Name: 免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 学ぶマイクロRNA発現検出法を用いてIgA腎症マウスモデルの腎臓におけるマイクロRNA変化を検証する方法です。ヒト生検を不要とし、新たな診断・治療法開発への知見を提供します。

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この原稿の草稿を編集してくださったエダンツグループ(www.edanzediting.com)のサラ・ウィリアムズ博士に感謝します。

動物実験は、自治医科大学動物倫理委員会の承認を受けており、自治医科大学実験動物ガイドの実験動物の使用と管理に関するガイドラインに準拠しています。
1. HIGAマウスからの腎臓サンプルの採取
注:HIGAマウスは、25週齢8、9、10、11以降に安定したIgA腎症の表現型を示します。Balb / cマウスは、対照群8、9、10、11として選択されるべきである。25週齢の雌性HIGAマウス(n=10)および25週齢の雌性Balb/cマウス(n=10)を得た。実験に必要なマウスの数を事前に決めておく必要があります。このステップは、10匹のHIGAマウスと10匹のBalb / cマウスのサンプルサイズで約7〜8時間かかります。
<ol><li>HIGAマウス(25週齢、雌)、Balb/cマウス(25週齢、雌)、吸入麻酔器、イソフルラン、コルクシート、ピン、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、注射器、針、手術用ハサミ、鉗子をご用意ください。</li>
	<li>吸入麻酔装置でイソフルランを4%〜5%使用してHIGAマウスに麻酔をかけ、ピンを使用してコルクシートの背側に取り付けます。イソフルランの濃度を麻酔導入後の維持用量として2%〜3%に調整する。 注:麻酔の深さは、侵襲的処置に伴う痛みが完全に排除されるレベルに維持されます。特に、イソフルラン濃度は、胸部などの組織を切除する際に4〜5%に調整する必要があります。脱毛や眼軟膏は必須ではありません。手順をすばやく実行できる場合は、マウスを加熱パッドに取り付ける必要はありません。</li>
	<li>外科用ハサミと鉗子でマウスの腹壁を3〜4 cm正中切開し、腎臓の両側を注意深く識別します。</li>
	<li>肋骨と横隔膜を外科用ハサミと鉗子で切開し、心臓を露出させます。右心房を切開した後、腎臓の色が淡黄色に変わるまで左心室にPBSを注入します(この手順は、マウスの全身にPBSを灌流することを意味します)。</li>
	<li>腎動脈、腎静脈、尿管を切断し、腎臓を切除します。次のステップで使用するために腎臓を30 mgの小片に分割します。 注:IgA腎症の病理は、主に腎皮質(腎臓の外側部分)の糸球体を含みます。皮質と髄質を巨視的かつ完全に区別することは困難であるが、主に腎臓の外側部分を収集することが望ましい。これらのサンプルは、–80°Cで数ヶ月間保存できます。</li>
</ol>2. 腎臓サンプルからのトータルRNAの精製
注:このステップでは、市販のmiRNA単離キットを使用して全RNAを抽出します。また、生体高分子破砕スピンカラムも用いられる。詳細については、 材料表 を参照してください。miRNA単離キットには、シリカ膜ベースのスピンカラム、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬、グアニジン/エタノール洗浄バッファー(洗浄バッファー1)、エタノール洗浄バッファー(洗浄バッファー2)、およびヌクレアーゼフリー水が含まれています。このステップは、10匹のHIGAマウスと10匹の対照マウスのサンプルサイズに対して約3時間かかります。
<ol><li>1.5 mLまたは2.0 mLの収集チューブ、100%エタノール、クロロホルム、シリコンホモジナイザー、マイクロピペット、ピペットチップ、遠心分離機、生体高分子破砕スピンカラム、シリカメンブレンベースのスピンカラム、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬、グアニジン/エタノール洗浄バッファー(洗浄バッファー1)、エタノール洗浄バッファー(洗浄バッファー2)、およびヌクレアーゼフリー水。</li>
	<li>シリコンホモジナイザーと700 μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を使用して、室温で30 mgの腎臓サンプルをホモジナイズします。 注:サンプル中のmiRNAは、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬にさらされるまで脆弱であるため、これらのステップは迅速に実行する必要があります。</li>
	<li>ライセートをバイオポリマーシュレッダースピンカラムに移し、室温で15,000 x g で2分間遠心分離します。</li>
	<li>ろ液に140 μLのクロロホルムを加え、15秒間激しく混合します。2〜3分間放置した後、12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。</li>
	<li>中間層に触れずに透明な上清を新しい収集チューブにそっと移し、100%エタノールの決定量(下記参照)を追加します。5秒間の渦。 注:得られた上清の1.5倍の容量の100%エタノールが必要です。</li>
	<li>サンプル(上限700 μL)をシリカメンブレンベースのスピンカラムに移し、サンプルを室温で8,000 x gで15秒間遠心分離します。遠心分離後に濾液を廃棄する。</li>
	<li>700 μLの洗浄バッファー1をシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、カラムを室温で8,000 x gで15秒間遠心分離します。遠心分離後に濾液を廃棄する。</li>
	<li>500 μLの洗浄バッファー2をシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、室温で8,000 x gで15秒間遠心分離します。遠心分離後に濾液を廃棄する。</li>
	<li>500 μLの洗浄バッファー2をシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、室温で8,000 x gで15秒間遠心分離します。遠心分離後に濾液を廃棄する。</li>
	<li>シリカメンブレンベースのスピンカラムを何も添加せずに再度遠心分離し、追加のエタノールを除去し、15,000 x g で室温で1分間遠心分離します。遠心分離後に濾液を捨てる。</li>
	<li>スピンカラムに取り付けられているチューブを新しい回収チューブに交換します。</li>
	<li>ヌクレアーゼフリー水30 μLをシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、室温で8,000 x g で1分間遠心分離します。 注:得られた30 μL溶液には、高濃度のトータルRNAが含まれています。このサンプルは、–80°Cで数ヶ月間保存できます。</li>
</ol>3. 全RNAからのcDNA合成
注:このステップでは、市販の逆転写キットが使用されます。詳細については、 材料表 を参照してください。このキットには、核酸ミックス、逆転写酵素ミックス、およびバッファーが含まれています。この手順は、反応の進行を防ぐために氷上で実行する必要があります。このステップは、10匹のHIGAマウスと10匹の対照マウスのサンプルサイズに対して約3時間かかります。
<ol><li>1.5 mL 回収チューブ、8 ウェルストリップチューブ、マイクロピペット、ピペットチップ、分光光度計、ヌクレアーゼフリー水、氷、核酸ミックス、逆転写酵素ミックス、バッファー、サーマルサイクラーをご用意ください。</li>
	<li>分光光度計を用いて全RNAの濃度を測定します。次に、12 μLに1 μgの総RNAが含まれるように、ヌクレアーゼフリー水の必要量を計算します。</li>
	<li>2.0 μLの核酸ミックス、2.0 μLの逆転写酵素ミックス、および4.0 μLのバッファーを、サンプルあたり合計8.0 μLの内容でマスターミックスを調製します。</li>
	<li>8 μLのマスターミックスを8ウェルストリップチューブの各ウェルに加えます。</li>
	<li>3.2で計算されたヌクレアーゼフリー水の量で総RNAを希釈します。次に、12 μLの全RNA溶液(1 μgの総RNAを含む)を8ウェルストリップチューブの各ウェルに追加します。</li>
	<li>サーマルサイクラーを使用して、サンプルを8ウェルストリップチューブで37°Cで60分間インキュベートします。その後、サーマルサイクラーを使用して95°Cで5分間インキュベートします。 注:インキュベーション後の溶液には、高濃度のcDNAが含まれています。</li>
	<li>この溶液を1.5 mLチューブに移し、ヌクレアーゼフリー水200 μLを加えます。 注:得られた200 μLの溶液は、テンプレートcDNAとしてqRT-PCRに使用できます。このサンプルは、–80°Cで約1年間保存できます。</li>
</ol>4. マイクロRNAのqRT-PCR
注:このステップでは、市販のPCRキットを使用します。詳細については、 材料表 を参照してください。このキットには、PCRミックス、ユニバーサルプライマー、ヌクレアーゼフリーの水が含まれています。サンプルは重複して準備する必要があり、それぞれの場合に結果の正確さを考慮する必要があります。miRNAの発現レベルは、ΔΔCT法によって定量される。このステップは、10匹のHIGAマウスと10匹の対照マウスのサンプルサイズに対して約4時間かかります。
<ol><li>1.5 mL回収チューブ、96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレート用接着フィルム、マイクロピペット、ピペットチップ、PCRミックス、ユニバーサルプライマー、ヌクレアーゼフリー水、miRNA特異的プライマー、リアルタイムPCR装置をご用意ください。</li>
	<li>各ウェルに12.5 μLのPCRミックス、2.5 μLのユニバーサルプライマー、1.25 μLの5 μMのmiRNA特異的プライマー、および6.25 μLのヌクレアーゼフリー水を含むマスターミックスを調製します。 注:このアッセイでは、miRNA[RNA、U6小核2(RNU6-2)、miR-155-5p、miR-146a-5p、およびmiR-21-5p]に特異的なプライマーを使用しました。RNU6-2を内在性コントロール14として用いた。</li>
	<li>22.5 μLのマスターミックスを96ウェル反応プレートの各ウェルに加えます。</li>
	<li>ステップ3.7で調製した2.5 μLのcDNAを96ウェルプレートの個々のウェルに加えます。</li>
	<li>96ウェル反応プレートを接着フィルムで覆い、1,000 x g で30秒間遠心分離します。</li>
	<li>リアルタイム PCR 装置を実行します。PCR装置を次のようにプログラムします:95°Cで15分間の初期活性化、次に94°Cで15秒間の変性の40サイクル、55°Cで30秒間のアニーリング、および70°Cで30秒間の伸長。</li>
	<li>ΔΔCT法を用いて遺伝子発現を定量します。相対発現レベルは2–ΔΔCTとして決定されます。 注:異常なPCR増幅曲線は、結果から除外するために考慮する必要があります。</li>
</ol>

<ol><li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+Nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li>
<li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li>
<li>Wyatt, R. J., Julian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">IgA nephropathy.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).</li>
<li>Vishnoi, A., Rani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Biogenesis+and+Regulation+of+Diseases%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+therapeutics%3A+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).</li>
<li>Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+miR-148b+expression+promotes+aberrant+glycosylation+of+IgA1+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).</li>
<li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+a+retrospective+international+study%2C+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li>
<li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li>
<li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403(2019).</li>
<li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li>
<li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22The+Pharmacogenomics+Journal%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li>
<li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
<li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Markers%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li>
<li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209(2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+Win+the+Battle+with+RNase%22">How to Win the Battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

この新しい手法を用いて、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNAの発現量を測定することができました。IgA腎症は原因不明の疾患であり、その病因と治療標的を明らかにするためにさらなる研究が必要です1,3。ただし、ヒトの腎臓サンプルの取得は非常に侵襲的です。この新しい技術は、小動物を用いたIgA腎症の研究を可能にするという点で有利であり、IgA腎症およびmiRNAの将来の研究を容易にすると予想されます。将来的には、この方法はIgA腎症の治療のための新規miRNAの研究に適用できる可能性があります。HIGAマウスにおけるmiRNAの人工的な調節は、IgA腎症の表現型に影響を与える可能性があります。その場合、この方法はmiRNAの変化を検証するのに役立つ可能性があります。この方法は血清中のmiRNAの解析を目的としたものではありませんが、プロトコルを変更することで利用できる可能性があります。
この方法の理論的根拠は、以前の報告に基づいています。バイオ...

免疫グロブリンA(IgA)腎症は、腎糸球体メサンギウム領域1,2へのIgAの異常な沈着を特徴とする原発性糸球体腎炎の一種です。これは原発性糸球体腎炎の中で最も一般的であり、患者の20%〜40%で末期腎不全を引き起こします2。原因はまだ不明ですが、持続的な粘膜感染が関係しています1,3。コルチコステロイド、免疫抑制剤、およびレニン-アンジオテンシン系阻害剤が治療法として提案されています1,3が、完全には確立されていません3。したがって、IgA腎症の病因と治療法を明らかにするには、さらなる研究が必要です。
マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子発現の調節に重要な役割を果たす小さなノンコーディングRNAです4,5。miRNAは様々な疾患の病態形成に関与していることが報告されており、疾患バイオマーカーや治療薬として同定されているものもあります4,5。近年、miRNAとIgA腎症の病因との関連も報告されています2,6,7。例えば、miR-148bはIgA腎症患者のIgAの構造異常に関与していることが示され2,6,7、miR-148bとlet-7bはIgA腎症を検出するための新しいバイオマーカーとして文書化されました7。miRNAがIgA腎症に及ぼす影響を理解することは、病因と治療のさらなる解明に役立つ可能性がありますが2、小動物モデルを用いてIgA腎症のmiRNAをプロファイリングする標準的な方法はまだ確立されていません2。
我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNA発現量を簡便かつ信頼性の高い方法で測定した。HIGAマウスは、腎糸球体8,9,10,11において特に高レベルの血清IgAとIgAの異常沈着を示す特徴的なddY株である。したがって、HIGAマウスは、IgA腎症モデルマウス8、9、10、11として用いることができる。私たちの方法は4つの主要なステップで構成されています:まず、HIGAマウスから腎臓サンプルを外科的に取得します。第二に、サンプルをホモジナイズし、シリカ膜ベースのスピンカラムを使用してトータルRNAを精製します。第三に、逆転写を用いて全RNAから相補的DNA(cDNA)を合成する。第四に、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)によるmiRNAの発現レベルの検出。この方法の理論的根拠と結果の信頼性は、以前の報告12,13に基づいています。本手法は、IgA腎症マウスモデルにおけるmiRNAの発現量を正確に測定するための有用な技術であり、今後のIgA腎症におけるmiRNAの研究に役立つ可能性があることを示しています。

<table><tbody><tr><td>BALB/cCrSlc(生後25週、メス)</td><td>日本SLC株式会社</td><td>none</td><td>制御用マウス</td></tr><tr><td>HIGA/NscSlc (25週齢, 雌)</td><td>株式会社日本SLC</td><td>none</td><td>IgA腎症マウスモデル</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学式 qRT-PCR用96ウェル反応プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4316813</td><td>96ウェル反応プレート</td></tr><tr><td>MicroAmp光学接着フィルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4311971</td><td>96ウェル反応プレート用接着フィルム</td></tr><tr><td>miScript II RTキット</td><td>Qiagen</td><td>218161</td> cDNA miRNeasy Mini<td>合成用実験キット</td></tr><tr><td>キット</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>全RNAのFOT抽出</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>miRNA特異的プライマー</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00001701</td><td>miRNA特異的プライマー</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>miRNA特異的プライマー</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay(miR-21-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>miRNA 特異的プライマー</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>リアルタイム PCR 実験キット</td></tr><tr><td>QIA シュレッダー</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>生体高分子シュレッダー スピンカラム</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex リアルタイム PCR システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4472380</td><td>リアルタイム PCR 装置</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex ソフトウェアバージョン1.2.1。</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4472380</td><td>リアルタイムPCR装置ソフトウェア</td></tr><tr><td>takara biomasher standard</td><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>シリコンホモジナイザー</td></tr></tbody></table>

免疫グロブリンa腎症マウスの腎臓におけるマイクロrna発現の検出

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

免疫グロブリンA(IgA)腎症は、IgAの異常な沈着を特徴とする原発性糸球体腎炎の一種であり、末期腎不全を引き起こします。近年、IgA腎症の病態形成にマイクロRNA(miRNA)の関与が報告されています。しかし、小動物モデルを用いてIgA腎症のmiRNAをプロファイリングする方法は確立されていません。そこで、IgAモデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNAを解析するための信頼性の高い方法を開発しました。このプロトコルの目的は、対照マウスの腎臓におけるレベルと比較した場合に、HIGAマウスの腎臓におけるmiRNAの変化した発現レベルを検出することである。簡単に言うと、この方法は4つのステップで構成されています:1)HIGAマウスから腎臓サンプルを取得します。2)腎臓サンプルからトータルRNAを精製する。3)全RNAから相補的DNAを合成する工程;4)miRNAの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)。この手法を用いて、HIGAマウスの腎臓における複数のmiRNA(miR-155-5p、miR-146a-5p、miR-21-5p)の発現量を検出することに成功しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAをプロファイリングする他の研究にも適用できます。

HIGAマウス(n=10)の腎臓におけるmiRNAの発現量を調べました。この結果は、記載されたプロトコルに完全に基づいて得られた。Balb/cマウスの腎臓を対照として選択した(n=10)。両方のグループで、25週齢が選択されました。雌のHIGAマウスのみがサプライヤーから入手可能でした。3つのmiRNA(miR-155-5p、miR-146a-5p、およびmiR-21-5p; 図1)が検出され、これは以前にIgA腎症に関連することが報告されていた15、16。2つのグループの相対的なmiRNA発現レベルをt検定を使用して比較し、P &lt; 0.05が統計的に有意でした。miR-155-5pは対照群と比較してHIGA群で3.3倍高いレベルで発現し(P &lt; 0.001)、miR-21-5pはHIGA群で1.58倍高いレベルで発現しました(P = 0.007)。miR-146a-5pの発現は両群間で有意差はなかった。
<p class="jove_con...

マイクロRNAはIgA腎症の病態形成に関与しています。我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるマイクロRNA発現レベルを確実に検出する方法を開発しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAの関与をチェックすることを容易にします。

免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

この方法を用いることで、IGA腎症におけるマイクロRNAの変化を小動物モデルを用いて簡便に確認することができ、ヒト腎生検を行わずにIGA腎症の研究が可能となります。このプロトコルは、IGA腎症の遺伝学に関する新たな洞察を提供することができ、腎臓病の新しい診断法や新しい治療法の発見に役立つ可能性があります。マウスが適切に麻酔されていることを確認した後、外科用ハサミと鉗子を使用して、マウスの腹壁に3〜4センチメートルの正中線切開を行い、腎臓の両側を特定します。肋骨と横隔膜を切開して心臓を露出させます。右心房を切開した後、マウスの全身にPBSが灌流されていることを示す腎臓の色が淡黄色に変わるまで、左心室にPBSを注入します。腎動脈、腎静脈、尿管を切開し、腎臓を摘出します。シリコンホモジナイザーと700マイクロリットルのフェノールグアニジンベースの溶解試薬を使用して、室温で30ミリグラムの腎臓サンプルをホモジナイズします。ライセートを生体高分子シュレッダースピンカラムに移し、室温で15, 000Gで2分間遠心分離します。原稿の指示に従ってRBNA精製を続けます。最終洗浄後、シリカ膜ベースのスピンカラムに30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、それを8, 000Gで1分間遠心分離してRNAを溶出させます。cDNA合成には、2マイクロリットルの核酸ミックス、2マイクロリットルの逆転写酵素ミックス、および4マイクロリットルのバッファーをサンプルあたり合計8マイクロリットルのマスターミックスを調製します。8マイクロリットルのマスターミックスを8ウェルチューブストリップの各ウェルに加えます。全RNAをヌクレアーゼフリー水で希釈します。次に、12マイクロリットルの全RNA溶液をストリップの各ウェルに加えます。サンプルをサーモサイクラーに入れ、摂氏37度で60分間インキュベートし、次に摂氏95度で5分間インキュベートします。定量的なリアルタイムPCRを行うには、原稿の指示に従ってマスターミックスを調製し、96ウェル反応プレートの各ウェルに22.5マイクロリットルのマスターミックスを加えます。調製したcDNAを2.5マイクロリットルを各ウェルに加えます。反応プレートをリアルタイムPCR装置に入れます。次に、摂氏95度で15分間の初期活性化、続いて摂氏94度で15秒間の変性サイクルを40サイクル、摂氏55度で30秒間アニール、摂氏70度で30秒間の伸展をプログラムします。デルタデルタCT法を用いて遺伝子発現を定量化します。このプロトコルは、Balb/cマウスの腎臓をコントロールとして使用して、HIGAマウスの腎臓におけるmicroRNAの発現レベルを調査するために使用されました。3つのIGA腎症関連マイクロRNAの発現レベルを測定しました。2つのグループの相対的なmicroRNA発現レベルをT検定を使用して比較し、Pが0.05未満であれば統計的に有意であった。miR-155-5pは対照群と比較してHIGA群で3.3倍、miR-21-5pは1.58倍高発現しました。miR-1461-5pの発現は、両群間で有意差は認められませんでした。このプロトコールを試みる際には、マスク、手袋、キャップを着用し、環境中のヌクレアーゼが実験に影響を与えるのを防ぐために、実験室のテーブルとツールを清潔に保つことが重要です。この実験手法は、現在、当研究室で実用化されています。IGA腎症の新しい診断法と治療法を確立することが目標です。

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JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この記事では、ホルマリン固定腎臓切片にマイクロRNA発現の比色検出のために最適化されたin situハイブリダイゼーションプロトコルについて説明します。...

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ここでマウスの体内でビオチンと腎糸球体細胞表面タンパク質のラベリングのためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。...

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この記事では、定量的なリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、急性腎障害マウスモデルの腎臓におけるマイクロRNA発現を検出するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、虚血性腎障害マウスモデルとマイクロRNAサンプルの慎重な抽出に重点を置いています。...

虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内microRNAの定量的検出法

一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。...

一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価

加齢性腎機能障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現を定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を提示する。...

加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価

ここでは、いくつかの腎臓病モデルマウスにおいて、非ウイルスベクターとポリエチレンイミンナノ粒子の尾静脈注射 を介して 、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物を腎臓に送達します。これにより、腎臓における標的miRNAの有意な過剰発現がもたらされ、その結果、いくつかのマウスモデルにおいて腎臓病の進行が抑制された。...

いくつかの腎臓病モデルマウスにおけるポリエチレンイミンナノ粒子を用いた外因性人工合成miRNA模倣体の腎臓への送達

本プロトコールは、マウスにおけるループス進行を追跡する方法を記載する。腎臓における細胞浸潤およびタンパク質沈着に基づいて狼瘡腎炎を特徴付けるために、2つの追加の手順が提示される。...

狼瘡を起こしやすいMRL/lprマウスにおけるタンパク質尿、白血球の腎浸潤、およびタンパク質の腎沈着の解析

この研究は、免疫グロブリンA腎症(IgAN)をDioscin(DIO)で治療するための実験データを提供します、 Dioscin (DIO)、 DioDio 、漢方薬の効果と基礎となるメカニズムを研究するためのパラダイム in vivo および in...

in vivoでのB細胞活性化の阻害とin vitroでのガラクトース欠損IgA1産生の減少によるジオシン媒介性IgA腎症の緩和

このプロトコルは、マウスで片側尿管閉塞(UUO)を誘発する方法を説明しています...

腎臓間質性線維症を調査するための片側尿管閉塞モデル

学ぶマイクロRNA発現検出法を用いてIgA腎症マウスモデルの腎臓におけるマイクロRNA変化を検証する方法です。ヒト生検を不要とし、新たな診断・治療法開発への知見を提供します。

免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出

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