異種移植モデルの血液中の循環性豚特異的DNAの定量化

異種移植は治療に可能な方法であるが、異種移植の免疫拒絶反応の効果的なモニタリングは医師および研究者にとって問題である。このプロトコルは、単純で便利で低コストで、ゼノトランスミューテーションの免疫拒絶反応を監視する方法です。この技術は、ブタからヒトへの小便移植、腎臓移植、肝臓移植、心臓移植などの異種移植分野で使用することができる。

異なるマイクロ遠心チューブに血液サンプルの500マイクロリットルを転送することで始めます。20マイクロリットルのプロテアーゼKと500マイクロリットルのライシスバッファーをチューブに加えます。その後、徹底的にミックスにそれらを振ります。

チューブを摂氏56度の水浴に10分間入れ、溶液が透明になるまでインキュベーション中に2〜3回振り、チューブカバーの内壁から液体ビーズを取り除きます。その後、無水、エチルアルコールの500マイクロリットルを追加し、徹底的に振ります。混合物を吸着カラムに移します。

その後、カラムを2分間遠心し、廃液を捨てます。各吸着カラムに800マイクロリットルのリンス溶液を加え、遠心分離機を1分間加えます。残りのすす溶液を乾燥させるために、カラムを室温で数分間放置します。

吸収カラムをきれいな遠心管に移します。吸着フィルムの中央に溶出バッファーの50マイクロリットルを追加し、2〜5分間室温に置き、1分間遠心分離します。原稿の方向に従ってPCRマスターミックスを準備し、その後、各0.6ミリリットルマイクロ遠心分離管にミックスの23マイクロリットルを追加します。

各チューブに2マイクロリットルのゲノムDNAを加え、慎重にカボットを加えます。その後、簡単に混合し、遠心分離機。チューブを PCR サイクラーに入れ、増幅を開始します。

反応が終了するとアガロース電気泳動を行う。100ミリメートルのTAEを含むフラスコにアガロース1.2グラムを加え、電子レンジで5分間沸騰させます。アガロースが約70°Cに冷却されたら、フラスコに5マイクロリットルの核酸染料を加え、ゆっくりとプレートに注ぎ、ゲルに固まるまで室温にしておきます。

各サンプルの5マイクロリットルと2-Log DNAラダーまたはDNAマーカー1を、アガロースゲルのウェルに加え、バンドが分離されるまで1億2000万個の桟橋で電気泳動を行います。紫外線イメージャーでゲルを視覚化します。テキスト原稿に記載された形で変換を行った後、EcoR IおよびBam HIによる二重制限酵素消化によりプラスミドを検証する。消化した製品を1%アガロース電気泳動で分離し、ゲルをUV光にさらします。

濃縮プラスミドをブタDNAの断片で希釈し、開始標準溶液の1ミリリットル当たり10~11部に2倍に希釈し、蒸留水を二重に使用します。標準曲線を確立するには、テキスト原稿に記載されているようにqPCRマスターミックスを準備し、8チューブストリップの各チューブに40マイクロリットルのミックスを追加します。異なる濃度の標準的なDNAの10マイクロリットルを追加し、チューブをキャップし、それらを簡単に混合し、遠心分離します。

qPCRマシンにチューブを入れ、増幅を行います。EDTAチューブを使用して、豚からサルへの動脈パッチモデルから約400マイクロリットルの血液サンプル、または豚からマウスへの細胞移植モデルから100マイクロリットルの血液サンプルを収集します。その後、サンプルを1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。

血液サンプルから、低温・高速で遠心分離して血液細胞を除去します。上清を新しい1.5ミリリットルの遠心管に移し、16,000回Gで遠心分離して細胞の破片を10分間取り除きます。上清を新しい1.5ミリリットル遠心分離チューブに移し、DNA抽出キットを循環しながら市販の血清を使用して循環DNAを抽出します。

循環DNAの体積を40マイクロリットルに凝縮し、マイナス20°Cで保存します。qPCRを実行して、循環するブタ特異的DNAを定量化します。ブタ特異的プライマーは、豚からマウスへの細胞移植モデルおよび豚からサルへの動脈パッチ、移植モデルにおいて、qPCRによって循環豚特異的DNAを定量化するために設計され、使用された。

アガロース電気泳動は、増幅されたDNA断片を単離するために使用された。PCRを用いて、増幅ブタゲノムDNAに対するプライマー特異的な遺伝子を同定した。次に、サルまたはヒトゲノムDNAのコホート中またはマウスゲノムDNAのコホートにおけるこれらのプライマーの種特異性が、確認された。

最後に2種特異的プライマーを、豚からサルへの動脈パッチおよび豚からマウスへの豚、細胞移植モデルで豚DNAを増幅するために使用した。このプロトコルを試みている間に覚えておくべき最も重要なことは、あらゆる種類の汚染を防ぐべきであるということです。この技術は、異種移植の免疫拒絶反応を監視する単純な低コストで非侵襲的な方法であるため、研究者が異種移植中の新しい質問を探求する道を開きます。