細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング
January 13th, 2021
ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。
当社のプロトコルは、通常のフルオロフォアプローブと、画像化された細胞を生理学的状態に維持する簡単な標本調製技術を使用して、高度に動的な細胞プロセスと詳細なサブ細胞構造を研究しています。この技術は、特別なまたは一時的な解像度のいずれかを犠牲にすることなく、超解像度で、生理学的条件下で細胞プロセスを調査することができます。12~14キロの分子量カットオフ透析膜を小片に切り取り、100マイクロリットルの生細胞培地で約5分間浸漬します。
膜が浸っている間に、50ミリリットルのチューブの外輪を小さく切り、70%エタノールで滅菌します。精巣解剖と取り付けのために、10 2〜3日前の麻酔付きオスハエを解剖顕微鏡の下で解剖皿に移し、精巣を取り除くために細かい鉗子を使用する。すべての精巣を採取したら、精巣を生細胞培地で2回洗浄し、ピペットチップを使用して、調製したガラス底皿に100〜150マイクロリットルの生細胞培地を広げます。
フライの精巣を皿の中央に移し、培地の約10マイクロリットルを除いてすべてを取り除くために細かい鉗子を使用してください。すぐに、精巣の上にプリウェット膜を置き、膜上に2〜3つの小さなプラスチックの重量を置きます。すぐに、新鮮な生きた細胞媒体の100〜150マイクロリットルを加え、リングを皿の高い側に戻します。
カバースリップをリングに戻し、紙をカバースリップに置く前に、水にティッシュペーパーを回します。その後、蓋で皿をカバーし、超解像度顕微鏡のステージ上で皿を固定します。生殖細胞の幹細胞イメージングの場合は、イメージングソフトウェアを開き、透過光をオンにします。
精巣組織に焦点を当て、レーザーをオンにするために、63Xの目的を使用してください。「ライブ」をクリックして、胚芽幹細胞を見つけます。フォーカスを調整して「フレームサイズ」をクリックして、512 x 512 x 1024 x 1024 ピクセルの間にフレームサイズを設定し、「平均」を使用してフレーム平均を 1 つまたは 2 つに設定します。
「マスターゲイン」をクリックして電子乗算ゲインを800未満に設定し、レーザーを「レーザー」を使用して、画像取得時間を短縮し、写真の漂白を減らすために、目的の領域またはセルにレーザーパワーを1%から2%ズームに設定し、画像が「実験開始」をクリックする前に最適に設定されていることを確認します。Airyscan取得が最適に構成されていない場合は、フレームサイズ、Zスタック、スキャンエリアのセクションで「最適」をクリックし、実験計画と試料の種類に応じて、時間間隔、Zスライスの数およびタイムラプスイメージングの持続時間を最適化します。イメージング後、[処理]、[バッチ]、および [Airyscan 処理] を選択し、処理するイメージを選択します。
次に、「プロセスを実行」をクリックして、スーパー解像度のイメージを取得します。ショウジョウバエの生細胞イメージングは、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて初期段階の生殖細胞でアルファ尿細管GFPを発現し、母中心体での明るい信号および娘セントロソームでの比較的弱い信号として、2つの中心体でのGFP信号の非対称強度の視覚化を可能にする。明るさの差は微小管核形成の時間的非対称性によって反映される可能性が高いが、微小管の詳細な形態および量は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して解決できない。
対照的に、生細胞超解像度イメージングは、微小管形態および数の可視化と定量を可能にする。この改善された解像度はまた、非対称微小管核形成、伸びおよび核膜との相互作用の増加のパターンを明らかにする。生細胞イメージングはまた、非対称核膜の侵入の視覚化を可能にするが、核に直接入る個々の微小管の視覚化は可能ではない。
対照的に、この生細胞超分解能技術は、微小管と核層の両方を同時にイメージングすることによって、これらの事象を直接観察することを可能にする。転移の間、両方の姉妹セントロメレは、マイクロチューブ中央の付着物を観察することはできませんが、回転ディスク顕微鏡を使用して1つの信号として検出することができます。対照的に、超解像度ライブイメージングは、初期のフェーズで微小管セントロメア付着の可視化を可能にする。
精巣の上に膜を置いて、イメージング中に移動や浮動がないようにし、顕微鏡の設定を最適化して、写真の漂白や光の毒性を避けるようにしてください。この方法は、タンパク質のダイナミクス、線形応力、細胞防御やプロセスの調査など、さまざまな方法で適用できます。
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概要
このプロトコルは、成体の幹細胞集団が自然環境下で動的細胞プロセスを研究するために、完全な組織内でのスーパーレゾリューションライブセルイメージングの方法を提示します。時間的・空間的解像度のバランスを取り、生きた組織内の生物学的現象を効果的に観察します。
主要な研究構成要素
研究領域
- 細胞生物学
- 顕微鏡法
- ライブセルイメージング
背景
- イメージングにおける生理的条件の維持の重要性
- 動的細胞プロセスの観察の課題
- 従来の顕微鏡技術との比較
使用された方法
- スーパーレゾリューションライブセルイメージング
- 生物学的システムとしてのショウジョウバエの精巣
- 蛍光プローブとスピニングディスク共焦点顕微鏡の使用
主要な結果
- 微小管のダイナミクスと形態の強化された可視化
- 非対称な微小管の核形成と核膜との相互作用の明らか化
- 中期および前期における中心体付着の観察が可能に
結論
- この研究は、細胞のダイナミクスを観察するためのスーパーレゾリューションイメージングの有効性を示しています。
- この方法は、発生生物学における細胞プロセスの理解に大きく貢献しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Super-resolution live-cell imaging in intact tissue enables high-fidelity observation of dynamic subcellular processes under physiological conditions, addressing a critical gap in target validation and mechanistic de-risking. By preserving spatial and temporal resolution without requiring specialized probes or high illumination, this method supports reliable phenotypic screening and assay development in disease-relevant systems. Its compatibility with endogenous low-intensity fluorophores expands applicability to early discovery workflows where target confidence and predictive value are paramount.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of target engagement and subcellular localization in native tissue context, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of protein dynamics and complex formation without fixation artifacts.
- Translational Value: Facilitates target confidence assessment in disease-relevant models like stem cell niches.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative readouts of microtubule morphology, nucleation patterns, and organelle interactions for assay standardization.
- Operational Value: Enables time-lapse imaging with low phototoxicity, supporting longitudinal screening campaigns.
- Translational Value: Generates reproducible, high-content data suitable for hit validation and lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical stages by observing cellular processes in intact tissue under near-physiological conditions.
- Operational Value: Maintains tissue morphology and cellular function for extended imaging, supporting longitudinal studies.
- Translational Value: Enables biomarker-adjacent observations such as nuclear membrane remodeling and centrosome asymmetry.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing super-resolution readouts that inform target validation and lead identification decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of cytoskeletal dynamics and nucleocytoplasmic interactions in live tissue.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs suitable for assay standardization and compound effect evaluation.
- Analytics: Generates super-resolution datasets quantifying microtubule numbers, elongation rates, and spatial organization for comparative analysis.
- Translational Research: Supports continuity from subcellular observation to tissue-level phenotypes in stem cell niches.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across cell types and disease models without probe engineering.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by resolving subcellular mechanisms invisible to diffraction-limited microscopy.
- Operational Value: Delivers standardization through specimen immobilization, low-laser imaging, and batch processing workflows.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by improving target validation fidelity in physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of cytoskeletal and nucleoskeletal targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live tissue handling, super-resolution microscopy, and image processing pipelines.
- Depends on access to super-resolution systems with Airyscan or equivalent capabilities and environmental control chambers.
- Necessitates standardization of specimen preparation, mounting, and medium composition across users and sites.
- Involves adaptation considerations for varying tissue fragility, autofluorescence, and genetic accessibility beyond Drosophila testis.
- Limited by the need for genetic tagging of targets with compatible fluorophores such as EGFP or mCherry at endogenous loci.
