Name: CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶ：金属インプラント表面へのCD47ペプチド固定化手法。ステンレス鋼を洗浄・加熱処理し、ポリビスホスホネート化学でペプチドを結合させ、炎症細胞の付着を軽減する。金属ステントの生体適合性向上に応用可能。

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本論文で発表されたプロトコルの開発と研究は、IFおよびSJSへのNIH(NBIB)R01資金(#EB023921)、IFおよびRJLへのNIH(NHLBI)R01資金(#HL137762)によって支えられました。

この実験のためのすべてのヒトサンプルは、フィラデルフィア小児病院のIRBに従って得られた。すべての動物実験は、フィラデルフィア小児病院のIACUCの承認を得て行われました。
1. PEI-PDT でベアメタル表面をコーティング
<ol><li>ステンレス箔クーポン(1cm x 1cmまたは0.65 cm x 1cm)または2-イソプロパノールを使用したステンレス鋼メッシュディスクをシェーカー(60°C、200rpmの速度)で5分間洗浄します。このステップ 2x を実行します。その後、クロロホルム(60°C、速度200rpm)で2倍をそれぞれ10分間洗います。</li>
	<li>220°Cのオーブンに洗浄したステンレス鋼のサンプルを30分間置きます。</li>
	<li>DDWの5mLにポリアリラミンビスホスホネート25mgを潜伏チオール基(PABT)と5mgの重炭酸カリウム(KHCO3)で溶解し、200rpmで72°Cで30分間シェーカーでインキュベートし、PABT溶液の0.5%の5 mLを調製します。 注:PABT合成については、以前に公開された文献18を参照してください。</li>
	<li>焼いたホイルまたはメッシュディスクをPABTの0.5%水溶液に浸し、シェーカー(72°C、200rpmの速度)で1時間インキュベートします。</li>
	<li>PABT修飾サンプルを脱イオン蒸留水(DDW)で5倍洗い、新しいバイアルで標本を移し、DDWで再び5倍洗います。</li>
	<li>0.1 M酢酸(0.57mLの氷酢酸、820mgの酢酸ナトリウム)の5 mLにトリス(2-カルボキセチル)塩酸塩(TCEP)60mgを溶解して、合計5mLのTCEP溶液(12mg/mL)を調製します。</li>
	<li>PABT修飾サンプルをTCEPで、シェーカー上の室温(RT)で15分間処理します。 注: TCEP は、チオール グループの保護を解除するために使用されます。</li>
	<li>凍結乾燥機などの真空発生装置を用いて丸底フラスコ中のDDWを脱ガスし、TCEP処理したホイルまたはメッシュディスクを脱気DDWで5倍洗う。サンプルを新しいバイアルで移し、さらに脱気したDDWで5倍洗います。 注:大気酸素による金属表面のチオールの酸化を防ぐために、迅速に作業することが最も重要です。</li>
	<li>212.5 μLのストック PEI-PDT と 0.4 M 酢酸ナトリウムを脱気DDWに希釈して、1%PEI-PDT溶液の5 mLを調製します。ステップ1.9をステップ1.8と同時に実行し、大気へのサンプルの暴露を最小限に抑えます。 注: PEI-PDT の合成は、以前に公開された文献18に記載されています。</li>
	<li>洗浄したステンレス鋼の試料を1%PEI-PDTでインキュベートします。空気をアルゴンガスに置き換え、バイアルを気密に密封し、RTのシェーカーで1時間混ぜます。ペプチド結合を直ちに進めるか、4°Cで1週間まで保存する。</li>
</ol>2. 蛍光顕微鏡法と蛍光測定法を用いた金属表面のフッ素体結合型pepCD47保持の付着性及び定性評価
<ol><li>セクション1に記載されているように作成した箔クーポンまたはメッシュディスクを洗浄し、DDW 5xで上記のステップ1.1〜1.10。サンプルを新しいバイアルに移し、DDWで洗浄して5倍にします。最後に、脱ガスエタノールで2倍、脱気ジメチルホルムアミド(DMF)で2倍洗浄します。</li>
	<li>テトラメチルロダミン(TAMRA)と共役したpepCD47ストック溶液を脱ガスジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させて最終濃度1mg/mLに調製します。1 mLの割り当てでストック溶液をアリコートする。アルゴン雰囲気下で密閉チューブで-20 °Cで保管してください。</li>
	<li>脱気DMFを使用してTAMRA共役pepCD47のストック溶液の1mg/mLを希釈し、以下の濃度のフルオロフォアを共役するpepCD47-10、30、100、および200 μg/mLを調製した。 注:TAMRA共役pepCD47が沈殿しているように見える場合は、TCEPビーズを1:1、RTで20分間使用して、ストックTAMRA共役pepCD47溶液を減らしてください。TAMRA 結合 pepCD47 を TCEP ビーズに追加する前に、TCEP ビーズ溶液をスピンし、上清を除去してから TAMRA 結合 pepCD47 を追加して進みます。</li>
	<li>PEI-PDT改変箔クーポンを、1時間アルゴン雰囲気下でRTのシェーカー上の各条件に対して、TAMRA共役pepCD47の10、30、100、または200 μg/mLでインキュベートします。インキュベートPEI-PDTはメッシュディスクを改変し、ステップ1.2(ベアメタルコントロール)を超えてメッシュディスクを変更せず、TAMRA共役pepCD47の100 μg/mLを1時間のシェーカー上のアルゴン雰囲気の下でRTで三重化します。 注:このステップ以降、バイアルは、光から内容物を保護するためにアルミ箔で包まれています。</li>
	<li>フルオロフォア結合pepCD47コーティングされた表面を洗浄して、非共有結合ペプチドを次の順序で除去します: DMF (3x), DMF/DDW 1:1, DDW(3x)、0.3%のSDSを20 mMトリスpH 7.4(シェーカーで70°Cでそれぞれ3、5分)、DDW(3x)、バイアル交換、最終DDW洗浄。</li>
	<li>制御と共有結合メッシュディスクを顕微鏡ガラスに配置し、50 μLのPBSを追加し、カバースリップを配置します。ローダミンフィルターセットを搭載した反転蛍光顕微鏡を用いた画像メッシュディスク。100倍の倍率で代表的な画像を撮ります。</li>
	<li>12 mg/mL TCEP溶液の15 mLを、メタノールと0.1 Mの酢液の1:1 v/v混合物に180mgのTCEPを溶解して調製します。</li>
	<li>RTで1mLのTCEP溶液を1mLずつインキュベートします。</li>
	<li>TAMRA結合pepCD47ストック(1 mg/mL)~100μg/mL、1μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mL、0.01 μg/mLを連続希釈して、以下の基準を準備してください。希釈剤として TCEP ソリューションを使用します。</li>
	<li>544/590 nm励起波長および発光波長で蛍光測定によって生成された較正曲線に対して、金属表面から放出されたTAMRA共役pepCD47を解析します。</li>
</ol>3. PEI-PDT 改質面へのヒトpepCD47の取り付け
<ol><li>セクション1に記載されているように配合された洗浄PEI-PDT被覆サンプル、上記のステップ1.1-1.10、脱気DDW 5xで、バイアルを交換し、脱気DDW 5xで洗浄する。</li>
	<li>ヒトpepCD47ストック溶液(1mg/mL)を脱気50%酢酸に溶解して1mg/mLの濃度を達成する。</li>
	<li>ヒトpepCD47(100 μg/mL)の作業濃度を、4,500 μLの脱ガス1xリン酸緩衝生理食塩基(PBS)の4,500 μLにヒトpepCD47のストックを溶解して調製します。</li>
	<li>洗浄されたPEI-PDT被覆サンプルを1時間振盪してRTでpepCD47の100 μg/mLでコーティングしたサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>ヒトpepCD47コーティングサンプルを洗浄して、以下の順序で余分なペプチドを除去し、PBS(3x)、DDW(3x)、0.2%Tween-20(3x、各5分)、DDW(3x)、バイアルの交換および最終DDW洗浄を行います。 注:ヒトpepCD47被覆表面は、最大6ヶ月間4°Cで乾燥して保存することができます。</li>
</ol>4. PEI-PDT 改変された表面をスクランブルシーケンス(Scr)でコーティング
<ol><li>スクランブルされた配列粉末を脱気0.1%の酢酸に溶解し、1mg/mLのストック液を調製する。</li>
	<li>4,500 μLの脱気0.1%酢酸を溶解して、スクランブルペプチドの100 μg/mLの溶液を調製します。</li>
	<li>洗浄したPEI-PDT検体にスクランブルペプチド100μg/mLをRTで1時間振盪してコーティングします。</li>
	<li>取り付けられたスクランブルペプチドを除去するには、次の順序で表面を洗浄 0.01% 酢酸 (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 分), DDW (3x), バイアルを変更し、1 DDW 洗浄.</li>
</ol>5. 金属表面への細胞の接続を分析するためのチャンドラーループ
<ol><li>セクション1の説明に従って、金属箔(0.65 cm x 1cm)をヒトpepCD47またはスクランブルペプチドのいずれかでコーティングし、その後に3または4を続けます。</li>
	<li>1/4インチのPVCチューブを3本の38cmの長さに切ります。</li>
	<li>3つの異なる管の8つまで無変、スクランブルされたペプチドまたはpepCD47の変性金属箔を挿入する。</li>
	<li>健康なヒトドナーから30 mLの血液を収集し、機関IRBプロトコルに従って抗血小板薬を含まない。採取した血液の凝固を防ぐために、4%クエン酸ナトリウムの1 mLでシリンジをプリロードします。</li>
	<li>10 mLのシリンジを使用して各チューブに10mLの血液を入れ、端部を金属アダプターで接続します。チャンドラーループ装置の車輪に血液で満たされた管を置きます。</li>
	<li>計算した速度で37°Cで車輪回転で金属箔に沿って血液を渡し、25 dyns/cm2 のせん断を4時間で生成します。</li>
	<li>チューブから血液を排出し、IRBの要件に従って血液を処分します。</li>
	<li>各チューブからホイルを取り出すためにメスを使用してチューブをカットします。</li>
	<li>10 mLのカコチル酸ナトリウムバッファーを0.1 Mの塩化ナトリウムを用いて10mlの4%グルタルアルデヒド溶液を希釈して2%グルタルアルデヒド溶液を調製する。</li>
	<li>2%グルタルアルデヒド溶液でホイルを15分間インキュベートし、一晩4°Cで保存します。分析する前に、金属箔3倍をPBSで洗浄してください。</li>
</ol>6. CFDA染料を用いた金属表面への細胞の付着性の分析
<ol><li>37°Cに設定した水浴で15mLチューブ内のPBSの8mLを温めます。</li>
	<li>CFDA(カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシニミジルエステル)染料溶液を次のように準備し、1つのCFDA色素バイアルに90μLのDMSOを加えて、10mMのストック濃度を達成します。次に、8 mLの温かいPBSに75 μLのストックCFDAを加えて、93.75 μMの作業濃度を調製します。チューブを数回反転して混ぜ、チューブをアルミホイルで覆います。 注:すべての使用の前に、CFDA染料を新たに調製することをお勧めします。</li>
	<li>24ウェルプレートにCFDA染料1mLを用いて各ホイルをインキュベートします。プレートをアルミホイルで覆い、37°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>金属箔3倍をPBSで洗浄し、過剰な染料を除去します。反転蛍光顕微鏡を用いた画像。</li>
</ol>7. pepCD47改変およびベアメタル表面上の単球の付着およびマクロファージ拡張
<ol><li>400-450 g雄スプレイグドーリーラットの犠牲の間に静脈のアクセスを介して末梢血の10 mLを収集します。凝固を防ぐために、ヘパリンナトリウムの1,000 IUとすぐに混合します。</li>
	<li>50 mL円錐管に10 mLの密度勾配媒体のピペット。PBSの5 mLと血液を混合し、慎重にパスツールピペットを使用して密度勾配培地上に希釈された血液を層化します。800 x g のスイング バケット ローターの遠心分離機と 20 分間の 18~25 °Cで、最小の設定で加速と減速を行います。</li>
	<li>パスツールピペットを使用して、プラズマとフィコールの間の界面にバフィーコートの不透明な層を収集します。550 x g でPBSと遠心分離機で1:3を希釈したバフィーコートセルに10分間 10分間。</li>
	<li>ACKリシスバッファーの3 mLにバフィーコート細胞を再中断し、赤血球を汚染してリセレートする。氷の上で4分間インキュベートします。12 mLの細胞分離バッファー(CSB;0.5% BSA、0.5% FBS、2 mM EDTA/PBS)を追加します。</li>
	<li>550 x g で遠心分離機、4 °C で 10 分間。ペレットをCSBの10mLに再懸濁します。</li>
	<li>200 x g で遠心分離機、4 °Cで 10 分間血小板を除去します。2 回繰り返します。</li>
	<li>ペレットをCSBの500 μLに再懸濁します。CD8a(クローンOX-8)、抗CD5(クローンOX-19)、抗CD45RA(クローンOX-33)、抗CD6(クローンOX-52)の各マウス抗ラット抗体のそれぞれ10 μgを加えます。</li>
	<li>垂直チューブ回転翼で4°Cで1時間インキュベートし、9.5mLのCSBを加えます。遠心分離機は 300xg で、4°Cで10分間。上清を捨て、CSBの10mLでペレットを再懸濁し、遠心分離を繰り返す。</li>
	<li>ペレットをCSBの500 μLに再懸濁します。150 μLのヤギ抗マウス IgG マイクロビーズを加えます。垂直チューブ回転翼で4°Cで20分間インキュベートし、9.5mLのCSBを加えます。遠心分離機は 300xg で、4°Cで10分間。</li>
	<li>上清を捨てます。CSBの1 mLにペレットを再懸濁します。</li>
	<li>磁気セパレータに LS カラムを配置します。 CSB の 3 mL で LS カラムをプライムします。列のスループットを破棄します。ステップ7.10から再懸濁細胞ペレット1mLを加える。スループットの収集を開始します。フローが停止した後、CSB を 5 mL 追加し、フローが停止するまで列のスループットを収集し続けます。</li>
	<li>遠心分離 300xg での負選択された単球を含むカラムスループット(6mL)と10分間の4°Cを含む。得られた小ペレットを10%FCS、1%のペン/ストレップおよび100 ng/mLラットマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を補充したRPMI-1640培地の2 mLで再懸濁する。</li>
	<li>血球計を使用して単球を数えます。単球濃度を5 x 105 細胞/mLに調整します。</li>
	<li>1.1-1.10および3.1-3.6に従ってラットpepCD47(N=3)で修飾されたステンレス鋼のサンプル(N =3)またはステンレス鋼のサンプルと12ウェルプレートの個々の井戸に1mLの単球懸濁液の量を加える。</li>
	<li>3日目と5日目のシード後に培地を変更します。6日目にPBSで細胞を洗浄し、室温で4%パラホルムアルデヒドを15分間固定します。PBSで2回5分間洗います。</li>
	<li>ステンレス鋼のホイルを取り外し、新しい12ウェルプレートに個別に置きます。ホイルを反転させないでください。</li>
	<li>細胞を透過させるために0.5%Tween-20/PBSで15分間インキュベートします。PBSで2回5分間洗います。</li>
	<li>10%ヤギ血清/PBSで20分間ブロックします。血清を吸引する。洗わないで下してください。マウス抗ラットCD68抗体を加える(1%BSA/PBSで1:100を希釈)。室温で1時間インキュベートする。PBSで3倍の洗浄をそれぞれ5分間洗います。</li>
	<li>ヤギの抗マウスIgGアレクサフルオール546(1%BSA /PBSで1:200希釈)を追加します。室温で暗く45分間インキュベートします。PBSで5分間洗います。1 μg/mL Hoechst 33342 色素を室温で10分間暗くしてカウンターステイン。PBSで3倍の洗浄をそれぞれ5分間洗います。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を逆光光学で、ホイルと画像を反転させます。青と赤のフィルタ設定で200倍の倍率で画像をキャプチャします。</li>
	<li>個々の画像に添付された単球をカウントし、グループ平均と標準偏差を計算します。</li>
</ol>

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<li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li>
<li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li>
<li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li>
<li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871(2014).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

我々は、血液中に見られる炎症細胞に対する表面の反応性を低下させるという包括的な目標を持つステンレス鋼表面に治療ペプチド部分を付加する比較的新しい化学戦略を実証し、記述する。本明細書に記載されるビスホスホネート化学は、PABTの金属酸化物とビスホスホネート基との間の協調結合形成を含む。金属表面に形成されるポリビスホスホネート単層の厚さは5nm18を超えないが、したがって、厚いポリマーコーティング20の潜在的な炎症効果に対して重要ではない。PABTの脂肪族側鎖における潜在的チオール基の脱保護は、チオール反応性化合物を用いた更なる化学修飾のために金属表面をプライミングする。PEI-PDTは、チオール反応性ピリジルジチオ基で約20%のエチレンイミンリンクが修飾されているポリエチレンイミン(平均Mw=25,000)である。PABT由来チオールとの反応では、PAI-PDT中のPDT群のごく一部しか消費されないので、PEI-PDTテザリング後の表面化学はチオール反応性に変化し、チオラ化ペプチド18の付着を可能...

経皮的冠動脈介入は、冠動脈疾患(CAD)を治療するための治療の第一行であり、主に疾患のある動脈をステント化することを含む。しかし、ステント内のレステノーシス(ISR)およびステント血栓症は、ステント展開1に関連する一般的な合併症である。血液ステント界面での血液相互作用は、金属表面上の血漿タンパク質のほぼ即時吸着によって特徴付け、その後に血小板および炎症性細胞の付着および活性化2が続く。活性化された炎症細胞からの炎症性サイトカインおよびケモカインの放出は、チュニカ培地における血管平滑筋細胞(VSMC)の表皮修飾をもたらし、その遠心性インティカルコンパートメントへの移行を引き起こす。インティマにおける活性化VSMCの増殖は、インティミカル層の肥厚、内腔狭化およびステントレステノーシス3をもたらす。VSMCの増殖を防ぐために、薬物溶出ステント(DES)が開発されました。しかしながら、これらの薬物は、内皮細胞44,55に対するオフターゲット細胞傷害作用を有する。したがって、後期ステント血栓症は、DES66,77に関連する一般的な合併症である。ポリ-L-ラクチドのような生分解性ポリマーで作られたステントは、動物実験および初期臨床試験において多くの約束を示したが、「現実の」臨床使用が第3世代DES8に劣っていることを示した時に最終的にリコールされた。したがって、より良い患者の転帰のためにベアメタルステントの生体適合性を改善する必要がある。
CD47は、その同結合受容体シグナル調節タンパク質α(SIRPα)9に結合した場合に自然免疫応答を阻害する、ユビキタスに発現する膜貫通タンパク質である。SIRPα受容体は、免疫細胞チロシン阻害モチーフ(ITIM)ドメインとSIRPα-CD47相互作用のシグナル伝達事象を有し、最終的には炎症性細胞活性化10、11、12、13,12,のダウンレギュレーションをもたらす。10,13我々の研究室での研究は、組換えCD47またはそのペプチド誘導体が、CD47の細胞外領域の22アミノ酸Igドメイン(pepCD47)に相当し、臨床的に関連する生体材料14、15、16,15,16の範囲に対する宿主免疫応答を低下させることができることを示している。最近、pepCD47をステンレス鋼のステント表面に固定化し、修復に伴う病態生理学的応答を大幅に低下させることができることを実証した。なお、pepCD47改質面は、長期保存やエチレンオキシド滅菌法17などの関連する使用条件に適している。そのために、pepCD47は、血管内ステントの臨床的限界に対処するのに有用な治療標的であり得る。
pepCD47を金属表面に共有結合させる戦略は、金属表面の一連の新しい化学修飾を伴う。金属表面は、まずポリアリンアミンビスホスホネートを潜伏チオール基(PABT)でコーティングし、続いてチオールの脱保護とピリジルジチオ基(PDT)を搭載したポリエチレンイミン(PEI)の付着物を施した。脱保護PABTチオールとの反応で消費されないPEIのPDT基は、次いで、末端システイン残基にチオールを組み込んだpepCD47と反応し、ジスルフィド結合14、17、18,17,18を介してpepCD47を金属表面に結合させる。ペプチドの最大表面固定化をもたらすペプチドの入力濃度を求めるフルオロフォア共役pepCD47(TAMRA-pepCD47)を用いた。最後に、pepCD47被覆金属表面の急性および慢性抗炎症能力を評価し、ex vivo、チャンドラーループ装置、及び単球接続/マクロファージ拡張アッセイを用いてそれぞれ評価した。
本論文は、金属表面へのチオラ化ペプチドの付着のための系統的なプロトコルを提供する。ペプチドの最大固定化密度を決定する;全血および単球に曝露されたpepCD47被覆金属表面の抗炎症特性を評価する。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>pH - 7.5</td></tr><tr><td>4% グルタルアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>16539-07</td><td></td></tr><tr><td>4% クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S5770</td><td></td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>Quality Biologicals</td><td>118-156-721</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td><td>Biolegend</td><td>202301</td><td></td></tr><tr><td>抗CD5 Ab(マウス抗ラット;クローンOX-19)</td><td>バイオレジェンド</td><td>203501</td><td></td></tr><tr><td>抗CD6抗体(マウス抗ラット;クローンOX-52)</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>550979</td><td></td></tr><tr><td>抗CD68 Ab(マウス抗ラット;クローンED-1)</td><td>BioRad</td><td>MCA341</td><td></td></tr><tr><td>抗CD8a Ab(マウス抗ラット;クローンOX-8)</td><td>バイオレジェンド</td><td>201701</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム認証ACS</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルマミド(DMF)</td><td>アルファ Aesar</td><td>39117</td><td></td></tr><tr><td>Embra ステンレス鋼グリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>E200-SS</td><td>ステンレス鋼メッシュディスク</td></tr><tr><td>Ficoll Hypaque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>ACROS 有機</td><td>148930025</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgG Alexa Fluor</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA11030</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>パリンナトリウム</td><td>Sagent医薬品</td><td>402-01</td><td></td></tr><tr><td>ヒトpepCD47</td>バ<td>ケム</td><td>4099101</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A426P-4</td><td></td></tr><tr><td>金属アダプターLeur</td><td></td>フィッティング<td>6515IND</td><td>1ウェイアダプター316 ss 1/4 "-5/16"鍬エンド</td></tr>メタ<tr><td>ノール</td><td>RICCA化学会社</td><td>4829-32</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ポタシウム (KHCO3)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>PVC チューブ</td><td>テルモ-CVS</td><td>60050</td><td>1/4" X 1/16 8'</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム緩衝液、0.1M 塩化ナトリウム</td><td>電子Microscopy Sciences</td><td>11653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Sodum actetate (C2H3NaO2)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184</td><td></td></tr><tr><td>Src peptide</td><td>Bachem</td><td>4092599</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼 (AISI 304) 円筒形のサンプル、ルーメン</td><td>Microgroup、マサチューセッツ州メドウェイ</td><td>20097328</td><td>1 cm X 6 mm OD</td></tr><tr><td>ステンレス鋼箔 (AISI 316L)</td><td>Goodfellow, Coraopolis, PA</td><td></td><td>100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td><td>Bachem</td><td>4100277</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3' ,5,5' -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PG82089</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad ラボラトリー</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFDA SE セルトレーサーキット</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

cd47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

ベアメタルステントと薬物溶出ステントに関連する主要な合併症は、それぞれステント内のレステノーシスと後期ステント血栓症です。したがって、金属ステントの生体適合性の向上は依然として重要な課題である。このプロトコルの目的は、血管内ステントを含む医療インプラントに接触する血液の生体適合性を高めるために生物学的に活性なペプチドによる金属表面修飾の堅牢な技術を記述することです。CD47は、自己の免疫学的種特異的マーカーであり、抗炎症特性を有する。研究は、細胞外領域におけるCD47のIgドメインに対応する22アミノ酸ペプチド(pepCD47)が、全長タンパク質のような抗炎症特性を有することを示している。ラットのインビボ研究、および私たちの研究室からのウサギおよびヒト血液実験システムにおけるex vivo研究は、金属に対するpepCD47固定化が炎症性細胞の付着および活性化を防ぐことによって生体適合性を向上させることを実証した。本論文では、金属表面の機能化とペプチド付着のステップバイステッププロトコルについて説明する。金属表面は、ポリアリアアミンビスリン酸を使用して修飾され、後にチオールの脱保護およびピリジルジチオ基(PEI-PDT)を搭載したポリエチレンイアミンとの反応によるチオール反応性部位の増幅が続く。最後に、pepCD47は、二重8-アミノ-3,6-dioxa-オクタノイルスペーサーを介してコアペプチド配列に接続された末端システイン残基を組み込んで、ジスルフィド結合を介して金属表面に結合される。この金属表面へのペプチド付着の方法論は効率的で比較的安価であり、したがって、いくつかの金属生体材料の生体適合性を改善するために適用することができる。

図 1に示すように、金属表面は、一連の化学修飾によってペプチドの付着に対してチオール反応性をレンダリングします。PABTインキュベーションに続いてPEI-PDT処理を行うと、金属表面がペプチドの付着に適しています。C末流でシステイン残基を含むペプチドCD47(pepCD47)は、フレキシブルな二重AEEAcブリッジを介してコアpepCD47配列に結合し、ジスルフィド結合を介してチオール反応性表面に共有結合する。このプロトコルを用いて、pepCD47が最大6ヶ月間金属表面に安定して付着し続け、通常の生理的剪断応力および滅菌手順17に耐えることができることを実証した。
最大ペプチド保持率は、TAMRA共役pepCD47を金属表面に加え、続いて広範な洗浄を行い、非共有結合ペプチドを排除し、ペプチドを表面にテザリングするジスルフィド橋梁の切断によるTAMRA-pepCD47の切断、およびフルオリメトリックアッセイを用いた分析定量化を行った。具体的には、TAMRA共役pepD47(1m...

ここで提示されるペプチドCD47(pepCD47)をポリビスフォスフォネート化学を用いて金属ステントに付加するためのプロトコルです。pepCD47を用いた金属ステントの機能化は、炎症細胞の付着および活性化を防止し、生体適合性を向上させる。

CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

このプロトコルは、金属表面に治療用ペプチドを付加する新しい化学的戦略を含み、幅広い金属生体材料の生体適合性を改善する可能性を秘めています。これは、バイオインプラントのベアメタル表面にペプチドや治療タンパク質を付加するための普遍的かつ堅牢な技術です。この技術を用いて、ステントで引き起こされる炎症反応を防ぐために、CD47ペプチドを付加して金属ステントの生体適合性を向上させた。2-イソプロパノールを用いたステンレス箔クーポンまたはメッシュディスクをシェーカーで5分間洗浄します。この洗浄を2回行い、その後、1回の洗浄につき10分間クロロホルムでサンプルを2回洗浄します。クレンジングしたステンレス鋼のサンプルをオーブンに220°Cで30分間置きます。焼いたホイルやメッシュディスクをPABTの0.5%水溶液に浸し、シェーカーに1時間インキュベートします。脱イオン蒸留水でPABT修飾サンプルを5回洗浄します。標本を新しいバイアルに移し、その後の繰り返しを行います。シェーカーで室温で15分間、TCEPでサンプルを処理します。脱気した蒸留水を、凍結乾燥機などの真空発生装置を用いた丸底フラスコで脱気し、脱気水でホイルやメッシュディスクを5回洗浄します。サンプルを新しいバイアルに移し、その後の繰り返しを行います。212.5マイクロリットルのストックPEI-PDTと125マイクロリットルの0.4モル酢酸ナトリウムを脱気水に希釈して、1%PEI-PDT溶液の5ミリリットルを調製します。洗浄したステンレス鋼の標本を1%PEI-PDTでインキュベートします。空気をアルゴンガスに置き換え、バイアルを気密に密封し、シェーカーに1時間混ぜます。ペプチドの結合をすぐに進めるか、最大1週間摂氏4度でサンプルを保存します。ヒトペプチドCD47粉末を脱気50%酢酸に溶解させて、1ミリリットルのヒトペプチドCD47ストック溶液につき1ミリグラムを調製し、4.5ミリリットルの脱ガスPBSで500マイクロリットルのストックを溶解して作業溶液を調製する。洗浄されたPEI-PDT被覆試料を、室温でペプチドCD47の働く溶液で1時間振盪してインキュベートする。終了したら、テキスト原稿に記載されているように、ペプチドCD47コーティングサンプルを洗浄します。ペプチドCD47またはスクランブルペプチドで金属箔をコーティングした後、4分の1インチのPVCチューブを38センチメートルの長さの部分にカットし、最大8つの未改変、スクランブルペプチド、またはペプチドCD47改変金属箔を3つの異なるチューブに挿入します。健康なヒトドナーから30ミリリットルの血液を収集し、抗血小板薬を含まない、採取した血液の凝固を防ぐために4%クエン酸ナトリウムの1ミリリットルで注射器を事前にロードする。10ミリリットルの注射器を使用して各チューブに10ミリリットルの血液を入れ、金属アダプターで端を接続します。チャンドラーループ装置の車輪に血液で満たされたチューブを置き、4時間摂氏37度で車輪の回転によって金属箔に沿って血液を渡します。チューブから血液を排出し、IRB要件に従ってそれを処分し、その後、ホイルを取り出すためにメスでチューブを切断します。0.1モル塩化ナトリウムでカコチル酸ナトリウムバッファーに70%溶液を希釈することにより、2%グルタルアルデヒド溶液を調製します。2%グルタルアルデヒド溶液中のホイルを15分間インキュベートし、一晩摂氏4度で貯蔵します。金属箔を分析する前に、PBSで3回洗浄してください。37°Cの水浴でPBSの8ミリリットルを温めます。1つのCFDAバイアルに90マイクロリットルのDMSOを加えて10ミリモルCFDA染料ストック溶液を調製し、その後、75マイクロリットルのストックCFDAを暖かいPBSに加えて作業溶液を調製する。チューブを数回反転して、アルミニウム箔で混ぜて覆います。各ホイルを24ウェルプレートに入れるCFDA染料を1ミリリットルに入れる。プレートをアルミホイルで覆い、37°Cでプレートを15分間インキュベートし、ホイルをPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で画像化します。共有結合したTAMRAコンジュゲートペプチドCD47の濃度を定量し、金属表面上のペプチドの最大固定化密度を決定した。最大ペプチド保持量は約180ナノグラム/センチメートル平方メートルで、1ミリリットル当たり100マイクログラムの入力濃度で達成された。改変金属表面上のTAMRA共役ペプチドCD47の固定化は、蛍光顕微鏡法によってさらに裏付けられた、TAMRA共役ペプチドCD47処理メッシュディスクの表面から放出される均一な蛍光を示した。この修飾を欠いた対照メッシュの表面で最小蛍光のみが検出され、それによって非特異的に結合したTAMRA結合ペプチドCD47を蛍光の主な供給源として除外した。また、ペプチドCD47被覆表面は、スクランブル修飾および未改変ペプチド制御と比較して、血液媒介性細胞の付着物が大幅に減少することを確認した。ラットバフィーコート細胞から単球を培養し、ペプチドCD47修飾ステンレス箔を用いて培養した。急性単球付着の58%の減衰、マクロファージへのそれらの変換、およびマクロファージの増殖が機能的な表面に観察された。このプロトコルを試みている間、できるだけ速く行われる脱ガス水または試薬を含むステップを実行し、酸素への暴露を最小限に抑えることが非常に重要です。当社の技術は、金属表面との細胞相互作用を選択的に調節し、RT-PCR、フローサイトメトリー、免疫蛍光などの典型的な細胞型同定アッセイは、この技術と互換性があります。この技術は、様々な生理活性ペプチドのために開発された場合、組織材料界面での生体適合性を高めるのに役立ちます。

mitigation-blood-borne-cell-attachment-to-metal-implants-through-cd47

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CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減

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