免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出
2020年7月8日
マイクロRNAはIgA腎症の病態形成に関与しています。我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるマイクロRNA発現レベルを確実に検出する方法を開発しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAの関与をチェックすることを容易にします。
この方法を用いることで、IGA腎症におけるマイクロRNAの変化を小動物モデルを用いて簡便に確認することができ、ヒト腎生検を行わずにIGA腎症の研究が可能となります。このプロトコルは、IGA腎症の遺伝学に関する新たな洞察を提供することができ、腎臓病の新しい診断法や新しい治療法の発見に役立つ可能性があります。マウスが適切に麻酔されていることを確認した後、外科用ハサミと鉗子を使用して、マウスの腹壁に3〜4センチメートルの正中線切開を行い、腎臓の両側を特定します。
肋骨と横隔膜を切開して心臓を露出させます。右心房を切開した後、マウスの全身にPBSが灌流されていることを示す腎臓の色が淡黄色に変わるまで、左心室にPBSを注入します。腎動脈、腎静脈、尿管を切開し、腎臓を摘出します。
シリコンホモジナイザーと700マイクロリットルのフェノールグアニジンベースの溶解試薬を使用して、室温で30ミリグラムの腎臓サンプルをホモジナイズします。ライセートを生体高分子シュレッダースピンカラムに移し、室温で15, 000Gで2分間遠心分離します。原稿の指示に従ってRBNA精製を続けます。
最終洗浄後、シリカ膜ベースのスピンカラムに30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、それを8, 000Gで1分間遠心分離してRNAを溶出させます。cDNA合成には、2マイクロリットルの核酸ミックス、2マイクロリットルの逆転写酵素ミックス、および4マイクロリットルのバッファーをサンプルあたり合計8マイクロリットルのマスターミックスを調製します。8マイクロリットルのマスターミックスを8ウェルチューブストリップの各ウェルに加えます。
全RNAをヌクレアーゼフリー水で希釈します。次に、12マイクロリットルの全RNA溶液をストリップの各ウェルに加えます。サンプルをサーモサイクラーに入れ、摂氏37度で60分間インキュベートし、次に摂氏95度で5分間インキュベー
トします。定量的なリアルタイムPCRを行うには、原稿の指示に従ってマスターミックスを調製し、96ウェル反応プレートの各ウェルに22.5マイクロリットルのマスターミックスを加えます。調製したcDNAを2.5マイクロリットルを各ウェルに加えます。反応プレートをリアルタイムPCR装置に入れます。
次に、摂氏95度で15分間の初期活性化、続いて摂氏94度で15秒間の変性サイクルを40サイクル、摂氏55度で30秒間アニール、摂氏70度で30秒間の伸展をプログラムします。デルタデルタCT法を用いて遺伝子発現を定量化します。このプロトコルは、Balb/cマウスの腎臓をコントロールとして使用して、HIGAマウスの腎臓におけるmicroRNAの発現レベルを調査するために使用されました。
3つのIGA腎症関連マイクロRNAの発現レベルを測定しました。2つのグループの相対的なmicroRNA発現レベルをT検定を使用して比較し、Pが0.05未満であれば統計的に有意であった。miR-155-5pは対照群と比較してHIGA群で3.3倍、miR-21-5pは1.58倍高発現しました。
miR-1461-5pの発現は、両群間で有意差は認められませんでした。このプロトコールを試みる際には、マスク、手袋、キャップを着用し、環境中のヌクレアーゼが実験に影響を与えるのを防ぐために、実験室のテーブルとツールを清潔に保つことが重要です。この実験手法は、現在、当研究室で実用化されています。
IGA腎症の新しい診断法と治療法を確立することが目標です。
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概要
本研究では、IgA腎症マウスモデルの腎臓におけるmicroRNA発現レベルを検出するための信頼性の高い方法を提示します。この方法により、ヒトの腎生検を行うことなく、IgA腎症におけるmicroRNAの関与を調査することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 腎臓学
- microRNA研究
- 動物モデル
背景
- IgA腎症は、糸球体にIgAが沈着することを特徴とする腎疾患である。
- microRNAは、腎疾患を含むさまざまな疾患の病態生理において重要な役割を果たしている。
- microRNAの発現を理解することで、疾患のメカニズムに関する知見を得ることができる。
- microRNAを研究するための現在の手法は、侵襲的な処置を必要とすることが多い。
研究目的
- IgA腎症のマウスモデルにおけるmicroRNAレベルを評価する方法を開発すること。
- IgA腎症の遺伝学的側面に関する研究を促進すること。
- 腎疾患に対する潜在的な診断および治療アプローチを探索すること。
使用した手法
- IgA腎症のモデルとしてのHIGAマウスの使用。
- 手術前のマウスへの麻酔投与。
- 正中切開および臓器摘出を含む、腎臓へアクセスするための外科的手法。
- 腎臓摘出の準備としての、PBSを用いたマウスの灌流。
主な結果
- 開発された本手法により、IgA腎症におけるmicroRNAの変化を容易に検証することが可能になります。
- 本手法から得られる知見は、新たな診断ツールの開発につながる可能性があります。
- IgA腎症の治療に向けた新しい治療戦略を発見できる可能性があります。
- 予備研究において、ヒト腎生検を行う必要性が排除されます。
結論
- この手法により、IgA腎症におけるmicroRNAの関与についての理解が深まります。
- 腎疾患の遺伝学研究における新たな道が開かれます。
- このアプローチは、将来の診断および治療法の開発に大きな影響を与える可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
このプロトコルにより、バイオ医薬品の研究開発チームは、検証済みのIgA腎症マウスモデルにおいてmicroRNA発現をプロファイリングすることが可能となり、腎疾患プログラムにおけるターゲット検証およびメカニズムのデリスキング（リスク低減）を支援します。ヒトの生検を行うことなく、変化したmiRNAレベルを検出するための再現可能な手法を提供することで、予測信頼性を向上させたバイオマーカーおよび治療ターゲットの早期発見を促進します。このアプローチは、疾患メカニズムを調査し、前臨床開発に向けた候補物質を優先順位付けするという、探索段階の取り組みに沿ったものです。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： HIGAマウスと対照群における疾患関連miRNAの発現変化を定量化することで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用的価値： qRT-PCRを用いてmiR-155-5p、miR-21-5p、およびmiR-146a-5pのレベルを測定し、機能的ターゲットバリデーションを行うための信頼性の高いワークフローを提供します。
- 予測的価値： 統計的に有意なフォールドチェンジ（例：miR-155-5pにおける3.3倍）を示すmiRNAを潜在的なバイオマーカーまたはターゲットとして特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 発見スクリーニングキャンペーンにおけるアッセイ標準化に適した、定量的で再現性のあるmiRNA発現データを提供します。
- 運用的価値： ハイスループットqRT-PCRプラットフォームと互換性のある、標準化されたRNA精製およびcDNA合成プロトコルを確立します。
- アッセイの準備状況： delta-delta CT法を用いて正規化されたCT値を算出し、サンプル間の比較およびヒットの確認を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナル上の価値：疾患に関連するHIGAマウスモデルを用いることで、発見段階の知見とmiRNA介在経路の前臨床検証を橋渡しします。
- メカニズムのリスク低減：IgA沈着に関連するmiRNA発現の変化を評価でき、リード化合物の同定前にターゲットメカニズムの曖昧さを軽減します。
- 前臨床における継続性：研究群全体の腎組織から一貫性のある定量的な読み取り値を提供することで、リスク調整に基づいた進展の意思決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は初期探索の連続的なプロセスに組み込まれており、ターゲットバリデーションにおける仮説検証をサポートし、リード化合物の同定に関する意思決定に寄与するスクリーニングおよび解析ワークフローのための定量的な出力を生成します。
- 探索生物学：遺伝子組換えマウスモデルを用いてIgA腎症の病態に関連するmiRNA発現の変化を測定することで、パスウェイの解明を可能にします。
- スクリーニング：下流のアッセイにおいて標的パスウェイに対する化合物の効果を評価するのに適した、標準化された定量的なmiRNAデータを生成します。
- 分析：デルタデルタCT値およびフォールドチェンジ指標を算出し、条件間の比較やT検定による統計的有意性の評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：表現型との関連性が確認されたバリデート済みIgA腎症モデルを用いることで、探索段階のmiRNAの知見を前臨床段階へと繋げます。
- 企業内での再利用：腎疾患プロジェクトにおける複数のmiRNA標的に適用可能な、再利用可能なRNA抽出およびqRT-PCRプロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：疾患モデルにおけるmiRNAの調節異常を直接的に測定することで、メカニズム的な曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：規定されたRNA精製、cDNA合成、およびqRT-PCRのパラメータ（例：8,000 Gでの遠心分離、37°Cでのインキュベーション）により、再現性と標準化を確保します。
- 戦略的価値：統計的に有意な発現データ（p<0.05）を提供することで、疾患との関連性が強いターゲットを優先的に選択し、go/no-go決定の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：フォールドチェンジの大きさと再現性に基づき、miRNAベースのバイオマーカーや治療ターゲットのリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の留意点
- ヌクレアーゼによる分解を防ぎ、サンプルの完全性を確保するため、齧歯類の手術、RNAの取り扱い、およびqRT-PCRに関する専門知識が必要です。
- ホモジナイザー、遠心機、サーモサイクラー、および蛍光検出機能を備えたリアルタイムPCR装置へのアクセスが必要です。
- RNAの投入量（腎臓30 mg）、試薬量（溶解剤700 μL）、およびサイクリング条件（95°Cでの活性化、40サイクル）について、チーム間での標準化が必要です。
- アニーリング温度（55°C）および伸長温度（70°C）を一定に維持しつつ、特定のmiRNAターゲットに合わせてプライマーセットを適応させる必要があります。
- エンドポイントのRNA解析に限定されており、追加の手法を用いない限り、腎組織内での空間的解像度やシングルセル解像度は得られません。
