Name: ヒト臍帯血幹細胞(CB-SC)由来エキソソームによる治療後の単球の異定異性マクロファージへの分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ、臍帯血幹細胞由来エキソソームの単離法と単球への免疫調節効果。遠心分離とろ過を用いて高純度エキソソームを精製し、M2マクロファージへの分化を誘導するメカニズムを解明する再生医療の新たなアプローチです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、ハッケンサックUMC財団を通じて寛大な資金援助をしてくれたポダー氏とルートヴィヒ氏に感謝しています。私たちは、英語の編集のためにローラ・ジャオに感謝します。

<ol><li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3(2012).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+%28CB-SCs%29+in+stem+cell+educator+therapy%3A+phase+I%2FII+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160(2013).</li>
<li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy%3A+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87(2015).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+And+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer%3A+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis%2C+biomarkers+in+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763(2018).</li>
<li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+myocardial+repair%3A+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li>
<li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Review+and+Report%22%5BJournal%5D)">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li>
<li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+%28CB-SC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165(2020).</li>
<li>Jacobson, G., Kårsnäs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li>
<li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDykstra%2C+MJ+%22Biological+Electron+Microscopy%3A+Theory%2C+Techniques%2C+and+Troubleshooting%22">Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting</a>. , Springer Science & Business Media. (2011).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%3A+different+gene+signatures+in+M1%28LPS%2B%29+vs.+classically+and+M2%28LPS-%29+vs.+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084(2019).</li>
</ol>

Zhao博士は、天河幹細胞バイオテクノロジー社の創設者であり、幹細胞教育者技術の発明者です。他のすべての著者は、提出された作業に関連する可能性のある金銭的利益を持っていません。

エキソソームの応用は、臨床診断、医薬品開発、再生医療の新たな分野です。ここでは、CB-SC由来エキソソームの調製とヒト単球の分化に関するエキソソームの機能研究に関する詳細なプロトコルを提示する。現在のプロトコルは、機能的CB-SC由来エキソソームが高純度で逐次遠心分離と超遠心分離によって単球に免疫変調を示すことによって単一体化されることを実証した。
他の従来のプロトコルと比較して、限外濾過は、他の細胞外小胞(EV)とは異なる分子量および排除サイズに基づいて、異なる細胞または媒体からのエキソソームの単離および精製のための確立されたアプローチである。限外濾過分離は、超遠心分離よりも時間の節約が多いが、大きなサイズで小胞に構造的な損傷を引き起こす可能性がある。エキソソームはまた、ポリエチレングリコール(PEG)媒介沈殿物によって低コストで収集することができるが、この方法はタンパク質汚染13、14によるエキソソーム純度のリスクがある。したがって、現在のプロトコルは、高純度で...

臍帯血幹細胞(CB-SC)は、ヒト臍帯血から同定された独自のタイプの幹細胞であり、間葉系幹細胞(MSC)および造血幹細胞(HSC)1などの他の既知のタイプの幹細胞と区別される。免疫変調の特性とペトリ皿の表面にしっかりと付着する能力に基づいて、我々は臨床試験2、3で幹細胞教育者(SCE)療法として指定された新しい技術を開発しました。SCE療法の間に、患者の末梢血単核細胞(PBMC)は細胞分離器を介して集め、循環し、インビトロの付着CB-SCと共培養される。これらの「教育された」細胞(CB-SC処理PBMC)は、閉ループシステムで患者の循環に戻されます。臨床試験は、1型糖尿病(T1D)2、4および脱毛症(AA)5を含む自己免疫疾患の治療に対するSCE療法の臨床的安全性および有効性を既に実証している。
エキソソームは、直径30\u2012150 nmのナノ粒子ファミリーであり、すべての生体流体および細胞培養培地6に存在する。エキソソームは、脂質、mRNA、タンパク質、マイクロRNA(miRNA)を含む多くの生理活性分子で富化され、細胞間通信において重要な役割を果たします。最近では、エキソソームは、診療所7、8、9の治療の可能性のために、研究者や製薬会社にとってより魅力的になっています。最近、我々の機械学的研究はCB-SC放出エキソソームがSCE療法10の免疫調節に寄与することを実証した。
ここでは、CB-SC放出エキソソームによる単球を標的とするSCE療法のメカニズムを探るプロトコルについて述べる。まず、CB-SC放出エキソソームを超遠心分離法を用いてCB-SC由来のコンディション培地から分離し、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット(WB)および動的光散乱(DLS)によって検証した。第2に、CB-SC由来エキソソームは、緑色蛍光性親油性色素であるディオで標識した。第三に、彼らは、フローサイトメトリーによるPBMCの異なる亜集団におけるディオ標識CB-SC由来エキソソームの正の割合を調べるためにPBMCと共培養した。このプロトコルは、幹細胞の免疫調節の基礎となるエキソソームの作用を研究するためのガイダンスを提供する。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 円錐管</td><td>ファルコン</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル プレート</td><td>ファルコン</td><td>351147</td><td>非組織培養 プレート</td></tr><tr><td>3,3'-ジオスタデシロキサカルボシアニン過塩素酸塩 (Dio)</td> <td>ミリポア シグマ</td><td>D4292-20MG</td><td>4 度で保存;C</td></tr><tr><td>300 メッシュグリッド</td><td>Ted Pella</td><td>1GC300</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>組織培養プレート</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>組織培養プレート</td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Amicon-15 10kDa 遠心分離機フリターユニット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>アンチヒューマンアリックス</td><td>バイオレジェンド</td><td>634501</td><td>4°で保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_2268110反ヒトカルネキシン</td><td>バイオレジェンド</td><td>699401</td><td>4°で保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_2728519抗ヒトCD11c抗体、Pe-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>561356</td><td>4°Cで保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_10611859抗ヒトCD14抗体、カルマオレンジ</td>ベ<td>ックマンコールターB36294</td><td></td><td>ストア4°C;C、RRID:AB_2728099</td></tr><tr><td>抗ヒトCD163抗体、PE</td><td>BD Bioscience</td><td>556018</td><td>4°で保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_396296抗ヒトCD19抗体、PC5</td><td>ベックマンコールター</td><td>IM2643U</td><td>4°Cで保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_131160抗ヒトCD206抗体、FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>551135</td><td>4°で保存。C、RRID:AB_394065</td></tr><tr><td>抗ヒトCD209抗体、ブリリアントバイオレット421</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>564127</td><td>4°で保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_2738610抗ヒトCD270抗体、PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>318806</td><td>4°で保存。C、RRID:AB_2203703</td></tr><tr><td>抗ヒトCD3抗体、Pacfic Blue</td><td>Biolegend</td><td>300431</td><td>4°で保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_1595437抗ヒトCD34抗体、APC</td><td>ベックマンコールター</td><td>IM2427U</td><td>4°Cで保存。C、RRID:N / A</td></tr><tr><td>抗ヒトCD4抗体、APC</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>555349</td><td>4°Cで保存。C、RRID:AB_398593</td></tr><tr><td>抗ヒトCD45抗体、Pe-Cy7</td><td>ベックマンコールター</td><td>IM3548U</td><td>4°Cで保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_1575969抗ヒトCD56抗体、PE</td><td>ベックマンコールター</td><td>IM2073U</td><td>4°Cで保存。C、RRID:AB_131195</td></tr><tr><td>抗ヒトCD63抗体、PE</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>561925</td><td>4°で保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_10896821抗ヒトCD8抗体、APC-Alexa Fluor 750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94686</td><td>4 &deg;C、RRID:N / A</td></tr><tr><td>抗ヒトCD80抗体、APC</td><td>ベックマンコール</td><td>ターB30642</td><td>ストア4°C;C、RRID:N /</td></tr><tr><td>A 抗ヒトCD81抗体、FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>561956</td><td>4°で保存。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_394049抗ヒトCD86抗体、APC-Alexa Fluor 750</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30646</td><td>4 &deg;C、RRID:N / A</td></tr><tr><td>抗ヒトCD9抗体、FITC</td><td>ThermoScientic</td><td>MA5-16860</td>は<td>4°で保管します。C、RRID:</td></tr><tr><td>AB_2538339抗ヒトガレクチン9抗体、ブリリアントバイオレット421</td><td>バイオレジェンド</td><td>348919</td><td>4°Cで保存。C、RRID:AB_2716134</td></tr><tr><td>抗ヒトOCT3 / 4抗体、eFluor660</td><td>ThermoScientic</td><td>50-5841-82</td>は<td>4°で保管します。C、RRID:AB_11218882</td></tr><tr><td>抗ヒトSOX2抗体、Alexa Fluor 488</td><td>ThermoScientic</td><td>53-9811-82</td>は<td>4°Cで保管されています。C、RRID:AB_2574479</td></tr><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A1933</td><td></td></tr>バ<tr><td>フィーコート</td><td>ニューヨーク血液</td><td>センター40-60ml</td><td></td> /単位</tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>ファルコン</td><td>353085</td><td></td></tr>使い捨て<tr><td>セミマイクロキュベット</td><td>VWR</td><td>97000590</td><td></td></tr><tr><td>解離バッファー</td><td>Gibco</td><td>131510014</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Dual-Chanber 細胞計数スライド</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10606D</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td><td>GE Health</td><td>17-1440-03</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>固定角ローター(25°C)</td><td>Thermo Scientifc</td><td>75003698</td><td>Maxium 24,700 x g</td></tr><tr><td>Gallios フローサイトメーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>3 lasers 10 色 最大</td></tr><tr><td>ヒト臍帯血</td><td>クライオセル インターナショナル</td><td></td><td>40-100 ml/unit</td></tr><tr><td>ヒト Fc ブロック</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>564220</td><td>4 °C で保管;C</td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF メンブレン</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP シリンジフィルターユニット、0.22 &micro;m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker MP4</td><td>BioExpress</td><td>S-3500-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>BD Bioscience</td><td>56-66211E</td><td>4 °C で保管。C</td></tr><tr><td>ニコン エクリプス Ti2 顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメンツ株式会社</td><td>エクリプス Ti2</td><td>NIS-Elements ソフトウェア バージョン 5.11.02</td></tr><tr><td>Hochest 33342</td><td>Thermo Scientifc</td><td>62249</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Revert microsopy</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>12563518</td><td></td></tr><tr><td>ローター 41 Ti</td><td>ベックマン コールター</td><td>331362</td><td>Maxium 41,000 rpm</td></tr><tr><td>Sorvall St 16R 遠心分離機</td><td>サーモScientifc</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター</td><td>Thermo Scientifc</td><td>75003655</td><td></td></tr><tr><td>TC-20 セルカウンター</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscopy</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>Beckmanコールター</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>X'VIVO 15 無血清培地</td><td>ロンザ</td><td>BEBP04-744Q</td><td>1000 ml 培地、4 °C;ハ</td></tr></tbody></table>

ヒト臍帯血幹細胞(cb-sc)由来エキソソームによる治療後の単球の異定異性マクロファージへの分化

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

幹細胞教育者(SCE)療法は、1型糖尿病および他の自己免疫疾患の治療のための新しい臨床アプローチである。SCE療法は、単離された患者の血液単核細胞(例えば、リンパ球および単球)をアフェレシス機を介して循環し、SCE装置中の接着性臍帯血由来幹細胞(CB-SC)を有する患者の血液単核細胞を共培養し、これらの「教育された」免疫細胞を患者の血液に戻す。エキソソームは、すべての生体流体および細胞培養媒体に存在する30\u2012150 nmの間のナノサイズの細胞外小胞である。SCE療法の基礎となる分子メカニズムをさらに探求し、CB-SCから放出されるエキソソームの作用を調べるため、CB-SCによる治療中にこれらのエキソソームを食作用させる細胞を調べる。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)と共に標識されたCB-SC由来エキソソームを共培養することにより、CB-SC由来エキソソームはヒトCD14陽性単球によって主に取り込まれ、スピンドル様形態とM2関連表面マーカーの発現を伴う単球の分化(M2)につながることがわかった。ここでは、CB-SC由来エキソソームの分離と特徴付けのためのプロトコルと、ヒト単球とCB-SC由来エキソソームの共培養とM2分化のモニタリングのためのプロトコルを提示する。

当初、CB-SCの表現型と純度を、白血球共通抗原CD45、ES細胞特異的転写因子OCT3/4、およびSOX2などのCB-SC関連マーカーを用いてフローサイトメトリーにより調べた。CB-SCはCD45、OCT3/4、SOX2、CD270、およびガレクチン9の発現を高レベルで表示するが、CD34の発現は一切ない(図1A)。フローサイトメトリー解析では、CD9、CD81、およびCD63を含むエキソソーム特異的マーカーの発現がCB-SC由来エキソソーム上にあったことを確認した(図1B)。エキソソームの形態およびサイズ分布は、TEMおよびDLS(図1C,D)によって特徴付けられており、サイズは79.38±20.07 nmであった。ウェスタンブロットは、さらに、エキソソーム関連マーカーアリックスの発現を証明し、ER関連マーカーカルネキシンの発現を伴わない(図1E)。
<p...

エキソソームアプリケーションは、医薬品開発と再生医療のための新たなツールです。我々は、高純度のエキソソーム分離プロトコルを確立し、機械学的研究のためにCB-SCと呼ばれる新しい同定された幹細胞からエキソソームを分離する。また、CB-SC由来エキソソームをヒト単球と共培養し、その分化を、定型的に区別するマクロファージに導いた。

ヒト臍帯血幹細胞(CB-SC)由来エキソソームによる治療後の単球の異定異性マクロファージへの分化

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

幹細胞教育者療法は、I型糖尿病および他の自己免疫疾患を治療するために開発されました。この方法は、CB-SC放出エキソソームを通じて幹細胞教育療法の免疫モデレーションの基礎となる分子メカニズムを探求するために開発された。このプロトコルは、ヒト臍帯血幹細胞培養物からエキソソームを精製し、単球の免疫調節を決定する方法についてのガイダンスを提供する。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生であるWei Huです。まず、CB-SC由来のコンディション培地をテキスト原稿に記載した3回遠心分離し、各遠心分離後に上清を新しい50ミリリットル円錐形管に集める。第3遠心分離後、得られた上清を0.22マイクロリットルのフィルターで濾過し、15ミリリットルの培地を各10キロダルトン遠心フィルター装置に移します。遠心分離機は4,000xgで30分間、濃縮エキソソーム培地を分離する。濃縮エキソソームを超遠心チューブに移します。その後、エキソソームを摂氏4度で80分間100,000xgでペレット化する。その後、上清を捨て、PBSの10ミリリットルでペレット化エキソソームを再懸濁します。最終的な超遠心分離を行い、エキソメペレットを回収し、PBSの200マイクロリットルで再懸濁します。摂氏4度で10分間、300xgの15ミリリットルチューブと遠心分離機に3,000万個のヒトPBMCを加えます。冷たいPBSの300マイクロリットルで細胞を再懸濁し、CD14マイクロビーズの60マイクロリットルを追加します。よく混ぜて、15分間氷の上の細胞をインキュベートします。冷たいPBSと遠心分離機を摂氏4度で10分間300xgでさらに6ミリリットル加えます。次に、ペレット化された細胞を500マイクロリットルのコールドランニングバッファーに再懸濁します。分離カラムをマグネットセパレータに入れ、2ミリリットルのコールドランニングバッファで3回洗います。再中断した細胞を分離列に移し、通過させます。繰り返しますが、1回の洗浄ごとに2ミリリットルのランニングバッファでカラムを3回洗います。次に、マグネットセパレータから柱を持ち上げ、氷の上に15ミリリットルの遠心管の上に置きます。2ミリリットルのコールドランニングバッファーを持つCD14陽性細胞をエルテし、300 x gで摂氏4度で10分間遠心して細胞をペレット化する。ペレットを2ミリリットルの冷たい化学定義血清培地で再懸濁し、50マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。得られた細胞を、10マイクロリットルのクロームオレンジ共役抗ヒトCD14モノクローナル抗体を20分間染色する。細胞をペレットにするために300 x gでPBSと遠心分離機を1ミリリットル加えます。細胞ペレットをPBSの200マイクロリットルに再懸濁し、5ミリリットルのチューブに移します。フローサイトメトリーによりCD14+単球の純度を測定します。得られた精製単球の種子100万は、6ウェルプレートを処理し、5%の二酸化炭素の下で摂氏37度で2時間インキュベートする。インキュベートを廃棄し、37度の事前温められた化学物質定義された血清不全培養培地の2ミリリットルを穏やかに加え、その後、CB-SC由来エキソソームの80マイクログラムを6ウェルプレートの単球培養物に加え、総容量は2ミリリットルである。5%の二酸化炭素の下で37°Cでプレートを3〜4日間インキュベートします。次に、200倍の倍率で反転顕微鏡を使用して細胞形態を画像化します。PBSベースの細胞解離バッファーを1ミリリットル加え、上下にピペット処理して細胞を取り外し、残りの細胞を細胞スクレーパーで収穫します。1,690 x gで5分間遠心分離して細胞を回収し、200マイクロリットルのPBSで再懸濁します。FCブロッカーを5マイクロリットル加え、非特異的結合をブロックし、抗体を追加します。室温で30分間培養します。インキュベートされた細胞にPBSを1ミリリットル加え、300 x gで10分間遠心分離します。PBSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁し、サンプルあたり5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを添加する。細胞を新しい5ミリリットルのフローチューブに移し、フローサイトメトリーを行い、CD14、CD80、CD86、CD163、CD206、およびCD209発現のレベルを評価します。CB-SCの表現型および純度を、CB-SC関連マーカーを用いたフローサイトメトリーによって調べた。この分析では、CD45、OCT3/4、SOX2、CD270およびガレクチン9の発現は高レベルであったが、CD34の発現は認められなかった。フローサイトメトリー解析では、CB-SC由来エキソソーム上のエキソーム特異的マーカー、CD9、CD81、およびCD63の発現も確認できます。エキソソームのサイズ形態はTEMによって特徴付け、サイズ分布はDLSによって決定された。ウェスタンブロットは、ER関連マーカー、カルネキシンの発現を伴わないエキソメ関連マーカーアリックスの発現をさらに証明する。ジオ標識CB-SC-ExoとPBMCの直接相互作用は、蛍光顕微鏡を用いて観察された。CB-SC-Exoとラベル付けされたダイヤルと相互作用する細胞集団をより良く定義するために、異なる細胞コンパートメントは、T細胞用CD3、骨髄樹状細胞用CD11C、単球用CD14、B細胞用CD19、NK細胞用CD56などの細胞特異的マーカーでゲート付けされた。単球は、他の免疫細胞よりも高い中央値蛍光強度を示したため、主にCB-SC由来のエキソソームによって標的とされた。エキソソームは単球をスピンドル様形態に分化し、正常に分化した。CB-SC由来エキソソームによる治療後、CD163、CD206、CD209などのM2関連マーカーのレベルに上位調節があった。従来のM2マクロファージとCB-SC外発性M2マクロファージとの間のフェノミカル比較は有意差を示さなかった。このプロトコルの重要なステップは、CB-SC由来エキソソームを6ウェルプレートの培養物に追加し、3〜4日間インキュベートすることです。次に、2型マクロファージへの単球の分化誘導に寄与したCB-SC由来エキソソーム内部の分子成分を探る。

differentiation-monocytes-into-phenotypically-distinct-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からマクロファージを生成するためのin...

ヒト誘導多能性幹細胞のマクロファージへの分化

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞である。ここでは、使用して簡単に説明する...

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

私たちは、ヒトマクロファージの生成のための簡単​​かつ効率的なプロトコルを提示する。バフィーコートは、二重密度勾配遠心分離によって処理され、単離された単球は、次いで、テフロンコーティングした細胞培養バッグ中でマクロファージに分化される。これは、マクロファージ収量を最大化し、その後の実験のために細胞の回収を容易にします。...

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

ここでは、翻訳適用のために不均一な骨髄から大量のマウス単球を生成するプロトコルを紹介します。他の方法と比較して、この新しい方法は、高勾配磁気細胞分離(MACS)などの高価な方法を回避することにより、犠牲になる動物の数を減らし、コストを削減するのに役立ちます。...

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

未成熟樹状細胞は、免疫と耐性のバランスを調整するために、寛容性または成熟性樹状細胞に選択的に分化させることができます。この研究は、未熟な単球由来樹状細胞(moDC)、代謝表現型が異なるin...

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)分化ヒト単球由来マクロファージの細胞培養のためのプロトコールが提示されます。このプロトコルは、単球の凍結保存とマクロファージへのバルク分化を組み合わせて利用します。その後、回収したマクロファージを、実験に必要な細胞密度の培養ウェルに播種することができます。...

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

この研究では、in vitro樹状細胞(DC)を得るためのヒト単球単離の2つの異なる方法を比較しています。単球は接着によって選択されるか、磁気分離によって負に濃縮されます。単球の収量と生存率、および MDDC 生存率、増殖、および CD11c/CD14...

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

ここでは、4つの骨髄系統に対する臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞の免疫発食特性特性およびサイトカイン誘導分化のためのプロトコルを提示する。このプロトコルの応用には、CD34+細胞の骨髄性分化に対する骨髄疾患変異または小分子の影響に関する調査が含まれる。...

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞からのマクロファージの堅牢な生成とその後の特性評価のための方法を記述する。細胞表面マーカー発現、遺伝子発現、および機能アッセイは、これらのiPSC由来マクロファージの表現型および機能を評価するために使用される。...

多能性幹細胞からのヒトマクロファージの生成と特性

破骨細胞は、体内の重要な骨吸収細胞です。このプロトコルは、ヒト末梢血単球からの破骨細胞の in vitro...

機能性破骨細胞のヒト末梢血CD14+ 単球との鑑別

単球とマクロファージは、健康と病気に不可欠な非常に可塑的で再プログラム可能な免疫細胞です。彼らは、特定の分化プログラムと表現型を採用することにより、幅広い刺激を感知し、反応します。私たちは、マクロファージの分極とリプログラミングを研究するためのin-vitroモデルを標準化し、研究に貴重なツールを提供しています。...

In-vitroアッセイのためのヒト単球由来マクロファージのリプログラミングモデル

学ぶ、臍帯血幹細胞由来エキソソームの単離法と単球への免疫調節効果。遠心分離とろ過を用いて高純度エキソソームを精製し、M2マクロファージへの分化を誘導するメカニズムを解明する再生医療の新たなアプローチです。

ヒト臍帯血幹細胞(CB-SC)由来エキソソームによる治療後の単球の異定異性マクロファージへの分化

さらに動画を探す