Name: CRISPR媒介ベース・エディタを用いた BRCA1 バリアントの機能評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶ CRISPR媒介シトシンベースエディタを用いたBRCA1バリアントの機能評価法。内因性発現BRCA1を直接変異させ、がんリスク予測や薬剤標的発見に応用できる正確な評価プロトコルを確立する。

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この研究は、韓国国立研究財団(助成金2017M3A9B4062419、2019R1F1F1F1057637、2018R1A5A2020732 Y.K.に支援されました)。

注: 方法 1 (HAP1-BE3 セルラインの生成) はオプションです。BE3発現細胞株を構築する代わりに、BE3コード系プラスミドDNAをgRNAコードプラスミドDNAと共にトランスフェクトすることができる。BE4max のようなシトシンベースエディタの他のバリアントも、高効率なベース編集に使用できます。
1. HAP1-BE3細胞株の生成
<ol><li>プラスミドDNAの構築<ol>
<li>レンチウイルス産生用レンチベ3ブラストプラスミドDNAを構築するために、高忠実度ポリメラーゼを用いたPCRによりpCMV-BE3(材料表)でBE3コード配列を増幅する。次のように、等熱アセンブリの(ステップ1.1.2から)消化されたベクターの重複する配列を含むPCRプライマーを設計します。 プライマー F: 5'-TTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTCTAGA GCCGCCACCACCACCGAGッカガッカガグ-3', プライマー-R: 5'- カラガGTTGtTTTGCGGGATCCCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCGCCCGCCCGCCCGCTTCCTCTTCTTGGG-3' 注:下線付きのヌクレオチドは、消化されたベクターと重なり、これらの配列は、ユーザーが選択した宛先ベクトルに固有になります。</li>
		<li>制限酵素を用いたプラスミドDNAをダイジェストlentiCas9ブラスト(材料表)、XbaIおよびBamHI(1μgあたり1単位)37°Cで1時間用いた。 0.8%アガロースゲルで消化された製品を実行し、市販のゲル抽出キット(材料表)を使用して適切なサイズのバンド(8.6 kb)を精製します。</li>
		<li>等熱アセンブリキット(材料表)を使用して、増幅されたBE3 PCR産物と消化されたlentiCas9-Blastベクターをクローン化します。合計で0.02-0.5 pmolのDNA断片とベクターの1:3比を使用してください:insert.アセンブリ製品をDH5アルファコンピテントセル18に変換します。アンピシリン(100 μg/mL)を含む寒天プレートに形質転換体を加え、37°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>いくつかのコロニーを選び、アンピシリン(100 μg/mL)を含むLB(リソジニーブロス)培地の4mLでそれらを接種し、180 rpmで振る培養器で培養を成長させます。</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って、市販のプラスミドDNA精製キット(材料表)を使用してプラスミドDNAを精製します。</li>
		<li>DNAクローニングの成功を確認するには、標準およびBE3特異的プライマー(補足表1)を用いたサンガーシーケンシング(補足表1)を用いて、精製されたプラスミドDNAのBE3配列(ステップ1.1.5から)を解析し、正確なクローンレンティBE3-ブラスト構築物を選択します。 注: サンガーシーケンスの結果を分析するには、BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) や CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) などのツールを推奨します。</li>
	</ol></li>
	<li>HAP1-BE3細胞株の細胞培養および生成<ol>
<li>健康な状態で、積極的に分割状態で細胞を維持します。イスコベの修飾されたダルベッコの培地中の </li><li></li><li><li></li><li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li> </li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig03large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li> </li><li></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61557/61557equ01.jpg"> </li><li></li><li></li></ol>

<ol><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li>
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<li>Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+customization+of+pooled+CRISPR+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries.</a> PLoS One. 13 (6), 0199473(2018).</li>
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<li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. , (2020).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+target+specificities+of+CRISPR+RNA-guided+programmable+deaminases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+base+editor+generates+substantial+off-target+single-nucleotide+variants+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.</a> Science. 364 (6437), 289-292 (2019).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine%2C+but+not+adenine%2C+base+editors+induce+genome-wide+off-target+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.</a> Science. 364 (6437), 292-295 (2019).</li>
<li>Grunewald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+off-target+RNA+editing+induced+by+CRISPR-guided+DNA+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors.</a> Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).</li>
<li>Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+minimization+of+Cas9-independent+off-target+DNA+editing+by+cytosine+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+A%2AT+to+G%2AC+in+genomic+DNA+without+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage.</a> Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、CRISPR-瞑想されたシトシンベースエディタを用いた BRCA1 変異体の機能評価のための簡単な方法を説明する。プロトコルは、標的遺伝子座におけるgRNAの設計とそれらが発現するプラスミド・ドナの構築のための方法を記述する。シトシン塩基エディタは、活性ウィンドウでヌクレオチド変換を誘導する(BE3の場合、gRNA標的配列のPAM-遠位末端のヌクレオチド4〜8)。アクティブウィンドウ内のすべてのシトシンをチミンに置き換えることができるので、研究者は慎重にターゲット配列を選択する必要があります。さらに、ステップ5で説明したように、アクティブウィンドウ内の複数のシトシンを慎重に分析して BRCA1 バリアントの機能を評価する必要があります。
最も重要なステップの1つは 、BRCA1 機能評価の初期突然変異頻度に影響を与える標的細胞株におけるトランスフェクションである。初期突然変異頻度を改善するために、研究者は対象となる細胞株への送達方法を最適化すべきである。ステップ1で説明したように、細胞株を発現するBE3の生成は...

乳癌タイプ1感受性遺伝子(BRCA1)は、広く知られている腫瘍抑制遺伝子である。BRCA1遺伝子はDNA損傷の修復に関連しているため、この遺伝子の変異は、個体1における癌発症のリスクが高くなる。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および膵臓癌はBRCA1遺伝子2の遺伝性機能喪失(LOF)突然変異に関連している。BRCA1変異体の機能評価および同定は、様々な疾患の予防および診断に役立つ可能性がある。BRCA1変異体の機能に対処するために、胚性幹細胞生存アッセイ、蛍光レポーターアッセイ、および治療用薬物ベースの感受性アッセイ3、4、5、6などのBRCA1変異体の病原性を調査するために、いくつかの方法が開発され、広く使用されている。これらの方法は多くのBRCA1変異体の機能を評価しているが、外因的に発現したBRCA1変異体を含む方法は、下流の調節、遺伝子投与量、およびタンパク質折りたたみ7に影響を及ぼす可能性のある過剰発現の点で制限をもたらす。さらに、これらのアッセイは、mRNAスプライシング、転写安定性、および非翻訳領域8,9の効果などの転写後の調節に利用することができない。
CRISPR-Cas9システムは、生きている細胞および生物10における標的ゲノム編集を可能にする。単一ガイドRNAを介して、Cas9は、エラーが起こりやすい非相同性末端結合(NHEJ)経路およびエラーを起こしやすい相同性指向修復(HDR)経路11の2つのDNA修復経路を活性化するために、特定のゲノム遺伝子座で染色体DNA中の二本鎖切断(DSB)を誘導することができる。HDR は、正確な修復メカニズムです。しかし、HDRのCas9ヌクレアーゼによって誘導されたDSBは、しばしば望ましくない挿入および欠失(indel)突然変異をもたらす。さらに、DNA損傷を修復するための相同なドナーDNAテンプレートが必要であり、効率が比較的低い。最近、Cas9ニッカーゼ(nCas9)は、C:GからT:Aの置換を標的とするシチジンデアミネーゼドメインと融合しており、相同なDNAテンプレートおよびDNA二重鎖破断12、13、14、15を必要としない。シトシンベースエディタを用いて、BRCA1バリアント16の機能解析のための新しい方法を開発しました。
本研究では、BRCA1変異体の機能評価を実施するために、効率的なC:GからT:A点突然変異を誘導するCRISPR媒介シトシンベースエディタBE314を用いて、いくつかのBRCA1変異体の機能を同定することに成功した(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig01.jpg"> 図 1: 機能評価のワークフローの概要(A) BRCA1の機能評価を示す回路図。 BRCA1 のLOFは細胞の生存率に影響を与えるので 、BRCA1 突然変異が病原性である場合、細胞は通過数が増加するにつれて死ぬ。(B) BRCA1の機能評価の段階 。ドット ボックスはオプションです。それは、プラスミドDNAを発現するgRNAとBE3の共トランスフェクションに置き換えることができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>ブラストシジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1113903</td><td>形質導入細胞選択薬</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &組織キット</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Genomic DNA prep. kit</td></tr><tr><td>Dulbecco'修正されたイーグル」s medium</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Medium for HEK293T/17 cells Fetal</td></tr><tr><td>usvine serum</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td>Supplemetal for cell culture</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Gibson assembly kit</td></tr><tr><td>Iscove'の修正ダルベッコ'Si 培地</td><td>Gibco</td><td>製 12440046</td><td>HAP1細胞用培地</td></tr><tr><td>lentiCas9-Blast</td><td>Addgene</td><td>52962</td><td>lentiBE3クローニング用プラスミドDNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11668027</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>トランスフェクション材料</td></tr><tr><td>pCMV-BE3</td><td>Addgene</td><td>73021</td><td>プラスミドDNAlentiBE3クローニング</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>細胞培養用サプリメタル</td></tr><tr><td>Phusion 高忠実度DNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0530SQ</td><td>高忠実度ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>ウイルス調製用プラスミドDNA。</td></tr><tr><td>pRG2</td><td>Addgene</td><td>104174</td><td>gRNAクローニングベクター</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>ウイルス調製用プラスミドDNA。</td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>プラスミドDNA調製キット</td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>ゲル抽出キット</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR製品調製キット</td></tr><tr><td>クイックライゲーションキット</td><td>NEB</td><td>M2200</td><td>gRNAクローニング用リガーゼ</td></tr><tr><td>T7 エンドヌクレアーゼI</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>材料T7E1アッセイ</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td>制限酵素</td></tr>用</tbody></table>

crispr媒介ベース・エディタを用いた brca1 バリアントの機能評価

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

最近の研究では、蛍光レポーターアッセイ、胚性幹細胞生存アッセイ、治療用薬物ベースの感受性アッセイなどの様々な機能評価方法を用いて 、BRCA1 遺伝子変異に関連するリスクを調査しています。彼らは多くの BRCA1 変異体を明らかにしているが、外因的に発現した BRCA1 変異体の使用を含むこれらのアッセイは過剰発現の問題に関連しており、転写後の調節には適用できない。これらの制限を解決するために、我々は以前、生細胞における標的ヌクレオチド置換を誘導するCRISPR媒介シトシン塩基エディタを介して BRCA1 変異体の機能分析方法を報告した。この方法を使用して、c.-97C>T、c.154C>T、c.3847C>T、c.5056C>T、c.4986+5G>Aなど、関数があいまいなままのバリアントを特定し、CRISPRメディア化された基本エディタが BR1の不確定な変異体の再分類に役立つことを確認しました。ここでは、CRISPRベースのシトシンベースエディタを用いた BRCA1 変異体の機能解析用プロトコルについて説明する。このプロトコルは、ターゲット・サイトの選択、機能分析、 および BRCA1 バリアントの評価に関するガイドラインを提供します。

このプロトコルに記載された実験的アプローチは、CRISPRベースのシトシンベースエディタによって生成される内因性 BRCA1 変異体の機能評価を可能にする。 BRCA1 変異体の機能評価に適切な細胞株を選択するには、研究者は 、BRCA1 が標的細胞株に不可欠な遺伝子であることを確認する必要があります。例えば、まずCas9とgRNAをHAP1細胞株にトランスフェクトして BRCA1 を破壊し、標的深いシーケンシングによって突然変異周波数を分析しました。HAP1細胞株では経時の変異頻度が有意に減少することがわかった(図4A)。これらの結果は 、BRCA1がHAP1 細胞株における細胞生存率に不可欠な遺伝子であることを示した。C:G~T:A置換変異体が BRCA1の機能に影響を与えるかどうかを調べるため、各変異を誘導する可能性のあるプラスミドDNAコードGRNAをHAP1-BE3細胞株にトランスフェクトし、置換周波数を解析した。病原性変異体であるc.3598C&gt;T(p....

BRCA1突然変異を有する人々は、BRCA1変異体の機能の正確な評価を保証する癌を発症するリスクが高い。本明細書において、生細胞における標的C:GからT:A変換を可能にするCRISPR媒介シトシンベースエディタを用いたBRCA1変異体の機能評価用プロトコルについて説明した。

CRISPR媒介ベース・エディタを用いた BRCA1 バリアントの機能評価

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

CRISPR媒介シトシン塩基エディタを用いて点突然変異を効率的に誘導することにより、疾患予防および診断に重要なBRCA1変異体の機能性を同定することができる。この技術の利点は、内因的に発現したBRCA1を直接変異させることであり、これは外因性発現BRCA1を用いた機能的評価の限界を克服する。BRCA1の機能変異の喪失の同定は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌などのBRCA1突然変異に関連する癌を発症する可能性を予測するために使用することができる。また、機能的な枯渇によって生存率が低下する必須遺伝子を探すことによって、潜在的な薬物標的を見つけるためにも使用できます。まず、NCBIのGenBankからBRCA1ゲノム配列を取得し、目的の突然変異の周りに、プロトスペーサー隣接モチーフ配列NGGNCCNを用いて20塩基対標的部位を探索する。目的の変異は、ガイドRNA標的配列のPAM-遠位末端に4〜8個のヌクレオチド内に位置する必要があります。ガイドRNAにつき2つの無料オリゴヌクレオチドを注文する。フォワードオリゴヌクレオチドの場合、ガイド配列の5'末端にCACCGを加え、逆オリゴヌクレオチドに対して、AACを5'末端に、Cを3'末端に加えます。オリゴヌクレオチドを受け取った後、蒸留水で100ミクロモルの最終濃度に再懸濁する。2つの無料のオリゴヌクレオチドをT4ライゲーションバッファーと10マイクロモルの最終濃度に混合し、95°Cに加熱して室温まで冷却してアニーリングします。制限酵素Bsa1を摂氏37度で1時間消化し、1%アガロースゲルで消化物を実行し、適切なサイズのバンドを精製します。製造者のプロトコルに従って購入したDNAリガーゼを使用して、アニールオリゴヌクレオチド二重鎖をベクターDNAにリゲートし、DH5アルファの有能な細胞に変換します。1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含む寒天プレートに形質転換体を加え、摂氏37度で一晩プレートをインキュベートします。いくつかの形質転換体から血漿DNAを精製し、U6プロモーターでプライムするプライマーでサンガーシーケンシングによって誘導RNA配列を分析します。トランスフェクションの1日前に24ウェルプレートでウェル当たり5倍の10〜5個目のHAP1-BE3細胞を播種し、トランスフェクションのために70〜80%の合流に達するように培養します。トランスフェクトBRCA1ターゲティングガイドRNAは、メーカーのプロトコルに従って購入したトランスフェクション試薬を使用しています。BRCA1標的部位でCGからTAへの変換を誘導するためにBRCA1標的ガイドRNAの1マイクログラムを使用し、3〜4日ごとに37°Cで細胞をインキュベートし、サブカルチャーする。細胞ペレットをトランスフェクション後3、10、24日収穫し、ベース編集効率を分析します。ゲノムDNA精製キットを用いてゲノムDNAを抽出します。BRCA1標的部位を増幅する最初のPCRプライマーを設計します。最初の PCR 製品のサイズに制限はありませんが、特定の領域を効率的に増幅するために、1 キロベース未満の製品サイズを推奨します。NGS読み取り長さに応じたアンプリコンのサイズを考慮して、最初のPCR産物の中に位置する第2のPCRプライマーを設計します。NGS分析に必要な配列を付加するために、2番目のPCRプライマーの5'末端に追加の配列を追加します。高忠実度ポリメラーゼを用いて3つの時点から得られたゲノムDNA上のBRCA1標的部位を増幅する。最初のPCR反応では、15サイクル以上の増幅のために100ナノグラムのゲノムDNAを使用してください。2回目のPCR反応では、20サイクル以上の増幅のために、最初のPCR産物の1マイクロリットルを使用します。2%アガロースゲルで2番目のPCR産物の5マイクロリットルを実行し、サイズを確認します。次に、テキスト原稿に記載されているプライマーを使用して2番目のPCR産物を増幅することにより、NGS分析に必要な配列を取り付けます。異なるプライマーセットを使用して各サンプルを増幅します。2番目のPCR産物の1マイクロリットルを使用して、高忠実度ポリメラーゼを用いた最大30サイクルの増幅を行います。2%アガロースゲルでPCR産物を5マイクロリットル実行し、サイズを確認し、市販のPCRクリーンアップキットを使用して増幅を浄化します。NGS ライブラリを作成するには、各サンプルを同じ量で混合します。分光光度計を用いてNGSライブラリを定量化し、再懸濁バッファーまたはpH 8.5で10ミリモルトリス-HClを使用して1ナノモルの濃度に希釈します。適切な負荷濃度に希釈したライブラリの100マイクロリットルを調製します。対照として、希釈されたサンプルとPhiXを組み合わせた。ライブラリをカートリッジにロードし、製造元のプロトコルに従って NGS を実行します。ベース編集効率の詳細な分析のために、ターゲットアンプリコンあたり10,000以上の読み取りを取得します。このプロトコルは、CRISPRベースのシトシンベースエディタによって生成された内因性BRCA1変異体の機能評価を行うために使用された。CAS-9およびガイドRNAは、BRCA1を破壊するためにHAP1細胞株にトランスフェクトされ、突然変異頻度を分析した。HAP1細胞株における変異頻度は時間の経過とともに有意に減少し、BRCA1がこれらの細胞における細胞生存率に必須の遺伝子であることを示す。CGからTA置換変異体がBRCA1の機能に影響を与えるかどうかを調べるため、各変異を誘導し得るDNAプラスミドおよびコーディングガイドRNAはHAP1-BE3細胞株を有するようにトランスフェクトされた。置換周波数を解析した。3598CからTへの相対的な置換頻度は、ナンセンス突然変異を誘発する病原性変異体であり、劇的に減少した。一方、4527CからTまでのものは、ナンセンス突然変異を誘発する良性変異体であり、時間とともに類似したままであった。これら3つの変異体のヌクレオチド置換頻度は時間依存的に減少することが分かった。日付の経過に伴う細胞生存率の変化を明確に認識するためには、高い初期突然変異頻度を得る必要があるため、最適化されたトランスフェクション条件を確立することが優先事項である。この手順は、BRCA VUSなどの他の未知の遺伝的変異体を検証するために適用することができる。それは患者由来の未知の変異体の病原性およびそれらの治療への手がかりを提供するかもしれない。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

我々は、RNAiを用いて細胞から内因性のBRCA1蛋白質を破壊し、コーディングの変更が含まれているBRCA1点変異体でそれを置き換えることにより、DNA損傷の相同組換え修復のためのアッセイに基づいて組織培養でのBRCA1の変異体をテストするための方法を提供する。...

内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別

このビデオでは、CRISPR-Cas9を使用してゲノムを改変したトランスジェニックショウジョウバエを特定するためのスクリーニング方法を説明しています。CRISPR-Cas9は、科学者が生物のゲノムを操作する方法に革命をもたらした強力なゲノム編集ツールです。このプロトコル例では、トランス活性化配列の挿入によりブランチレス(bnl)遺伝子の最初のエクソンが置き換えられ、bnl遺伝子特異的なドライバーラインであるbnl-LexAが作られる、CRISPRで生成された変異体を同定する方法を見ていきます。...

ゲノム修飾のスクリーニング:ショウジョウバエのCRISPR生成変異体を同定する方法

このビデオでは、標的ヌクレオチド置換を誘導するためのCRISPRを介したシトシンベースエディターの概念を説明しています。...

CRISPRを介した塩基編集ツール:標的塩基置換を誘導するゲノム編集技術

NGSシーケンシングのためのgDNA濃縮は、体質的突然変異の研究のための簡単で強力なツールです。この記事では、DNA損傷修復に関与する11個の遺伝子の完全な配列を簡単に解析する手順を紹介します。...

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

このプロトコルは哺乳類細胞における点突然変異の修復システムを編集 CRISPR/Cas9 ベースの遺伝子のワークフローについて説明します。ここで、ターゲット ・ サイトで塩基形成測定の詳細な後続実験的戦略と遺伝子編集へのコンビナトリアル...

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

CRISPR Cas は植物や動物の複雑なゲノムをエンジニア リングする強力な技術です。ここでは、我々 は異なる Ca 酵素を使用して人間のゲノムを効率的に編集するためのプロトコルを詳しく説明します。我々...

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR /...

CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

このプロトコルは、マイクロRNAクラスターネットワーク解析のための、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)遺伝子編集ワークフローをクラスター化したハイスループットのクラスター化を記述しており、1回の実験で35...

マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

このプロトコルは、zSpRY-ABE8eを使用して正確なゼブラフィッシュ病モデルを構築するために、PAMの制限なしに効率的なアデニン塩基編集を実行する方法について説明します。...

zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集

CRISPRのような技術に対する大きな障壁は、重要な遺伝子を破壊する可能性のあるオフターゲットイベントです。「Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by...

オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

RNAとしてゲノム編集者を送達することは、一次哺乳類の細胞や細胞株のゲノム改変において特に強力な手段です。このプロトコルの目的は、ゲノム編集者をmRNAとして一次哺乳類の細胞および細胞株に届け、その後、Illuminaの標的シーケンスと解析を行って編集結果を定量化することです。...

一次哺乳類細胞におけるエディタRNAのエレクトロポレーションによるゲノム編集

学ぶ CRISPR媒介シトシンベースエディタを用いたBRCA1バリアントの機能評価法。内因性発現BRCA1を直接変異させ、がんリスク予測や薬剤標的発見に応用できる正確な評価プロトコルを確立する。

CRISPR媒介ベース・エディタを用いた BRCA1 バリアントの機能評価

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