Name: オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学ぶヒト肺上皮前駆細胞の単離・濃縮法。組織解離と細胞分画技術を用いて、近位・遠位肺領域から生存性の高い上皮前駆細胞を抽出し、3Dオルガノイド培養による肺疾患モデル構築と創薬プラットフォームとして活用できます。

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IFCおよびHおよびE染色の水野貴子、組織切片のヴァネッサ・ガルシア、原稿作成の支援に対するアニカ・S・チャンドラセカランのサポートに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(5RO1HL135163-04、PO1HL108793-08)とセルジーンIDEALコンソーシアムによってサポートされています。

ヒト肺組織は、国際医学振興研究所(IIAM)が開発し、シダーズ・シナイ医療センター内部審査委員会によって承認された同意手順に従って、死亡した組織ドナーから入手した。
1. 気管気管支または小気道/実質(小気道および肺胞)領域から肺細胞を単離するための組織処理
<ol><li>細胞単離の1日前に、すべての解剖器具、ガラス製品、および適切な溶液を準備してオートクレーブします。</li>
	<li>肺組織を受け取ったら、近位領域と遠位領域を同定して分離する。気管と気管支は「近位」と見なされます。このプロトコルの目的のために、気管および気管支の最初の2〜3世代が解剖され、「近位」気道上皮の単離に使用される。直径2mm以下の小さな気道および周囲の実質組織は、このプロトコールの目的上、「遠位」肺上皮と見なされる(図1A)。 注:ヒト肺組織の処理を含むすべての手順は、適切な個人用保護具を使用してバイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。</li>
</ol>2. 遠位肺組織からの小気道および肺胞上皮前駆細胞の濃縮およびサブセット化
<ol><li>遠位組織調製<ol>
<li>遠位肺組織を滅菌ペトリ皿(150 x 15 mm)に入れます。組織を約1cm3 個にサイコロで割って、清潔な50mLチューブに入れます。</li>
		<li>冷却したHBSSで組織を3x洗浄し、その都度HBSS洗浄物を廃棄し、血液および上皮内層液を除去する。</li>
		<li>ティッシュを新しいペトリ皿に入れ、滅菌した糸くず防止ワイプで拭き取って乾かします。鉗子やはさみを使って、できるだけ多くの内臓胸膜(肺の表面を覆う繊細な透明な膜)を取り除きます。</li>
		<li>はさみを使用して、組織を直径約2mmの断片に細かく刻みます。ミンチ組織を清潔なペトリ皿に移し、滅菌片面カミソリブレードでおおよそ1mmの大きさに刻んでさらにミンチします。</li>
	</ol></li>
	<li>酵素消化 注:リベラーゼストック溶液は5 mg/mL(100x)で、DNaseストックは2.5 mg/mL(100x)です(材料表)。<ol>
<li>50 μg/mL のリベラーゼと 25 μg/mL の DNase を 50 mL の円錐管内の滅菌 HBSS に加えます。</li>
		<li>約2〜3gのミンチ組織を、リベラーゼおよびDNaseを含む25mLのHBSSを含む新しい50mL円錐形チューブに移す。900rpmに設定したミキサーを用いて連続振とうしながら37°Cで40〜60分間インキュベートする。30分間のインキュベーション後、塊の形成を避けるために針のない30mLシリンジを使用して消化組織をトリチュレートし、インキュベーションを続行する。 注:酵素とのインキュベーション時間は、組織の種類または状態によって変化し得る。例えば、正常組織の酵素消化には約45分かかる。しかしながら、特発性肺線維症サンプルからの線維性組織は、最大60分のより長いインキュベーション時間を必要とし得る。したがって、FACSにとって極めて重要な表面マーカーの損傷を防ぐために、このステップ中に組織を注意深く監視してください。</li>
	</ol></li>
	<li>単一細胞分離<ol>
<li>30mLシリンジに取り付けられた16G針を通して5xを引いて組織をトリチュレートする。組織懸濁液を広口径ピペットに引き出し、真空圧力下で一連の細胞ストレーナー(500 μm、300 μm、100 μm、70 μm、40 μm)を通過させます。ストレーナーを20mLのHBSS+バッファーで洗浄し、残りの細胞を回収します。HBSS+バッファーのレシピは、材料表に記載されています。
</li>
		<li>等量のHBSS+バッファーを濾液に45分後に加え、リベラーゼ活性を阻害し、過剰消化を防止します。</li>
		<li>遠心分離機濾液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離する。 上清を慎重に取り除き、廃棄します。ペレットに1mLの赤血球(RBC)溶解バッファーを加え、チューブを静かに揺らしてペレットを脱ぎ捨て、氷上で1分間インキュベートする。 注:RBC溶解溶液中の量および時間は、ペレットのサイズに依存する。標的細胞の溶解を防ぐために、氷上で細胞を維持し、RBC溶解溶液中の時間を注意深く監視することが重要です。RBC溶解が不十分な場合は、この手順を繰り返します。</li>
		<li>10 ~ 20 mL の HBSS+ バッファーを加えて、RBC 溶解バッファーを中和します。遠心分離機濾液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離する。</li>
		<li>溶解した赤血球(ゴースト細胞)が細胞ペレットの上に白濁層を形成する場合は、ペレットを10 mLのHBSS+バッファーに再懸濁し、懸濁液を70 μmのセルストレーナーでこすり、ゴースト細胞を除去します。濾液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、さらにステップを進める。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫細胞および内皮細胞の枯渇(任意の工程)<ol>
<li>モノクローナル抗ヒトCD31およびCD45抗体(アイソタイプマウスIgG1)およびLSカラムにコンジュゲートしたCD31&CD45マイクロビーズを用いて、全細胞のプールからCD31+ 内皮細胞およびCD45+ 免疫細胞を枯渇させる(材料表)。</li>
		<li>主に上皮細胞と間質細胞からなるフローを新鮮な滅菌チューブに集め、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 セル数を実行して、フロースルー内のセルの総数を確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光関連細胞ソーティング(FACS)のための細胞表面染色<ol>
<li>HBSS+ バッファー 1 mL あたり 1 x 107 個の細胞を再懸濁します。必要な濃度で一次抗体を添加し、暗所で4°Cで30分間細胞をインキュベートします。本研究では、特に断りのない限り、フルオロフォア結合一次抗体を使用した。抗体源および力価の詳細は、 材料表に記載されている。 注:HTII-280は現在、遠位肺細胞を主に気道(HTII-280-)および肺胞2型(HTII-280+)細胞画分にサブセットすることを可能にする最良の表面反応性抗体です。この戦略の注意点は、AT1細胞はこの方法を使用して染色されず、その脆弱性のためにあまり表現されないことである。しかしながら、AT1細胞は、おそらくFACSによる生細胞の選択中のそれらの脆弱性および損失のために、遠位肺プレップにおいてほとんど発現されず、したがって気道細胞画分のまれな汚染物質のみを表す。</li>
		<li>3 mLのHBSS+バッファーを加えて細胞を洗浄し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
		<li>コンジュゲートされていない一次抗体を使用する場合は、必要な濃度の適切なフルオロフォアコンジュゲート二次抗体を追加し、氷上で30分間インキュベートします。3mLのHBSS+緩衝液を加えて過剰の二次抗体を洗い流し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を捨て、1 x107 cells/mLあたりHBSS+バッファーに細胞を再懸濁します。ストレーナーキャップを通して細胞を5mLポリスチレンチューブにろ過し、単一細胞懸濁液の形成を確実にします。DAPI(1 μg/mL)を加えて透過性(死細胞)を染色する。 注:FACS中の偽陽性を最小限に抑えるために、適切な単色および蛍光マイナス1(FMO)コントロール(すなわち、抗体染色カクテルから各1抗体を引いたもの)を使用することが不可欠です。この研究では、蛍光色素間の発光スペクトルの重なりに対する経験的補償のために、正選択ビーズおよび負選択ビーズを使用しました(材料表)。FACSは、関心のある細胞型を豊かにする。生存可能な上皮細胞は、それらのCD45陰性、CD31陰性、CD236陽性細胞表面表現型およびDAPIの陰性染色に基づいて濃縮される。この上皮細胞画分は、AT2細胞について富化されているHTII−280陽性細胞に対する特異的染色などの、細胞型特異的表面マーカーに対する染色に基づいてさらにサブセット化され得る。対照的に、HTII-280のネガティブセレクションは、クラブ細胞や繊毛細胞などの小さな気道上皮細胞の濃縮を可能にする(図2)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 気管気管気道からの上皮前駆細胞の濃縮とサブセット化
<ol><li>組織調製<ol>
<li>肺から近位気道(気管/気管支)を解剖する。はさみを使用して内腔を露出させ、組織を完全に覆うために50μg/mLのリベラーゼを加えて、その長さに沿って気道を開きます。</li>
		<li>900rpmに設定したサーモミキサーを用いて連続振とうしながら37°Cで20分間インキュベートする。</li>
		<li>遠心管から近位気道を取り外し、滅菌ペトリ皿(150 x 15 mm)に入れます。メスを使用して気道の表面を静かにこすり、組織から管腔上皮細胞を完全に剥ぎ取ります。</li>
		<li>5 mLの滅菌HBSS+バッファーでシャーレを洗浄し、脱落したすべての管腔上皮細胞を収集し、脱落した細胞を50 mL円錐形遠心管に移します。10 mL シリンジに取り付けた 16 G 針と 18 G 針を通して 5x を引いて懸濁液をトリチュールし、単一細胞懸濁液を得ます。</li>
		<li>懸濁液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離する。 ペレットを新鮮なHBSS+バッファーに再懸濁し、これらの管腔気道細胞を氷上に保存して、今後のステップでミンチ近位気道から生成された単一細胞懸濁液と組み合わせる準備ができています。</li>
		<li>はさみを使用して、残りの気管気管支組織をリングに沿って切断して小さな組織のストリップを生成し、ストリップを新鮮なペトリ皿に移します。片面のカミソリの刃を使用してティッシュストリップをミンチし、より小さな部分を作ります。 注:近位気道は軟骨性であるため、遠位肺組織ほど細かく細かく細切ることはできません。</li>
		<li>ミンチ組織をCチューブに移し、2mLのリベラーゼをチューブに加え、組織が水没することを確認する。Cチューブを自動解離器にロードし、ヒト肺プロトコル-2を実行して組織をさらに機械的に解離させます。 注:このプロトコルで使用される解離器は、この特定のアプリケーション向けにヒト肺protocol-2と呼ばれる最適化されたプログラムを提供します( 材料表を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>酵素消化と単一細胞単離<ol>
<li>約2gのミンチ近位組織をCチューブから各50mL円錐形遠心チューブに移し、50μg/mLリベラーゼおよび25μg/mLDNase溶液を各チューブに加える。 メモ:効率的な解離を確実にするために、チューブは30 mLマークを超えて充填しないでください。</li>
		<li>ミンチ組織を37°Cで45分間インキュベートし、900rpmに設定したミキサーを用いて連続振とうした。</li>
		<li>解離した組織懸濁液を、上記のように真空圧力下で一連のセルストレーナー(500 μm、300 μm、100 μm、70 μm、40 μm)に通し、流れを回収する。ストレーナーを20mLのHBSS+バッファーで洗浄し、残りの細胞を回収します。 注:近位組織は遠位組織と比較して軟骨性でかさばるため、フィルターの目詰まりの可能性が高くなります。漏斗を使用すると、ストレーナーを通過する際の液体の溢れ出しを防ぐのに役立ちます。</li>
		<li>等量のHBSS+バッファーを濾液に加え、リベラーゼ活性を阻害し、過剰消化を防ぎます。このステップで、単離した3.1.5の近位気道細胞を細胞懸濁液に加える。</li>
		<li>結合した細胞懸濁液を500 x gで10分間遠心分離する。上清を除去し、HBSS+バッファーで細胞洗浄を繰り返します。2.4で上記のようなCD45+免疫細胞およびCD31+内皮細胞の枯渇を行う(任意の工程)。</li>
		<li>染色の方法は遠位肺組織と同様であり、2.5のステップに従う。生存可能な上皮細胞を、それらのCD45陰性、CD31陰性、CD236陽性細胞表面表現型およびDAPIの陰性染色に基づいて濃縮する。</li>
		<li>さらに、NGFRなどの細胞型特異的表面マーカーの染色に基づいて上皮細胞画分をサブセットし、基底(NGFR陽性)および非基底(NGFR陰性;分泌、繊毛、神経内分泌)細胞型の濃縮を可能にする(図3)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. オルガノイド培養
<ol><li>5,000個(この数は、上皮オルガノイドの所望の密度を得るために調整することができる)を選別した近位または遠位上皮細胞を、7.5 x104 個のMRC-5細胞(ヒト肺線維芽細胞株)と共に滅菌1.5mLチューブに加える。上皮間葉相互作用は、前駆細胞の拡張に重要である。</li>
	<li>500 x g で4°Cで5分間遠心分離する。 注:オルガノイドコロニー形成効率を正確に確保するために、ソーターから得られた細胞数を手動で確認することが重要です。</li>
	<li>上清を慎重に取り出して廃棄し、抗生物質を添加した50μLの氷冷培地に細胞ペレットを再懸濁する。細胞懸濁液を氷上に保ちます。</li>
	<li>氷冷1x成長因子枯渇基底膜マトリックス培地50μLをバイアルに加え、懸濁液を氷上で穏やかにピペットでピペットして混合する。 注:基底膜マトリックス媒体の早期重合を避けるために、氷冷培地を使用し、氷上で細胞を維持することが重要です。</li>
	<li>気泡の導入を避けるように注意しながら、細胞懸濁液を24ウェルプレート(1.4 x 104 cells/cm2)の0.4 μm孔径の細胞培養インサートに移します。</li>
	<li>マトリックスが固まるように37°Cで30〜45分間インキュベートします。</li>
	<li>予め加温した増殖培地600 μLをウェルに加える。 注:培地には、播種後最初の24時間は抗真菌剤(0.4%)およびペン連鎖球菌(1%)を、最初の72時間は10μMのRhoキナーゼ阻害剤を補充した。</li>
	<li>5%CO2 インキュベーター中で37°Cで30日間培養し、その間、培地を48時間ごとに交換する必要があります。 注:培養期間は、実験の目的に基づいて変更することができます。より長いエンドポイントは分化の研究に使用されますが、実験の目的が完全な分化を達成することではない場合は、7日、14日などの短いエンドポイントを使用できます。</li>
	<li>10 μM TGFβ阻害剤を培養液に15日間添加して、細胞を増殖期に維持し、線維芽細胞の過剰増殖を抑制する。 注:アッセイに使用した培地によって結果は異なります。例えば、本明細書に示される結果は、Pneumacult−ALI培地を用いて生成され、これは、遠位肺からの大きなオルガノイド、近位肺からの十分に分化したより大きなオルガノイドの生成をもたらす。</li>
</ol>5. オルガノイド染色
<ol><li>オルガノイドの固定と埋め込み<ol>
<li>上部と下部の両方の膜貫通挿入チャンバーから媒体を吸引し、温かいPBSで1回すすいでください。</li>
		<li>培養物を固定するには、300 μL の PFA (2% w/v) をインサートに、500 μL をウェルに入れ、37°C で 1 時間培養します。 固定液を取り出し、ベースメムト膜マトリックスプラグをはがさないように注意しながら、温かいPBSですすいでください。 注:固定オルガノイドは、さらなるステップを開始する前に、4°CのPBSに1〜2週間沈めて保存することができます。</li>
		<li>PBSを吸引し、インサートを反転させ、その周囲の周りにインサート膜を慎重に切断する。鉗子を使用して、マトリックスプラグを乱さないように注意しながら、トランスウェル膜を取り外します。</li>
		<li>シャーレで、インサートをタップしてマトリックスプラグを回収します。</li>
		<li>マトリックスプラグにヒストーゲル(37°Cに維持)などの検体処理ゲルを1滴加え、ゲルが固化するまで4°Cに維持する。</li>
		<li>プラグを包埋カセットに移し、エタノール(70、90および100%)の濃度を増加させて脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンワックスに包埋する。</li>
		<li>ミクロトーム上で7μmの切片を切り取り、正に帯電したスライドに集める。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オルガノイドの免疫蛍光染色<ol>
<li>スライドを65°Cで30分間置き、脱ろうします。</li>
		<li>キシレンに浸漬して切片を脱パラフィン化し、エタノール濃度を下げて再水和する。</li>
		<li>抗原マスク解除溶液中で高温抗原検索を行い、市販のレトリーバーを用いてクエン酸塩基溶液にスライドを15分間浸漬した(材料表)。</li>
		<li>パップペンを使用して疎水性バリアで組織を囲みます。</li>
		<li>一次抗体と組織との間の非特異的染色をブロック、ブロッキングバッファー中でインキュベートすることによって。</li>
		<li>インキュベーション溶液で希釈した一次抗体の適切な濃度で切片を加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートする。</li>
		<li>切片3xを洗浄緩衝液で室温ですすいでください。</li>
		<li>蛍光色素結合二次抗体を適切な濃度で室温で1時間インキュベートする。</li>
		<li>切片を室温で3倍すすぎ、0.1%トゥイーン20TBSで切片をすすぎ、切片をDAPI(1 μg/mL)中で5分間インキュベートします。切片を0.1%Tween 20でTBS(トリス緩衝生理食塩水)に1回すすぎ、乾燥させて取り付け液に取り付けます(図4 および 図5)。 注:免疫蛍光染色に使用される一次抗体および二次抗体のソースおよび最適な作業希釈は、 材料表に含まれています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者は開示するものは何もありません。

我々は、分子的または機能的解析および疾患モデリングのために、ヒト肺組織から肺細胞の定義された部分集団を単離するための信頼できる方法を説明する。方法の重要な要素には、新たに単離された細胞の抗体媒介濃縮を可能にする表面エピトープの保存による組織解離を達成する能力、および領域特異的上皮オルガノイドの効率的な生成のための培養方法の最適化が含まれる。我々は、三次元培養において間質支持細胞と再結合したときにオルガノイドを形成できる上皮前駆細胞の回収と濃縮に焦点を当てています。これらの培養物におけるオルガノイドのクローン性を定義しなかったにもかかわらず、単離されたマウス肺上皮前駆細胞を用いて実施された同様の研究は、異なる蛍光レポーターを保有する細胞の混合培養物の使用に基づいてクローン学的に示された22,23。
本明細書に記載の方法は、消化された肺組織からの細胞回収を改善することを意図した適応を含む。消化されたサンプルを16ゲージの針に通し、残りの未消化の凝集塊をさらに破壊し、均質...

ヒト呼吸器系の空域は、ガスの輸送およびそれに続く上皮 - 微小血管障壁を横切るそれらの交換をそれぞれ媒介する伝導ゾーンおよび呼吸ゾーンに大別することができる。伝導気道には気管、気管支、細気管支および末期細気管支が含まれ、呼吸空気空間には呼吸細気管支、肺胞管および肺胞が含まれる。これらの空域の上皮ライニングは、機能的に異なる各ゾーンの固有の要件に対応するために、近位 - 遠位軸に沿った組成の変化。気管気管気道の偽層化上皮は、ブラシ、神経内分泌およびイオノサイトを含むあまり豊富ではない細胞型に加えて、基底、分泌および繊毛の3つの主要な細胞型からなる1,2,3。細気管支気道は形態学的に類似した上皮細胞型を有するが、その豊富さと機能的特性には区別がある。例えば、基底細胞は細気管支気道内ではあまり存在せず、分泌細胞は、気管気管支気道において優勢な漿液性および杯細胞と比較して、クラブ細胞の割合が高い。 呼吸帯の上皮細胞は、肺胞管および肺胞のI型(ATI)およびII型(ATII)細胞に加えて、呼吸器細気管支における定義が不十分な直方体細胞型を含む1,4。
各ゾーンにおける上皮の維持および再生に寄与する上皮幹および前駆細胞型の同一性は、不完全に記載されており、動物モデル5、6、7、8の研究から大部分が推測される。マウスにおける研究は、偽層化気道の基底細胞、または細気管支気道のクラブ細胞または肺胞上皮のATII細胞のいずれかが、無制限の自己複製および多能性分化の能力に基づいて上皮幹細胞として機能することを示している7,9,10,11,12 .ヒト肺上皮細胞型の幹性を評価するための遺伝的系統追跡研究を行うことができないにもかかわらず、上皮幹および前駆細胞の機能的可能性を評価するためのオルガノイドベースの培養モデルの利用可能性は、マウスとヒトとの間の比較研究のためのツールを提供する13,14,15,16,17。
我々は、ヒト肺の異なる領域から上皮細胞型を単離し、その培養物を3Dオルガノイド系を用いて局所細胞型を要約する方法について記載する。同様の方法が、他の器官系からの上皮細胞の機能解析および疾患モデリングのために開発されている18、19、20、21。これらの方法は、局所上皮前駆細胞の同定のためのプラットフォームを提供し、それらの調節および微小環境を調査する機構的研究を実行し、疾患モデリングおよび創薬を可能にする。動物モデルで行われた肺上皮前駆細胞の研究は、in vivoまたはin vitroのいずれかで解析の恩恵を受けることができますが、ヒト肺上皮前駆細胞の同一性に関する洞察は、モデル生物からの外挿に大きく依存しています。このように、これらの方法は、ヒト肺上皮細胞型の同一性および挙動を、幹/前駆細胞の調節を調査する研究と関連付けるための橋渡しを提供する。

<table><tbody><tr><td>細胞単離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 滅菌シリンジ、ルアーロックチップ</td><td>フィッシャー科学</td><td>BD 309646</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 滅菌シリンジ、ルアーロックチップ</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td></td></tr><tr><td>バイオハザードバッグ</td><td>VWR</td><td>89495-440</td><td></td></tr><tr><td>バイオハザードバッグ</td><td>VWR</td><td>89495-440</td><td></td></tr><tr><td>コネクティングリング</td><td>プルリセレクト</td><td>41-50000-03</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ (ロット#SLBF7798V)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿</td><td>コーニング/ファルコン</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>ファンネル</td><td>プルリセレクト</td><td>42-50000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>コーニング</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼ TM 研究グレード</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>ニードル 16G</td><td>VWR</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>ニードル 18G</td><td>VWR</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 100 & マイクロ;m(セルストレーナー)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50100-51</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 300 & micro;m(セルストレーナー)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50300-03</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 40 & micro;m(セルストレーナー)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50040-51</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 500 & micro;m(セルストレーナー)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 70 & micro;m (Cell Strainer)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50070-51</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades VWR</td><td></td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Equipment'GentleMACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C チューブ</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>ライカ ASP 300s ティッシュプロセッサ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS カラム</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand**</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>05-412-503</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>05-412-503</td><td></td></tr><tr><td>HBSS+ バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15290018</td><td>2ml</td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)、pH 8.0、RNase-free</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>AM9260G</td><td>500&micro;l</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td>100-106</td><td>10ml</td></tr><tr><td>HBSS ハンクのバランスの取れた塩溶液 1X 500 ml</td><td>VWR</td><td>45000-456</td><td>500ml ボトル</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>15630080</td><td>5ml</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン (PSN) 抗生物質混合物</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>15640055</td><td>5ml</td></tr><tr><td>のリストFACS</td><td></td><td></td><td></td>の抗体</tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>369820</td><td>1:50</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB552843</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td>20&micro;l / 107 全細胞</td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>20&micro;l/ 107 全細胞</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>FITC 抗ヒト CD235a</td><td>BioLegend</td><td>349104</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC 抗ヒト CD31</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC 抗ヒト CD45</td><td>BioLegend</td><td>304054</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC 抗マウス IgM 抗体</td><td>BioLegend</td><td>406506</td><td>1:500</td></tr><tr><td>マウスIgM抗ヒトHT2-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>1:300</td></tr><tr><td>PE抗ヒトCD271(NGFR)</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td>1:50</td></tr><tr><td>オルガノイド培養培地の</td><td></td><td></td><td></td>組成</tr><tr><td>MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult -ALI</td><td>Medium Stemcell Technologies</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>小気道上皮細胞増殖培地</td><td>PromoCell</td><td>C-21170</td><td></td></tr><tr><td>ThinCert 組織培養インサート、滅菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662641</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK阻害剤) 100mM ストック (1000x)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>マウス基礎培地:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>サイエンティフィ</td>ック <td>15290018 50 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>DMEM/F-12、HEPES</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>11330032</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ジェミニ バイオ製品</td><td>100-106</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>インスリン - トランスフェリン - セレン (ITS -G) (100X)</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>41400045</td><td>500 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン(PSN)抗生物質混合物</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>15640055</td><td>500 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>SB431542 TGF-&β; 経路阻害剤 (ストック 100 mM)</td><td>幹細胞</td><td>72234</td><td>5 &micro;l</td></tr><tr><td>免疫組織化学</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原アンマスキング溶液、クエン酸ベースの</td><td></td><td>ベクターH-3300</td><td>937 &microの抗体のリスト。l in 100ml water</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti HT2-280</td><td>Terracebiotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXJ1 モノクローナル抗体 (2A5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-9965-82</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody</td><td>R and D systems</td><td>MAB4218</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059]</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td>1:500</td></tr><tr><td>MUC5AC モノクローナル抗体 (45M1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-12178</td><td>1:300</td></tr><tr><td>PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1)</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C143022-100</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-E-Cadherin</td><td>BD biosciences</td><td>610182</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Sox-2 抗体</td><td>Santa Cruz biotechnologies</td><td>sc-365964</td><td>1:300</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit lgG, 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FITC anti-mouse IgM Antibody</td><td>BioLegend</td><td>406506</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21113</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG1交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21121</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG2a交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21131</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG2a交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 568</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21134</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG2b交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21144</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunohistochemistry Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)</td></tr><tr><td>免疫組織化学インキュベーション溶液</td><td></td><td></td><td>3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS</td></tr><tr><td>免疫組織化学洗浄液</td><td></td><td></td><td>TBS、0.1%Tween 20</td></tr></tbody></table>

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

上皮オルガノイドモデルは、臓器系の基本的な生物学を研究し、疾患モデリングのための貴重なツールとして役立ちます。オルガノイドとして増殖すると、上皮前駆細胞は自己更新し、 in vivo 対応物と同様の細胞機能を示す分化後代を生成することができる。本明細書では、ヒト肺から領域特異的前駆細胞を単離し、実験および検証ツールとして3Dオルガノイド培養物を生成するための段階的なプロトコルについて説明します。我々は、領域特異的前駆細胞を単離することを目標として、肺の近位領域および遠位領域を定義する。酵素的解離と機械的解離の組み合わせを利用して、肺と気管から全細胞を単離しました。次いで、基底細胞を選別するためのNGFRおよび肺胞II型細胞を選別するためのHTII−280などの細胞型特異的表面マーカーに基づく蛍光関連細胞選別(FACS)を用いて、近位または遠位起源細胞から特異的前駆細胞を分画した。単離された基底または肺胞II型前駆細胞を用いて、3Dオルガノイド培養物を作製した。遠位および近位前駆細胞の両方が、30日目に5000細胞/ウェルを播種した場合、遠位領域で9〜13%、近位領域で7〜10%のコロニー形成効率を有するオルガノイドを形成した。遠位オルガノイドはHTII-280+ 肺胞II型細胞を培養中に維持したが、近位オルガノイドは30日目までに繊毛細胞および分泌細胞に分化した。これらの3Dオルガノイド培養は、肺上皮と上皮間葉相互作用の細胞生物学を研究するための実験ツールとして、ならびに疾患における上皮機能障害を標的とする治療戦略の開発および検証のために使用することができる。

ソース肺組織 気管および肺外気管支(図1A)を、近位気道上皮細胞の単離およびその後の近位オルガノイドの生成のための供給源組織として使用した。実質および直径2mm未満の小さな気道の両方を含む遠位肺組織(図1A)を、小さな気道および肺胞上皮細胞(遠位肺上皮)の単離および小気道または肺胞オルガノイドの生成に使用した。偽層状上皮によって裏打ちされた近位気道には、膜タンパク質NGFRに対して免疫反応性を有する豊富な基底前駆細胞が含まれる(図1B、C)。対照的に、肺胞を裏打ちする上皮細胞は、HTII-280モノクローナル抗体との頂端膜免疫反応性を示すサブセットを含み、それらの肺胞2型細胞(AT2)同一性を示唆する(図1B、D)。これらの表面マーカーは、近位領域または遠位領域のいずれかから単離された上皮細胞の...

本稿では、ヒト肺の近位領域および遠位領域からの生存上皮細胞の濃縮を可能にする組織解離および細胞分画アプローチの詳細な方法論を提供する。本明細書では、これらのアプローチは、3Dオルガノイド培養モデルの使用を通じて肺上皮前駆細胞の機能解析に適用される。

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

3Dオルガノイド培養は、このプロトコルを使用して開発された遠位肺上皮の近位にあります。肺組織維持や疾患関連リモデリングの基本的なメカニズムを研究するための扱いやすいモデルを提供し、創薬と検証のための効果的なプラットフォームを提供します。このプロトコールは、他の組織解離細胞分画アプローチと互換性があります。また、上皮前駆細胞は異なる解剖学的コンパートメントから単離され、in vitroで位置同一性を維持するため、外因性または内因性の刺激に対する肺応答の地域差をモデル化するために使用できます。このレベルの技術は、起源領域を代表する専門の分化した子孫を得るために培養できる領域特異的な前駆細胞を含む、上皮細胞の異なる亜集団の単離に使用できます。肺組織を受け取ったら、直径2ミリメートル以下の小さな気道を含む遠位肺上皮と周囲の実質組織から近位気管と気管支を分離します。サンプルを150 x 15 mmの無菌の個々のシャーレに入れ、遠位組織サンプルを約1 cmの立方体にさいの目に切ります。ピースを清潔な50ミリメートルチューブに入れ、洗浄ごとに新鮮な冷やしたHBSSでティッシュを3回洗浄します。最後の洗浄後、ティッシュを新しいペトリ皿に移し、滅菌済みの糸くず防止ワイプで拭き取り乾燥させます。次に、鉗子とはさみを使用して、組織を直径約2ミリメートルの断片に細かく刻む前に、できるだけ多くの内臓胸膜を取り除きます。組織断片の消化には、50ミリリットルの円錐管内の25ミリリットルの滅菌HBSSに、リベラーゼ1ミリリットルあたり50マイクログラムとDNA1ミリリットルあたり25マイクログラムを追加します。そして、約2〜3グラムのひき肉をチューブに加えます。次に、組織を摂氏37度に置き、毎分900回転で40〜60分間連続振とうします。30分後、10ミリリットルのシリンジを使用して消化された組織を粉砕し、凝集の形成を防ぎます。インキュベーションの終わりに、16ゲージの針を備えた10ミリリットルの注射器を使用して、組織を5回粉砕します。次に、ワイドボアピペットを使用して、示されているように真空圧下で懸濁液を一連のセルストレーナーに通します。最後のストレーナーを20ミリリットルのHBSS plusで洗浄して残りの細胞を採取した後、濾液を遠心分離して単離された細胞を回収します。上清を捨てた後、ペレットに1ミリリットルの赤血球溶解バッファーをペレットに加え、穏やかなピペッティングで行い、その後、細胞を1分間の氷でインキュベートします。インキュベーションの最後に、10〜20ミリリットルのHBSSとバッファーを加えて溶解を中和し、残りの細胞を遠心分離によって回収します。モノクローナル抗ヒトCD31およびCD45抗体およびLSカラムに結合したCD31およびCD45マイクロビーズを使用して、全細胞のプールからCD31陽性内皮細胞およびCD45陽性免疫細胞を全細胞のプールから枯渇させます。FACSの細胞表面染色では、目的の適切な一次抗体を必要な濃度で添加し、暗所で細胞を摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、細胞を3ミリリットルのHBSS plusで洗浄し、必要に応じて氷上で30分間インキュベーションするために、適切な濃度の蛍光色素標識二次抗体で細胞を標識します。インキュベーションの終了時に、細胞を3ミリリットルのHBSS plusで洗浄し、HBSS plus濃度の1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞で細胞を再懸濁してから、ストレーナーキャップを介して細胞を5ミリリットルのポリスチレンチューブにろ過し、単一細胞懸濁液の形成を確実にします。次に、DAPI1ミリリットルあたり1マイクログラムを加えて、透過性細胞を染色します。近位組織上皮前駆細胞の濃縮には、肺から近位気道を切開し、ハサミを使用してその長さに沿って気道を開き、内腔を露出させます。組織をリベラーゼ1ミリリットルあたり50マイクログラムで覆い、摂氏37度で20分間インキュベーションし、ミキサーで連続的に振とうします。インキュベーションの終了時に、組織を滅菌済みの150 x 15 mm皿に移し、メスを使用して気道表面を穏やかにこすり落とし、組織から管腔上皮細胞を完全に剥がします。次に、5ミリリットルの滅菌HBSSプラスバッファーで皿を洗浄し、脱落した管腔上皮細胞をすべて収集し、細胞を50ミリリットルの円錐形遠心チューブに移します。10ミリリットルのピペットを使用して懸濁液を連続して5回粉砕し、単一細胞懸濁液を得る。次に、遠心分離によって懸濁液を回収します。次に、ペレットを新しいHBSSと氷上のバッファーに再懸濁します。はさみを使用して、残りの気管気管支組織をそのリングに沿って切断し、組織の小さなストリップを生成します。新しい皿では、片面のカミソリの刃を使用してストリップを細かく刻み、組織片をチューブあたり2ミリリットルのリベラーゼを含むCチューブに移します。次に、gentleMACS自動解離器でヒト肺プロトコル2を使用して、組織をさらに機械的に解離します。解離の終わりに、約2グラムのミンチ近位組織を、リベラーゼ1ミリリットルあたり50マイクログラムとDNA溶液1ミリリットルあたり25マイクログラムを含む50ミリリットルの円錐管に移します。.摂氏37度での45分間のインキュベーションを振とうしながら、遠位肺組織で示されているように、一連のストレーナーで組織スラリーをろ過し、濾液に同量のHBSSプラスバッファーを加えて消化を停止します。単離された管腔近位気道細胞をチューブに加え、遠心分離により細胞を回収します。その後、細胞はマイクロビーズ単離によって濃縮され、遠位肺組織細胞で実証されているように、目的の細胞表面マーカーを染色することができます。偽の層状上皮によって裏打ちされた近位気道には、膜タンパク質NGFRに対して免疫反応性である豊富な基底前駆細胞が含まれます。対照的に、肺胞の内側を覆う上皮細胞には、肺胞II型細胞の同一性を示唆するHTII-280モノクローナル抗体による頂端膜免疫反応性を示すサブセットが含まれています。汚染された赤血球、免疫細胞、および内皮細胞の磁気ビーズの枯渇は、遠位組織サンプルと近位組織サンプルの両方で上皮細胞集団の有意な濃縮をもたらし、それに対応してFACS効率が向上します。FACSがさらに枯渇すると、遠位細胞集団が高度に濃縮され、そのNGFRまたはHTII-280表面染色に基づいてさらに分画することができます。HTII-280陽性遠位肺上皮細胞培養は、平均コロニー形成効率が10%の急速に拡大するオルガノイドを生成します30日目培養の免疫蛍光染色は、オルガノイドを含む内腔が主にHTII-280およびSPC陽性遠位肺上皮細胞で構成されていることを明らかにしています。NGFR陽性細胞から培養された近位肺上皮オルガノイドは、培養30日目にオルガノイドを含む内腔の形成をもたらし、平均コロニー形成効率は7.8%です酵素組織会合の経験的最適化は、表面エピトープの保存に重要であり、免疫蛍光染色を可能にし、その後の領域特異的組織化された培養のための生存上皮細胞サブセットの濃縮を可能にします。この方法は、免疫細胞、血管細胞、間質細胞、上皮細胞サブセットの同定と濃縮、および3Dオルガノイドチッププラットフォームを使用した共培養モデルの開発に適応できます。私たちは最近、この技術を使用して生成された肺胞オルガノイドを、ヒト肺上皮のSARS-CoV-2感染を研究し、COVID-19の薬物検証のためのプラットフォームとして使用することを説明しました。

isolation-enrichment-human-lung-epithelial-progenitor-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、効率的に気道上皮細胞を成熟するために、マウスの胚性幹細胞由来の胚体内胚葉を指示します。この分化技術は、定義された、無血清培養の設定において、肺系統の仕様を指示するために3次元の脱細胞化肺足場を使用します。...

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

本稿では、近位および遠位上皮肺細胞と共に近位および遠位上皮肺細胞の両方を含む3次元全肺オルガノイドに対する誘導多能性幹細胞のステップ指向分化について説明する。...

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成

このプロトコルは、初代肺組織からヒト肺オルガノイドを誘導し、肺オルガノイドを拡張し、近位分化を誘導して、ヒト気道上皮を忠実に表現鏡検査する3Dおよび2D気道オルガノイドを生成する方法を提示する。...

ヒト肺オルガノイドの確立と近位分化による成熟気道オルガノイドの生成

ヒト人工多能性幹細胞分化プロトコールにおける最近の進歩は、器官特異的細胞型の段階的な誘導を可能にする。ここでは、気液界面培養におけるiPSC由来気道基底細胞の維持・拡大と粘液繊毛上皮への分化のための詳細な手順を述べる。...

ヒト多能性幹細胞からの気道上皮細胞気液界面培養物の生成

ここでは、長期バイオバンキングのための初代気管支上皮細胞の単離と増殖、および気液界面での培養による分化上皮細胞の生成のための、再現性があり、手頃な価格で堅牢な方法を紹介します。...

バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

マウス小腸陰窩を単離し、陰窩から腸3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルについて説明します。さらに、上皮下細胞ニッチの非存在下で単一の腸幹細胞からオルガノイドを生成する方法について述べる。...

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

この記事では、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の肺上皮、間葉、内皮細胞、およびマクロファージで構成される複雑な多細胞気道バリアモデルを気液界面培養で生成する方法について説明します。...

iPSC由来の上皮細胞、間葉系、内皮細胞、免疫細胞の共培養による肺の健康と疾患における気道バリア完全性のモデル化

ここでは、出生後のマウスから小脳顆粒ニューロン前駆細胞や小脳顆粒ニューロンを分離して培養する方法を提示する。...

ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養

内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）は血管の恒常性と修復を研究するために有望なツールです。...

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

この記事では、単離するための方法および培養ウズラやニワトリHH14を提供します...

鳥類胚弁膜前駆細胞の単離と培養

学ぶヒト肺上皮前駆細胞の単離・濃縮法。組織解離と細胞分画技術を用いて、近位・遠位肺領域から生存性の高い上皮前駆細胞を抽出し、3Dオルガノイド培養による肺疾患モデル構築と創薬プラットフォームとして活用できます。

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

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