単核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮な凍結脳腫瘍からの核分離
2020年8月25日
腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。
私たちの方法の目標は、新鮮な凍結腫瘍から核を分離することであり、同じ核調製物を転写およびエピジェネティックな研究に使用できます。したがって、腫瘍は進行中にどのように進化し、治療法は腫瘍組成にどのように影響するのかなど、いくつかの重要な質問をすることができます。この方法の最大の利点は、シンプルで処理時間を短縮し、そして最も重要なことに、高品質の原子核が得られることです。
選別ステップがないため、核へのストレスが軽減されます。そしてもう一つの利点は、アーカイブ凍結腫瘍に使用できることです。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるAshwin Narayananです。
まず、10〜60ミリグラムの新鮮な凍結組織サンプルを事前に冷やしたペトリ皿に移します。新鮮な冷凍ティッシュをかみそりの刃で氷の上で細かく刻むか、細かく刻みます。500マイクロリットルの冷却した核溶解バッファーをペトリ皿の組織に加えます。
次に、混合物をダウンサーに移します。摩擦が減少するまで、組織片を緩い乳棒で約20ストロークダウンスします。次に、タイトな乳棒で20ストロークデュースして、完全な組織の均質化を実現します。
ホモジネートを予め冷却した2ミリリットルのチューブに移し、1ミリリットルの冷却した溶解バッファーをダウンサーに加え、すすぎ、チューブに加えます。穏やかに混合し、インキュベーション中にワイドボアピペットチップで1〜2回混合しながら、氷上で5分間インキュベートします。30マイクロリットルのストレーナメッシュを使用してホモジネート全体をろ過し、15ミリリットルのファルコンチューブに集めます。
その後、あらかじめ冷やした新しい2ミリリットルのチューブに戻します。通常、ホモジネート全体に対しては、単一のストレーナーで十分です。光学顕微鏡でサンプルをチェックし、大きな破片の除去と核膜の無傷性を確認します。
原子核は丸くある必要はなく、核膜が歪んではいけません。破片がある場合は、ろ過を繰り返します。次に、ベンチトップ遠心分離機で原子核を5分間遠心分離します。
上清を取り除き、約50マイクロリットルの核含有ペレットを残します。ペレットを別のミリリットルの核溶解バッファーに穏やかに再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。遠心分離を繰り返し、ペレットを乱さずに上清を取り除きます。
500ミリリットルのHBを加え、再懸濁せずにサンプルを5分間インキュベートします。次に、核を別の1ミリリットルのHBに再懸濁します。さらに5分間遠心分離し、上清を取り除きます。核を200マイクロリットルのHBに再懸濁し、懸濁液を新しい2ミリリットルのチューブに移します。
200マイクロリットルの50%ヨージキサノール溶液を核に加えて最終濃度25%ヨージキサノールにし、ピペットを300マイクロリットルに設定して10回混合します。次に、層の混合を避けるために、P1000の細い先端を使用して、25%混合物の下に300マイクロリットルの29%iodixanol溶液を追加します。P1000の細い先端で29%混合物の下に300マイクロリットルの35%ヨージキサノール溶液を加え、ゆっくりと取り出します。.
サンプルをスイングバケット遠心分離機に入れ、ブレークオフ時に摂氏4度で3, 500Gで20分間回転させます。振らずにサンプルを静かに取り出し、光の下で観察します。2層目と3層目の間には、純度95%の核の透明な白い帯が見えるはずです。
核を単離するには、最上層を吸引して、界面の白い核バンドを露出させます。核バンドを200ミリリットルの容量で集め、新しいチューブに移します。次に、20マイクロメートルのフィルターでろ過します。
光学顕微鏡で原子核を点検し、大きな破片の除去と核膜の無傷性を確認します。それらは丸くなければならず、核膜が歪んではいけません。血球計算盤でTrypan Blue染色を行い、核をカウントし、snRNA-seqまたはsnATAC-seqに分注します。
さまざまなろ過ステップとグラジエント遠心分離により、純粋な核を分離し、デブリの大部分を廃棄することができます。同じ単離核調製物を、single nuclei RNA-seqとsingle nuclei ATAC-seqの両方に使用できます。単離された核は同じサンプルからのものであるため、生成されたデータはSeuratなどのRパッケージを使用して共埋め込み、クラスターを生成し、マルチオミクスの視点を提供できます。
プロトコールが公開されたデータセットと同等であるかどうかを判断するために、得られたデータを、中枢神経系に関連する公開されている4つの単一核RNA-seq研究と比較しました。すべてのデータセットを統合し、UMIと遺伝子の数の分布をバイオリンプロットを使用して視覚化しました。その結果、この分析法は最新のsnRNA-seqプロトコルと同等であることが示されました。
このプロトコールを試みる際には、グラジエント遠心分離や核分離の際に、層を混合しないように特に注意する必要があります。
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概要
この研究は、新鮮冷凍されたグリオーマ組織から単一核を分離する簡単で効率的なプロトコルを提示します。この方法は、グリオーマにおける腫瘍内異質性を扱うために、単一核RNAおよびATACシーケンシング研究のために設計されています。
研究の主要な構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- ゲノミクス
背景
- 腫瘍内異質性は腫瘍の一般的な特徴です。
- 腫瘍の進化と治療効果を理解することは治療にとって重要です。
- 高品質の核の分離は正確な分析に不可欠です。
- アーカイブされた冷凍腫瘍もこの方法で利用可能です。
研究目的
- 研究のために新鮮冷凍腫瘍から核を分離すること。
- 転写およびエピジェネティック研究を容易にすること。
- 腫瘍の進化と治療への反応を探ること。
使用した方法
- バッファーと勾配遠心分離の組み合わせ。
- グリオーマ組織から単一核の分離。
- 核へのストレスを最小限に抑えるためのソーティング工程なし。
- 新鮮およびアーカイブされた冷凍腫瘍の両方に適用可能。
主要な結果
- この方法はシーケンシングに適した高品質の核を生成します。
- 処理時間が大幅に短縮されます。
- ポストドクターフェローのAshwin Narayananによって実証されました。
- 腫瘍研究における複数のダウンストリーム応用をサポートします。
結論
- このプロトコルはグリオーマの異質性の研究に効果的です。
- 腫瘍のダイナミクスの理解を深めます。
- 腫瘍学における将来の研究のための信頼できるツールを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating high-quality nuclei from archival frozen brain tumor samples enables scalable multi-omics analysis without fresh tissue constraints. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in glioma drug discovery by providing reproducible molecular profiles from biobanked specimens. The method reduces processing time and technical variability, accelerating preclinical target characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor heterogeneity and clonal evolution from archival specimens.
- Operational Value: Eliminates need for fresh tissue processing, increasing sample throughput and biobank utilization.
- Predictive Value: Provides matched epigenomic and transcriptomic data for de-risking therapeutic targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized nuclei suspensions suitable for high-throughput snRNA-seq and snATAC-seq platforms.
- Operational Value: Uses gradient centrifugation and filtration to remove debris, ensuring assay-ready inputs.
- Scalability: Compatible with 10x Genomics and similar microfluidic systems for large-scale screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase molecular profiling to preclinical models using consistent sample preparation.
- Mechanistic De-risking: Enables co-embedding of chromatin accessibility and gene expression data to clarify regulatory mechanisms.
- Predictive Confidence: Supports biomarker-aligned target prioritization through multi-omics concordance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a standardized input for multi-omic profiling of brain tumors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on tumor evolution and therapy response using archival cohorts.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible nuclei yields for downstream sequencing applications.
- Analytics: Enables UMI and gene distribution analysis for quality control and cross-study comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment through matched snRNA-seq and snATAC-seq from the same nuclei.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nuclei isolation workflow for frozen tumor biobanks across oncology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking chromatin state to transcriptional output in glioma.
- Operational Value: Standardizes nuclei isolation across sites, improving reproducibility and reducing pre-analytical variance.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling retrospective analysis of archival tumor collections.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target selection through multi-omic validation from preserved specimens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization and gradient centrifugation techniques.
- Dependent on access to swinging bucket centrifuges and iodixanol gradient preparation.
- Necessitates standardized filtration and staining protocols for nuclei quantification.
- Adaptation may be needed for non-glioma tumor types based on lysis buffer optimization.
- Practical limitation: Gradient purity depends on careful layer separation to avoid contamination.
