ラットにおける骨髄間葉系幹細胞の単離と培養

研究によると、頭蓋顔面骨に由来するBMSCは、軸骨や付属肢骨に由来するBMSCよりも優れた能力を示すことが示されています。したがって、下顎BMSCは、頭蓋顔面疾患の将来の治療法を開発するための好ましいリソースであると考えられています。このプロトコルは、全骨髄アドヒアランスと蛍光細胞選別の利点を組み合わせて、短時間でかなりの数の精製下顎BMSCを取得します。

このプロトコルを初めて試す場合は、このビデオを見たり、関連文献を読んだりすることで達成できる、ラットの下顎骨の解剖学的構造と機能的な動きを理解することが非常に重要だと思います。ラットを安楽死させた後、仰臥位で清潔なヒュームフードに入れます。皮膚と頬筋を両側口角から下顎骨の後部に切開します。

上顎切歯と下顎切歯を両手の親指で反対方向に押してラットの口を開き、下顎骨に付着している下顎歯を露出させます。頬筋と烏口筋に付着している腱、および下顎骨の下縁を完全に切断します。次に、下顎の後歯を押し、両側の顆がはっきりと露出するまで、下向きに回転させます。

下顎骨を頭蓋骨から分離し、濡れたガーゼを使用して骨表面の付着軟部組織を洗浄します。生存率を維持するために、事前に冷却された最小必須培地アルファ、または氷上のPBSで満たされた10センチメートルの滅菌ガラス皿に骨を置きます。下顎体から第一大臼歯の近心縁に沿って前骨を切り取り、次に第三大臼歯の遠位縁に沿って烏口骨と顆を含む下顎枝を取り除き、骨髄腔を露出させます。

10センチメートルの滅菌ガラス皿に10ミリリットルのα-MEMと10%FBSを満たします。10ミリリットルの注射器で培地を吸引し、次に針を骨髄腔に挿入し、骨髄を皿に繰り返し洗い流します。骨が白くなるまで、骨の近心側と遠位側の両方からそれぞれ少なくとも3回骨腔を洗い流します。

フラッシュした細胞を含む培地を15ミリリットルの遠心チューブに移し、800RPMで5分間遠心分離します。上清を捨て、10%FBSを含む3ミリリットルのα-MEMで細胞を再懸濁します。新しい10cm培養皿に細胞をプレートし、5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。

培地を吸引し、PBSで皿を洗います。皿に0.02%EDTAを含む0.25%トリプシンの2ミリリットルを追加し、摂氏37度で細胞を5分間消化します。次に、10%FBSを含む4ミリリットルのα-MEMを加えて反応を停止します。

細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心チューブに移し、800RPMで5分間遠心分離します。遠心分離後、細胞を10%FBSで120マイクロリットルのPBSに再懸濁します。100マイクロリットルの細胞懸濁液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。

細胞懸濁液をCD16からCD32に対する抗体1マイクロリットルで摂氏4度で15分間ブロックし、CD45に対するPE標識抗体、CD90に対するFITC標識抗体、およびCD29に対するAPC抗体で細胞を4°Cで1時間暗所で染色します。残りの20マイクロリットルの細胞懸濁液を未染色のネガティブコントロールとして使用します。チューブを800RPMで5分間遠心分離します。

上清を捨て、細胞を10%FBSを含む0.5ミリリットルのPBSに再懸濁します。分析の10分前に、10マイクロリットル/ミリリットルのDAPIを0.01ミリグラム加えます。遠心分離管に載せた40ナノメートルのフィルターを使用して細胞をろ過し、蛍光活性化セルソーターで細胞を分析します。

まず、DAPI陰性細胞をゲーティングして全細胞数から死細胞を除去し、次に選択した細胞内のCD29陽性、CD90陽性、CD45陰性を標的mBMSCとしてゲートします。選別したmBMSCを、10%FBSを含む5ミリリットルのα-MEMを入れた15ミリリットルの遠心分離管に集めます。チューブを800 RPMで5分間遠心分離し、収集バッファーを取り出します。

1ミリリットルの新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁し、6cmの培養皿にプレートします。このプロトコルを使用して、最初の培養後3日目に細胞の大部分がプレートに付着しました。さらに3〜4日間の培養後、細胞のコンフルエンスは70〜80%に達し、蛍光細胞選別を使用して、P0細胞の約81.1%を占めるmBMSCを精製しました。

P2 mBMSCを6ウェルプレートで1週間培養した後、かなりの量のコロニー形成ユニットが観察されました。mBMSCの多系統分化能力を評価するために、それらを骨軟骨系とアディポ系に誘導しました。ALPの活性の増加、アリザリン赤染色下の赤色石灰性結節、および骨形成特異的遺伝子Runx2、Alp、BspおよびOcnの発現増加は、骨形成誘導を示した。

油-赤-O染色は、脂肪形成を同定するために使用されました。多数の脂質が豊富な液胞が、導入の9日後に明らかでした。さらに、脂肪形成特異的遺伝子Ppar-γ-1およびCebpaの発現が増加しました。

サンプルは、軟骨分化の顕微鏡観察中にアルシアンブルーの陽性染色を示しました。また、抗II型コラーゲン抗体による免疫染色では、軟骨マトリックスの蓄積が促進されました。このプロトコルでは、mBMSCの生存率を確保することが非常に重要です。

この目的は、適切な実験動物を選び、氷上での手術を行い、実験時間を短縮することで達成できます。このin vitroモデルを利用すると、多数の増殖性下顎BMSCを得ることができ、生物学的特性の研究、その後の微小環境への反応、および下顎BMSCの他の応用を容易にする可能性があります。