トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

反復転写因子や無秩序な転写因子の構造関数解析を行うことは困難です。トランスクリプトミクスを適切な細胞コンテキストと組み合わせることで、このアプローチは重要な構造機能の関係をより明確にします。RNAシーケンシングを機能的なアウトプットとして使用することで、1回の実験で1つのタンパク質によって制御されるすべての遺伝子を効果的に評価することができ、部分的な機能検出の可能性が高まります。

部分機能の検出は、発がん性融合転写因子にとって特に重要ですが、これらのタンパク質がどのように機能し、そのシーケンシングが融合がんのより良い治療法につながるかはわかっていません。EWS/FLIでは無秩序なEWSドメインに焦点を当てますが、EWSは、機能が十分に定義されていない無秩序ドメインを含む他の融合に関与しています。cDNA発現コンストラクトの形質導入のためには、まず、凍結したウイルスをcDNAコンストラクトと共に摂氏37度の水浴中で迅速に解凍し、各バイルに2.5マイクロリットルの8ミリグラム/ミリリットルのポリブレンを穏やかに混合します。

次に、バイアルコンストラクトあたり1つの50〜70%コンフルエント10センチメートル細胞培養プレートから培地を取り出し、プレートの側面に2ミリリットルのコンストラクト全体を静かにバイパスします。プレートを揺さぶってウイルスを細胞全体に均一に広げ、プレートを摂氏37度の組織培養インキュベーターに2時間置き、プレートの任意の領域が乾燥するのを防ぐために30分ごとにプレートを揺さぶります。インキュベーションの終わりに、ウシ胎児血清、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、およびポリブレンを補充した5ミリリットルの培地を追加します。

細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートした後、上清を選択培地に交換し、細胞をさらに7〜10日間細胞培養インキュベーターに戻して、選択とcDNAコンストラクトの発現を可能にします。選択期間の終わりに、細胞を計数のために15ミリリットルの円錐形チューブに収集し、5番目の細胞に10の5倍から10倍をRNAシーケンシング用の新しいチューブに割り当て、6つの細胞に10の2倍をタンパク質抽出用の別の新しいチューブに割り当てます。遠心分離によって細胞を沈殿させ、ペレットを1ミリリットルの冷たいPBSまたは5分間の遠心分離に再懸濁します。

次に、ペレットと液体窒素の両方を急速凍結し、細胞をマイナス80°Cで保存します。目的タンパク質のノックダウンおよびコンストラクトパネルの発現を検証するには、標準的なウェスタンブロット解析プロトコルに従って、タンパク質ライセートサンプルを適切な一次抗体および二次抗体でブロットします。RNAの質と量を評価するには、シリカスピンカラムベースの抽出キットの溶解バッファーを使用して、RNAシーケンシング細胞サンプルを溶解し、ライセートをゲノムDNA除去カラムに13,000回転/分以上で30〜60秒間適用します。

次に、シリカスピンカラムの精製を進め、キットの指示に従ってカラム上のRNAを洗浄します。次に、30 μリットルの溶出バッファーで RNA を溶出し、少なくとも 2.5 μg の RNA を分光光度計で 260 から 280 ナノメートルの比率で分析して、RNA の量とサンプルの品質を評価します。fastqファイル解析の場合は、Puttyを使用してターミナルをハイパフォーマンスコンピューティング環境に開き、projectという解析ディレクトリを作成します。

プロジェクトディレクトリへのパスに移動し、圧縮された生のfastq. gzファイル用のディレクトリ「fastq」と「trimmed」という2番目のディレクトリを作成します。私たちは、圧縮された生のfastqを転送するための適切な安全なファイル転送プログラムです。

gzファイルをローカルストレージからプロジェクトのfastqディレクトリへのパスに移動し、各サンプルにR1ファイルとR2ファイルがあることを確認します。プロジェクト fastq へのパスに移動し、示されているように trim galore のコマンドを使用して、fastq からの低品質の読み取りをトリミングします。gz ファイル。

プロジェクトディレクトリへのパスに移動し、STAR output という新しいディレクトリを作成します。プロジェクトの trim ディレクトリへのパスに移動し、示されているコマンドを使用して STAR を実行し、トリミングされた fastq を整列させます。gz ファイル。

次の手順に必要な出力 (指定された位置の転写産物ごとのカウントを含む) を見つけ、コマンドを使用して各 reads per gene out タブ ファイルを読み込みます。最初の列には、ダウンストリーム処理を容易にするために、ENSEMBL gene ID列のピリオドより前の文字のみを使用してください。次に、コマンドを使用して、すべてのサンプルのカウントを totcts というデータ フレームにコンパイルし、この新しい生カウント データのテーブルをタブ区切りのテキスト ファイルとして保存します。

DESeq2 を使用して各コンストラクトの差分発現プロファイルを定義するには、実験的な DESeq2 計画を入力し、行列関数からの DESeq データセットを使用して DESeq データセットを作成し、サイズ係数を推定し、DESeq2 を実行します。解析の品質を評価するには、DESeq2 を使用して正規化された対数正規化カウントを抽出します。DESeq2 結果から各転写プロファイルの結果を抽出する場合は、ノックダウン条件またはベースラインの空のベクターを参照してペアワイズ比較を実行します。

これらの結果をHGNC遺伝子シンボルでさらに修正し、DESeq2データからENSEMBL遺伝子ID、HGNCシンボル、baseMean発現、および対数2倍変化と生および調整されたP値を持つすべてのコンストラクトの差次的発現データを含む単一のファイルとしてデータを抽出します。成功したバッチ正規化と関心のあるサンプルの類似性を評価し、コードを使用して正則化された対数正規化カウントを使用して、主成分分析とサンプル間距離プロットによるサンプルのクラスタリングを確認します。正規化された対数正規化カウントを使用して、1, 000の最も変動する遺伝子をマトリックスに抽出し、ヒートマップを使用して、これらの遺伝子に基づいてサンプルの教師なし階層クラスタリングを実行します。

樹形図から対象のクラスターを抽出するには、対象の樹形図クラスターのどのレベルを表示するかを決定し、K をそのレベルのクラスター数と等しく設定します。関心のあるクラスターを特定するには、クラスターごとに並べられたヒートマップを再プロットし、各クラスターに関連付けられた遺伝子のリストをテーブルにエクスポートしてから、適切なバイオインフォマティクスツールを使用して、クラス間で特定および比較された遺伝子のさまざまなクラスターの生物学的役割を特定します。この代表的な分析では、ポジティブおよびネガティブコンストラクトによる効果的なノックダウンとレスキューを観察できます。

DAFがレスキューした細胞はコロニー形成に失敗し、発がん性形質転換が損なわれていることを示唆していることに注意してください。replicantバリデーションの完了後、バッチの標準化と解析のために、すべてのサンプルについて表現型アッセイと初期RNAシーケンシングデータ処理遺伝子数を取得できます。バッチの標準化を行わないDESeq2は、培養中の細胞の継代による生物学的変動や各バッチの処理の違いにより、交絡するバッチ欠陥を引き起こす可能性があります。

バッチ正規化後、DESeq2 を使用して、ベースラインを基準にして目的のコンストラクトの転写プロファイルを生成できます。これらのデータの主成分分析により、DAFの転写プロファイルは野生型EWS/FLIとデルタ22の中間であり、部分的な機能が確認されていることが示唆されています。さらに、サンプル間で1, 000の最も可変的な遺伝子の階層的なクラスタリングは、DAFがEWS / FLI標的遺伝子を抑制できず、遺伝子活性化活性を部分的にしか保持しないことを示しています。

トップ遺伝子解析では、DAFが活性化する遺伝子のクラスは、DAFが機能しないEWS/FLI活性化標的とは機能的に異なることが示唆されています。興味深いことに、DAFはGGAAマイクロサテライト活性化遺伝子を最も救出することができますが、高親和性部位の近くで活性化遺伝子を救出することはできません。トランスクリプトーム出力を関連する表現型アッセイと組み合わせることで、構造機能解析が完了します。

研究者は、他の手法を使用して、さまざまな転写機能のメカニズムドライバーを研究することもできます。