。96時間後、衛星細胞は、MyoGを発現し、細胞クラスタ内に可視になり、新しいミオファイバーに対する分化を開始する。特に、衛星細胞分化の遅れたダイナミクスは、それらの野生型の対応と比較して、ホモ接合変異型ラミンノックアウトマウスで観察される。迅速かつ正確な筋肉の収穫は、実験の成功に不可欠であるように筋肉解剖ステップを練習するようにしてください。この技術は、活性化および分化中の単一衛星細胞の追跡を可能にし、異なる生理学的および病理学的状態下での筋肉の成長および再生の基礎となる主要なプロセスの研究を促進する。

single-myofiber-isolation-culture-from-murine-model-emery-dreifuss

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JoVE Journal

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ゼブラフィッシュは、骨格筋のヒト障害をモデル化するための新たなシステムである。私たちは、胚および幼虫のゼブラフィッシュから骨格筋筋線維を隔離するために迅速かつ効率的な方法が記載されている。この方法は、単一の骨格筋線維の形態、タンパク質の細胞内局在、および筋生理学の研究に適した高密度の線維調製物が得られる。...

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

このプロトコルは、エレクトロポレーションを利用して、マウスの筋線維に蛍光標識タンパク質を導入し、発現させます。エレクトロポレーション後の回収後、繊維は分離されます。次に、個々のファイバーを高解像度共焦点顕微鏡を使用して画像化し、筋肉構造を視覚化します。...

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

筋肉細胞は最も複雑な真核細胞の一つです。私たちは、すべての発達段階で遺伝子操作と明確なイメージングを可能にする、高度に成熟した筋線維のin...

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。...

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

この研究では、脱細胞化プロトコルを最適化して、マウス胎児骨格筋の脱細胞化マトリックスを取得しました。C2C12筋芽細胞は、これらのマトリックスにコロニーを形成し、増殖し、分化することができます。この in vitro...

細胞培養のためのマウス胎児骨格筋からの3D脱細胞化マトリックスの調製

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

このプロトコルは、酸化性のヒメスから完全な単一筋繊維を分離し、これらの繊維から得られる高度に精製された筋芽細胞培養を確立することを記述しています。最適化された手法により、マウスあたり約300〜500本の完全な筋線維を確実に取得でき、下流の分子および細胞解析が可能になります。...

酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ

学ぶ出生後の筋線維単離法。Lamin Δ8-11変異マウスから脆弱な筋線維を分離し、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーの筋肉幹細胞動態と再生メカニズムを解明する。

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

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