Name: マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶマウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定法。腹腔、脾臓、骨髄などの組織におけるB細胞ヘテロジェニティを解析し、遺伝子操作マウスの免疫細胞表現型解析に応用できます。

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原稿を批判的に読んでくださったマシュー・スリーマンに感謝します。また、この研究を支援してくれたRegeneronのビバリウム・オペレーション部門とフローサイトメトリーコア部門に感謝します。

すべてのマウス研究は、レジェネロンの制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって監督され、承認されました。実験は、ジャクソン研究所の3匹のC57BL/6J雌マウス(17週齢)の組織に対して行われた。実験を開始する前にすべての抗体を活性化し、理想的な濃度を決定します。単色補正に補正ビーズを使用する場合は、サンプルよりも明るい色や明るい色で染色してください。すべてのバッファー、抗体、および細胞を氷上または 4 °C に保管してください。 生菌性染料を添加した後、低光または暗い状態で4°Cですべてのステップとインキュベーションを行います。
1. 腹膜細胞の収穫と単一細胞分離
<ol><li>CO2を使用するか、承認されたプロトコルに従ってマウスを安楽死させます。
</li>
	<li>背中にマウスを置き、70%エタノールでスプレーし、腹膜を切らないで外腹部の皮膚をはさみで切ります。</li>
	<li>25ゲージ針を装着した3mLの注射器を用いて、氷冷洗浄バッファー(0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)DPBS[vol/vol])を腹腔に注入します。</li>
	<li>腹の指先を軽くマッサージします。</li>
	<li>手順 1.3 と 1.4 を繰り返します。</li>
	<li>腹骨を通して18Gの針を取り付けた3mLの注射器を挿入し、臓器や脂肪を避けるように注意してください。</li>
	<li>洗浄バッファーを抽出し、腹膜細胞を含み、氷上の15 mL円錐管に移します。</li>
	<li>手順 1.3 と 1.4 を繰り返します。</li>
	<li>ピンセットで持ちこたえながら腹骨に小さな穴を切ります。</li>
	<li>使い捨て転送ピペットを穴に挿入し、残りの洗浄バッファーを収集し、もう一度脂肪や臓器を避けます。</li>
	<li>採取した残りの腹膜細胞を氷上の15mL円錐管に移します。 注:血液汚染が明らかな場合は、サンプルを廃棄してください。</li>
	<li>脾臓と骨の抽出が完了するまで、氷上の細胞をインキュベートします。</li>
	<li>4°Cで8分間300xgで細胞を遠心分離する。上清を吸引する。</li>
	<li>細胞ペレットを1mLの洗浄バッファーに再懸濁します。</li>
	<li>70 μM の細胞ストレーナーを通して、氷上のきれいな 15 mL 円錐形チューブに細胞をフィルターします。</li>
	<li>細胞カウンター計器またはヘモサイトメーターを使用して細胞濃度を決定します。</li>
</ol>2. 脾臓収穫と単一細胞分離
<ol><li>その腹の上にマウスを置き、きれいなはさみを使用して左裏側の腹腹を切り取ります。脾臓を切り取り、脂肪と結合組織を取り除きます。</li>
	<li>1 mLの洗浄バッファーを含む1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに脾臓を氷上に移します。</li>
	<li>骨の抽出が完了するまで、氷の上に脾臓をインキュベートします。</li>
	<li>脾臓を5 mLの赤血球のリシスバッファーを用いた自動解離管に移動します。チューブを組織解離器器具に置き、60 sの解離して単一の細胞懸濁液を作成します。 注:洗浄バッファの曇ったガラススライド間でスマッシングするなど、単細胞脾臓懸濁液を得る他の日常的な方法を使用することも許されます。別の解離方法を使用する場合は、遠心分離、吸引、および5 mLの赤血球リシスバッファーで再懸濁してからステップ2.5に進みます。</li>
	<li>室温で細胞を3分間インキュベートする。</li>
	<li>2mM EDTAを含む4°C洗浄バッファーの10 mLを加えます。</li>
	<li>きれいな15 mL円錐形の管に移す。</li>
	<li>4°Cで8分間300xgで細胞を遠心分離する。 上清を吸引する。</li>
	<li>4°C洗浄バッファーの5 mLで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>70 μM の細胞ストレーナーを通して、氷上のきれいな 15 mL 円錐形チューブに細胞をフィルターします。</li>
	<li>細胞カウンター計器またはヘモサイトメーターを使用して細胞濃度を決定します。</li>
</ol>3. BM収穫および単一細胞の分離
<ol><li>マウス本体の下半分から皮膚を取り除きます。脚から余分な筋肉をトリミングします。.大腿骨を切らないように注意して、脚全体をはさみで取り除く。残りの筋肉、脂肪、足を取り除くことによって大腿骨と脛骨をきれいにします。</li>
	<li>1 mLの洗浄バッファーを含む1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに骨を氷上に移します。</li>
	<li>0.5 mLマイクロ遠心分離チューブの底部を穿孔し、脚の骨が突き出ないように十分な小さな穴を残します。0.5 mLチューブをクリーンな1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに挿入します。大腿骨の端部と脛骨の近位を膝に切り取り、切り端を0.5 mLチューブに下に置きます。</li>
	<li>4°Cで2分間6,780 x g で細胞を遠心分離する。</li>
	<li>赤血球のリシスバッファーの1 mLで細胞ペレットを再懸濁し、赤血球のリシスバッファーの追加 3 mL を含む 15 mL 円錐管に転送します。.</li>
	<li>室温で3分間インキュベートします。</li>
	<li>2mM EDTAを含む4°C洗浄バッファーの10 mLを加えます。</li>
	<li>4°Cで8分間300xgで細胞を遠心分離する。 上清を吸引する。</li>
	<li>細胞ペレットを4°C洗浄バッファーの3 mLに再懸濁します。</li>
	<li>70 μMの細胞ストレーナーを通して、きれいな15 mLの円錐形チューブに細胞をフィルターします。</li>
	<li>細胞カウンター計器またはヘモサイトメーターを使用して細胞濃度を決定します。</li>
</ol>4.細胞を染色し、補償を準備する
<ol><li>アリコート106細胞は各動物から96 ウェルU底板まで各細胞型の細胞である。<ol>
<li>完全な染色、蛍光マイナス1(FMO)、染色されていない、最後に使用される各フルオロフォアのオプションの単色補償を含むすべてのサンプルとコントロールのための十分な井戸を含むようにしてください。</li>
		<li>BM成熟パネルおよび脾臓成熟パネルについては、アリコート細胞を2つのウェルに、ウェルあたり106個の細胞、完全な染色サンプルごとに106 個ずつ含む。単色補正の生存率制御の場合は、各セルタイプの 2 x 106 セルを個々のウェルに追加します。</li>
	</ol></li>
	<li>プレートを4°Cで2分間845 x g で遠心します。 上清を素早く反転させて、シンクの上にフリックし、井戸を交差しないように注意してデカントします。</li>
	<li>200 μL の DPBS でセルを再中断します(BSA または FBS を使用しない)。このステップは、アミン反応性の生き生き性染料で染色する前にタンパク質を除去することが重要です。</li>
	<li>ステップ 4.2 と 4.3 を繰り返します。</li>
	<li>ステップ 4.2 を繰り返します。</li>
	<li>DPBSで1:1,000を希釈した100μLの生き生き性染料で細胞を再懸濁する。 注:単色補正にセルを使用する場合は、それらのウェルに生存性染料を追加しないでください。<ol>
<li>各染色セットについて、完全に染色されていないサンプルと必要な他のコントロールのためにいくつかの染色されていない井戸を残します。</li>
		<li>各染色セットについて、生存率FMO制御のために追加の染色されていない井戸を残します。</li>
		<li>単色生存率補償コントロールの場合:ステップ4.1で200μLの希釈生存率染料で2 x 106 細胞を再中断します。100 μL の細胞を 1.5 mL マイクロ遠心分離チューブに移し、65 °C で 5 分間加熱し、100 μL の残存生細胞で 100 μL の熱死細胞を元のウェルに戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>4°Cで細胞をインキュベートし、光から保護し、30分間培養する。</li>
	<li>プレートを4°Cで2分間845 x g で遠心します。 上清を素早く反転させて、シンクの上にフリックし、井戸を交差しないように注意してデカントします。</li>
	<li>200 μL の DPBS でセルを再中断します(BSA または FBS を使用しない)。</li>
	<li>手順 4.8 と 4.9 を繰り返します。</li>
	<li>ステップ 4.8 を繰り返します。</li>
	<li>染色バッファー(DPBS [vol/vol]の 0.5% BSA) で 1:50 (最終濃度 = 10 μg/mL) を希釈した Fc ブロックの 50 μL で細胞を再中断します。<ol>
<li>腹膜細胞の場合-非特異的な染色を減らすために5μLの単球ブロッカーも加える。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞を光から保護した4°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>完全な染色マスターミックスとFMOを染色バッファに用意し、106 個の細胞あたり100 μlの最終容積を準備します。抗体リストについては 、表1-表4 を参照してください。 注:FMOは、1つを除くすべての抗体を染色セットに含めることによって作られます。各抗体のFMOを染色セットで準備します。染色セットに複数のブリリアント染料が含まれている場合、サンプルあたりの染色バッファー用に50 μLのブリリアントステインバッファーを代用</li>
	<li>Fcブロックを取り外さずに、100 μLのフルステインミックスとFMOを選択したウェルに追加します。</li>
	<li>染色セット内の各抗体に対して単色補正コントロールを用意します。<ol>
<li>補償ビーズを使用する場合は、使用するために製造の指示に従ってください。</li>
		<li>細胞を使用する場合、100μL染色バッファーで、100 μL染色体で、前に工程4.6.1で生存率染めなしで予約された106 細胞に滴定抗体を添加する。サンプル内のすべてのセルが特定のマーカーに対して正の場合は、フローサイトメーターで補正データを取得するときに使用される染色されていないセルを確保します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞とビーズを4°Cでインキュベートし、光から保護し、30分間培養します。</li>
	<li>プレートを4°Cで2分間845 x g で遠心します。 上清を素早く反転させて、シンクの上にフリックし、井戸を交差しないように注意してデカントします。</li>
	<li>200 μL の染色バッファーで細胞とビーズを再懸濁します。</li>
	<li>ステップ 4.18 と 4.19 を 2 回繰り返します。</li>
	<li>ステップ 4.18 を繰り返します。</li>
	<li>48時間以内の分析のためにサンプルを固定するには、DPBSで2%パラホルムアルデヒドの200 μLで細胞とビーズを再懸濁します。 注意:パラフォマルデヒドは深刻な健康被害であり、可燃性です。使用前に、Safty データ シートを参照してください。</li>
	<li>細胞とビーズを4°Cでインキュベートし、光から保護し、30分間培養します。</li>
	<li>ステップ 4.18 と 4.19 を 2 回繰り返します。</li>
	<li>きれいな96ウェルU-底板の上にフィルタープレートを置きます。マルチピペットを使用して、各サンプルをフィルタープレートのウェルに移します。</li>
	<li>フィルタープレート-96ウェルU-底板の設定を4°Cで2分間2分間845 x g に遠心します。 フィルタープレートを取り外し、上清を素早く反転させて、シンク上でプレートをフリックし、井戸を交差しないように注意します。</li>
	<li>BMおよび脾臓成熟パネルについては、完全に染色された細胞を100 μLの染色バッファに再懸濁します。各動物のための2つの井戸を1井戸に組み合わせます。残りのパネル、FMO、およびコントロールを200 μLの汚れバッファーで再中断します。</li>
	<li>固定細胞とビーズを4°Cでインキュベートし、一晩光から保護します。</li>
</ol>5. フローサイトメトリックデータ取得
<ol><li>メーカーの指示に従ってフローサイトメーターを初期化し、QCします。</li>
	<li>各パネルに固有のテンプレートをロードします。</li>
	<li>データを記録する前に、各サンプルのすべてのイベントがスケールで、ドットプロットに表示されていることを確認してください。</li>
	<li>ステップ4.16で作成した単一の汚れ補償を使用して、各染色パネルの補償制御を記録します。各サンプルに正のゲートと負のゲートを設定します。ソフトウェアに補償行列を計算してもらいます。</li>
	<li>最初のサンプルの取得を開始し、ゲートが適切に設定されていることを確認します。</li>
	<li>腹膜B細胞パネルと脾臓IgκおよびIgλパネルの少なくとも50,000 B細胞イベントを記録するようにマシンを設定します。BM成熟パネルのための150,000 B細胞イベント;脾臓成熟パネルのための300,000 B細胞イベント。</li>
	<li>各染色パネルについて、動物、染色されていないサンプル、およびFMOの完全に染色されたサンプルを実行して記録します。</li>
</ol>6. データの分析
<ol><li>フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いたデータ解析を進める。図 1、図 2、図 3、図 4 に示す格言の戦略に従います。 
</li>
</ol>

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すべての著者は、レジェネロン・ファーマシューティカルズ社の従業員および株主です。

リンパ球組織と非リンパ組織のフローサイトメトリック解析により、1980年代以降、マウスとヒトにおけるB細胞サブ集団の同時同定と列挙が可能になった。これは、液性免疫の尺度として使用されており、さらにB細胞の機能性を評価するために適用することができます。この方法は、試薬の可用性を利用して、マウスおよびヒトにおけるB細胞成熟の異なる段階を評価し、複数のパラメータを同時に分析することにより、稀な集団であってもB細胞の不均一性の評価を可能にする。複雑な異種サンプルを測定するために使用すれば、それは、個々のcells33上で、数分以内にサブ集団を検出することができる。流動サイトメトリック解析に最も頻繁に適用される逐次格言解析戦略は、特定の集団を特定する必要がある場合に、単純かつ直感的にすることができます34。最後に、フローサイトメトリーのもう一つの利点は、経験豊富なユーザーの指導の下で、ほとんどの学術ラボで簡単に適応できることです。我々のプロトコルは、B-1集団を記述および列挙し、B-2プロB細胞、前B細胞、未熟、過渡期および成熟B細胞の発達ならびにIg...

モノクローナル抗体は、主流の医学の一部となるにつれて、多くのヒト疾患の選択療法となっています 1,2.我々は、マウスIgH定数3,4を有する完全ヒト可変領域を有する抗体を効率的に産生する遺伝子操作マウスについて以前に説明した。最近では、明確な抗原結合を有する抗体様分子を産生する遺伝子操作マウスについて説明した。抗体はB細胞によって分泌され、体液性免疫の適応の基礎を形成する。B細胞にはB-1とB-2の2つの異なるタイプがあります。哺乳類では、B-1細胞は胎児肝臓に由来し、生後に粘膜組織および胸膜および腹腔に富み、B-2細胞は出生前に胎児肝臓に由来し、その後骨髄(BM)で生まれる。B-2細胞は、脾臓および血液を含む二次リンパ器官で濃縮される6,7,8.BMにおいて、B-2造血前駆物質は、Ig mu重鎖の再配列の開始時にプロB細胞に分化し始める9,10。Ig重鎖のプレB細胞受容体への組み立て(プレBCR)への組み換えが成功し、シグナル伝達および増殖増殖が、B細胞前細胞への分化をもたらす。プレB細胞がIg κ(Igκ)を再配置した後、または非生産的な場合、Igλ(Igλ)軽鎖は、μ重鎖と組み合わせ、表面IgM BCR発現をもたらす。IgM表面発現は自己反応性の条件下で低下することが知られており、機能的に無反応または無値B細胞11,12の自己耐性に寄与することが重要である。その後、未熟なB細胞は過渡期に入り、そこでIgDを共同発現させ、BMから脾臓に移行します。脾臓では、IgD発現がさらに増加し、細胞は移行B細胞の第2段階に成熟し、その後、その成熟状態が完了し、限界領域(MZ)または濾胞(Fol)細胞13、14、15のいずれかに発達する。成体マウスでは、非疾患の設定では、成熟したB細胞の数は、BMで毎日10〜2000万個の未熟なB細胞が生成されているにもかかわらず一定のままである。これらのうち、成熟B細胞のプールに入るのはわずか3%である。末梢B細胞区画のサイズは、自己反応性および不完全な成熟を含むいくつかの要因による細胞死によって制約される16、17、18。フローサイトメトリック解析は、ヒトおよびマウスにおける多くの免疫細胞サブコンパートメントを特徴付け、列挙するために広く使用されてきた。ヒトとマウスB細胞コンパートメントには類似点がいくつかありますが、このプロトコルはマウスB細胞の分析にのみ適用されます。このプロトコルは、遺伝子操作がB細胞の発達を変えるかどうかを判断するために、遺伝子操作されたマウスのフェノタイピングを目的に開発された。フローサイトメトリーは、細胞の活性化、機能、増殖、サイクル分析、DNA含有量分析、アポトーシス、細胞分類19,20など、多くの追加用途でも非常に人気があります。
フローサイトメトリーは、脾臓、BMおよび血液などの複雑な器官を含むマウスおよびヒトにおける様々なリンパ球コンパートメントを特徴付ける選択のツールである。フローサイトメトリー用のマウス特異的抗体試薬が広く利用可能なため、細胞表面タンパク質だけでなく、細胞内リンタンパク質やサイトカイン、機能読み出し21も調べることができます。ここで我々は、フローサイトメトリー試薬が、二次リンパ器官において成熟し、分化するB細胞サブセットを同定するためにどのように使用できるかを示す。染色条件の最適化、サンプル処理、正しい計測器のセットアップおよびデータ取得、そして最後にデータ分析の後、マウスにおけるB細胞区画の包括的なフローサイトメトリック分析用のプロトコルを利用することができる。このような包括的な分析は、ハーディと同僚によって考案された数十年前の命名法に基づいており、B220、CD43、BP-1、CD24、IgMおよびIgD22の発現に応じて、BM B-2細胞の開発を異なる画分(画分)に分割することができる。Hardy et al.は、B220+ CD43 BM B細胞がBP-1およびCD24(30F1)発現に基づいて4つのサブセット(フラクションA-C')に細分化され得ることを示し、B220+ CD43-(薄暗い暗い)BM B細胞はIgDおよびIg3の微分発現に基づいて3つのサブセット(分画D-F)に分解できることを示した。分数A(プレプロB細胞)はBP-1-CD24(30F1)と定義され、フラクションB(初期のプロB細胞)はBP-1-CD24(30F1)+と定義され、フラクションC(後期プロB細胞)はBP-1+CD24(30F1)+と定義され、フラクションCはBP-1+として定義される(前B細胞)はBP-1+として定義される。さらに、分画D(前B細胞)はB220+ CD43-IgM-B細胞と定義され、画分E(新たに生成されたB細胞、未熟および過渡的の組み合わせ)はB220+ CD43-IgM+B細胞と定義され、画分F(成熟、再循環B細胞)と定義される。対照的に、脾臓に見られるナイーブB細胞の大部分は、成熟(B220+CD93-)B細胞と移行(T1、T2、T3)細胞に分けることができるCD93、CD23およびIgMの発現に依存する。成熟B細胞は、IgMおよびCD21/CD35の発現に基づいて、限界領域および濾胞サブセットに分解することができ、濾胞サブセットは、それらのIgMおよびIgD表面発現のレベルに応じて、成熟濾胞型Iおよび濾胞タイプIIB細胞サブセットにさらに分割することができる。これらの脾細胞B細胞集団は主にIgκ軽鎖を発現する。最後に、B-1 B細胞集団は、胎児の肝臓に由来し、主に成体マウスの腹膜および胸膜腔に見られるが、文献に記載されている。これらの腹膜B細胞は、CD23発現の欠如によって先述したB-2B細胞と区別することができる。その後、B-1aまたはB-1b集団にさらに細分化され、前者はCD5の存在によって定義され、後者は不在25によって定義される。B-1細胞前駆細胞は胎児の肝臓に豊富であるが、成人のBMには見られません。B-1aおよびB-1b細胞は異なる前駆細胞に由来するが、両方とも腹膜腔と胸膜腔24を播種する。B-2細胞とは対照的に、B-1細胞は自己再生が可能であり、天然IgM抗体の産生を担っています。
B細胞の発達における欠陥は、BCR26,27の成分の欠陥、BCRシグナル伝達強度に影響を与えるシグナル伝達分子の摂動14,28,29、またはB細胞生存を調節するサイトカインの破壊を含む多くの例で生じる可能性がある30,31.リンパ区画のフローサイトメトリー解析は、これらのマウスおよび他の多くのB細胞の発生ブロックの特性評価に寄与している。リンパ区画のフローサイトメトリック解析の利点の1つは、生きた解離組織から得られた個々の細胞に対して測定を行う能力を提供することです。拡大し続ける蛍光HOREの範囲で試薬が利用できることにより、複数のパラメータを同時に分析することができ、B細胞の不均一性の評価が可能になります。さらに、フロー細胞量分析によるB細胞の列挙は、リンパ器官内の細胞局在化を可視化する免疫組織化学法、液体免疫の尺度としての循環抗体レベルの検出、ならびに2つの光子顕微鏡をリアルタイムおよびtime32で測定する他の免疫学的アッセイを補完する。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 安全ロック Eppendorf チューブ</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>22363611</td><td>0.5 mL 微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf チューブ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>22364111</td><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>15 mL ファルコンチューブ&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>352097</td><td>15 mLコニカルチューブ</td></tr><tr><td>18ゲージ針</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25ゲージ針</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305124</tr><tr><td>3 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>70 mM MACS SmartStrainer&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック&nbsp;</td><td>〒130-110-916&nbsp;</td><td>70 mMセルストレーナー</td></tr><tr><td>96ウェルU底板&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>ACK溶解バッファ&nbsp;</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>A1049201</td><td>赤血球溶解バッファー</td></tr><tr><td>Acroprep Advance 96 Well Filter Plate</td><td>Pall Corporation</td><td>8027</td><td>フィルタープレート</td></tr><tr><td>B220</td><td>eBiosciences</td><td>17-0452-82</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&kappa;</td><td>BD</td><td>552843</td><td>補償ビーズ</td></tr><tr><td>BD CompBead アンチラット Ig/&kappa;</td><td>BD</td><td>552844</td><td>補正ビーズ</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A8577</td><td>BSA</td></tr><tr><td>BP-1</td><td>BD</td><td>740882</td><td></td></tr><tr><td>ブリリアント ステイン バッファー</td><td>BD</td><td>566349</td><td>ブリリアント ステイン バッファー</td></tr><tr><td>C-キット</td><td>BD</td><td>564011</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>562756 CD23&nbsp;</td><td>BD</td><td>740216</td><td></td></tr><tr><td>CD24 (HSA)</td><td>BioLegend</td><td>138504</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>561388</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BioLegend</td><td>100214</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BD</td><td>553270</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BioLegend</td><td>121206</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CD5 BD</td><td>563194</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BD</td><td>740750</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BioLegend</td><td>136504</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td>Viability Dye</td></tr><tr><td>Extended Fine Tip Transfer Pipette</td><td>Samco</td><td>233</td><td>disposable transfer Pipette</td></tr><tr><td>FACSymphony A3 flow cytometer</td><td>BD</td><td>custom order</td><td>フローサイトメーター</td></tr><tr><td>Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>BD</td><td>553142</td><td>Fc block</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Flowjo</td><td></td><td>フローサイトメーター解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック&nbsp;</td><td>130-096-334</td><td>全自動解離チューブ&nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS オクトディスソシエータ ヒーター付き&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック&nbsp;</td><td>130-095-937</td><td>組織解離器装置</td></tr><tr><td>GR1 (Ly6C/6G)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>IgD</td><td>BioLegend</td><td>405710</td><td></td></tr><tr><td>IgM</td><td>eBiosciences</td><td>25-5790-82</td><td></td></tr><tr><td>Kappa</td><td>BD</td><td>550003</td><td></td></tr><tr><td>Lambda</td><td>BioLegend</td><td>407308</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、32% 溶液</td><td>電子Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Ter119</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>True-Stain Monocyte Blocker</td><td>BioLegend</td><td>426103</td><td>Monocyte Blocker</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575038</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>cell counter instrument&nbsp;</td></tr></tbody></table>

マウスb細胞の発達におけるフロー細胞量測定

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

広範な研究は、二次リンパ器官におけるマウスB細胞の発達および分化を特徴付けている。B細胞によって分泌される抗体は、単離され、確立された治療薬へと発展してきた。マウスB細胞の発達の検証は、自己免疫性の多いマウスの文脈において、または免疫系を改変したマウスにおいて、マウスにおける治療薬の開発または試験の重要な構成要素であり、フローサイトメトリーの適切な使用である。十分に確立されたB細胞フローサイトメトリックパラメータは、マウス腹膜、骨髄、脾臓におけるB細胞の発達を評価するために使用できますが、多くのベストプラクティスを遵守する必要があります。さらに、B細胞区画のフローサイトメトリクス分析もB細胞開発の追加の読み出しを補完すべきである。この技術を用いて生成されたデータは、野生型、自己免疫しやすいマウスモデル、ならびに治療薬として抗体または抗体様分子を生成するために使用できるヒト化マウスの理解をさらに深めることができます。

ここでは、マウス腹膜、BMおよび脾臓におけるB細胞の発達を特徴付けるための格言戦略を提示する。分析の基礎は、生存性染料で染色し、前方散乱領域(FSC-A)と前方散乱高さ(FSC-H)に基づいてダブレットをゲーティングし、最後にFSC-Aおよび側散乱領域(SSC-A)特性に従って細胞を選択することによって破片を取り除くという概念を中心に形成され、ここでの大きさは、セルの大きさ、つまり、セルの高さである 関心のある人口に基づいて行く前に。
腹膜B細胞のフローサイトメトリック解析は、生存可能な腹膜細胞、総B細胞、B-1およびB-2サブセット、ならびにC57BL/6JマウスにおけるB-1aおよびB-1b細胞の頻度を示す(図1)、 表1に概説した染色パネルを用いた。これらの周波数の平均絶対セル数を 表5に示す。B-1細胞における摂動は、...

ここでは、フローサイトメトリーによる腹膜、脾臓、および骨髄組織におけるマウス免疫B細胞区画の不均一性の単純な分析について説明する。プロトコルは、他のマウス組織に適応し、拡張することができます。

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

この技術を用いて生成されたデータは、一般的な抗体または抗体の生命療法に使用することができる自己免疫性の高いマウスモデル、ならびにヒト化マウスの理解を促進する。蛍光体の拡大範囲を持つ試薬の可用性は、個々の細胞上の複数のパラメータの同時分析を可能にし、B細胞の不均一性の評価を可能にする。このプロトコルは、遺伝子操作されたマウスのフェノタイピングを目的として開発されました。遺伝子操作がB細胞の発達を変えるかどうか判断する。こんにちは、私はフェイスハリスです。私は今日、手順をデモンストレーションします。各動物から各細胞タイプの100万個を96ウェルU-底板にアリクォートすることから始めます。フルステイン、蛍光マイナス1サンプル、蛍光各蛍光の不染色サンプルなど、すべてのサンプルとコントロールに十分なウェルが用意されていることを確認してください。骨髄成熟パネルおよび脾臓成熟パネルの場合、アリコート細胞は2つのウェルに、完全な染色サンプルごとにウェルあたり100万個の細胞である。単色補正の生存率制御の場合は、各セルタイプのそれぞれについて 200 万個のセルを個々のウェルに追加します。845 x g でプレートを摂氏 4 度で 2 分間遠心します。上清を素早く反転させて、プレートをシンク上でフリックし、井戸を交差しないように注意します。DPBSの200マイクロリットルで細胞を2回洗浄します。遠心分離機とデカント各洗浄後に上清。1~1000の比率でDPBSで希釈した生存性染料100マイクロリットルで細胞を再懸濁し、単色補正に使用する細胞を回避します。各染色セットについて、完全に染色されていないサンプルや必要な他のコントロール、および生存率FMO制御のための追加の染色されていない井戸のために、いくつかの未染色の井戸を残します。これらの井戸にPBSを追加します。希釈された生存率染料の200マイクロリットルの単色補償生存率制御の細胞を再懸濁する。これらの細胞の100マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、摂氏65度で5分間加熱し、加熱された細胞を残りの生きた細胞と共に元のウェルに戻します。光から保護された30分間、摂氏4度で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、遠心分離し、他のウェルを交差汚染することなくプレートをフリックまたは反転させることによって上清をデカントします。200マイクロリットルのDPBSで再懸濁して細胞を洗浄し、次に遠心分離機を使用し、以前のように上清をデカントします。DPBS を再度洗います。1~50の比率で染色バッファーで希釈したFCブロックのマイクロリットルを加えて、1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度を得る。腹膜細胞の場合は、非特異的染色を減らすために5マイクロリットルの単球ブロッカーを加える。その後、光から保護された摂氏4度で細胞を15分間インキュベートする。テキスト原稿の抗体表を使用して、100万個の細胞あたり100マイクロリットルの最終体積に対して、完全な染色マスターミックスとFMOを染色バッファに用意します。FCブロックを取り外さずに、100マイクロリットルのフルステインミックスとFPOを選択したウェルに追加します。各抗体とステインセットに対して単色補正コントロールを用意します。補償ビーズを使用する場合は、メーカーの指示に従ってください。細胞とビーズを光から保護して摂氏4度で30分間インキュベートします。その後、遠心分離機をプレートを反転・フリックして上清をデカントします。200マイクロリットルの汚れバッファーで細胞とビーズを3回洗浄し、毎回遠心分離して上清をデカントします。DPBSで2%パラホルムアルデヒドの200マイクロリットルの細胞とビーズを再懸濁し、分析のためにサンプルを固定します。セルとビーズを30分間摂氏4度でインキュベートし、光から保護し、遠心分離機を使用してプレートを反転またはフリックして上清をデカントします。200マイクロリットルの汚れバッファーで細胞とビーズを再懸濁します。きれいな96ウェルU-底板の上にフィルタープレートを置き、各サンプルをマルチピペットを使用してフィルタープレートのウェルに移します。フィルタープレートを遠心分離し、上清をデカントします。骨髄および脾臓成熟パネルの場合、完全に染色された細胞を100マイクロリットルの汚れバッファーに再懸濁させる。各動物のための2つの井戸を1つの井戸に組み合わせます。残りのパネル、FMO、およびコントロールを200マイクロリットルの汚れバッファーで再中断します。固定細胞とビーズを一晩摂氏4度でインキュベートし、光から保護します。調製された単一の染色補償を使用して、各染色パネルの補償制御を記録し、各サンプルに正および負のゲートを設定します。ソフトウェアを使用して補償マトリックスを計算します。最初のサンプルを取得し、ゲートが適切に設定されていることを確認します。テキスト原稿で述べたように、マシンを実行し、各サンプルの各種セルイベントを記録するように設定します。テキスト原稿の測定戦略に従って、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いたデータ分析を進める。腹膜内の腹膜B細胞の特性解析に関するフローサイトメトリック解析は、実行可能な腹膜細胞、総B細胞、B-1およびB-2サブセット、ならびにマウスにおけるB-1aおよびB-1b細胞の頻度を示す。骨髄B細胞を解析した場合、生存細胞の周波数、全B細胞、画率A、プレプロB細胞、画分B、画分C、画分C'Fraction D、未熟なフラクションE、移行画分E、およびマウスの画分FB細胞を決定した。脾臓B細胞の分析は、生細胞、総B細胞、過渡的B細胞、T1、T2、T3細胞、成熟B細胞、濾胞I細胞、濾胞II細胞、前駆体および成熟した限界ゾーン細胞、およびマウスにおけるB-1細胞の頻度を示す。マウスにおける免疫グロブリンカッパおよび免疫グロブリンλB細胞の頻度を、脾臓のフローサイトメトリック解析で決定した。このプロトコルを実行する場合、補正コントロールを使用して、ある検出器から次のディテクタへの信号を次の検出器に解決する必要があります。これらのコントロールは、セルが1対一染色されるか、または市販の補償ビーズを有することができる。追加アッセイは、リンパ器官内の細胞局在化を可視化する免疫組織化学や、2つの光子顕微鏡検査など、フローサイトメトリーと組み合わせて使用して、リアルタイムおよび時間でB細胞応答を分析することができます。B細胞区画のフローサイトメトリー解析は、BCRおよび関連する欠乏に関連する表形の特性評価、BCRシグナル伝達分子の摂動、またはB細胞生存を調節するサイトカインの破壊を可能にする。

flow-cytometric-characterization-of-murine-b-cell-development

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

IP - FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 -...

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

抗原曝露後、活性化B細胞の亜集団は、異なるエフェクター機能を有する抗体のアイソタイプを生成するためにクラススイッチ組み換え（CSR）として知られているプロセスを経る。このレポートに記載されているプロトコルは、CSRを誘導して分析できる方法について説明します。...

マウスB細胞を精製における誘導とクラススイッチ組み換えの評価

直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。...

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

このプロトコルは、FACSを介した細胞の分離、流体力学的遺伝子導入、およびパイエル板の免疫サブセットのフロー分析を含む技術を使用して、一般的な樹状細胞前駆体からのパイエル板での形質細胞様樹状細胞の分化を評価するための実験手順について説明します。...

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単離とマウスリンパ球の活性化

浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。...

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。...

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

ここを識別し、分離 GM-CSF 駆動高速セルの並べ替えを使用して骨髄の細胞数が多いためメソッドを提供します。5 つの異なる集団 (一般的な骨髄前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、単球、単球由来マクロファージおよび単球由来の Dc) は、Ly6C と CD115...

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、流れを自分の移行パスを再定位せん断流の力に対応します。このプロトコルは、記録し、流体工学ユニット、ポンプ、顕微鏡イメージング システム、フリー...

生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析

ここでは、フローサイトメトリーを用いた血管内または内皮腔内の位置に基づく心筋Bリンパ球の定量と分化のためのプロトコルを報告します。...

フローサイトメトリーによる心筋B細胞の定量および分析(英語)

ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

学ぶマウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定法。腹腔、脾臓、骨髄などの組織におけるB細胞ヘテロジェニティを解析し、遺伝子操作マウスの免疫細胞表現型解析に応用できます。

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

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