Name: タンパク質トポグラフィ変化の測定のためのタンパク質の高速光化学酸化におけるリアルタイム補正の実現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶタンパク質高速光化学酸化法（FPOP）によるリアルタイム補正技術。水酸基ラジカル生成をモニタリングし、タンパク質構造と相互作用を評価する。創薬研究や構造生物学への応用が可能です。

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我々は、高エネルギーFPOPの標準化およびドージトリープロトコルの開発のためのベンチトップFPOP装置およびR01GM127267の商業開発を支援するために、国立一般医学研究所からの研究資金R43GM125420-01toを認める。

ジョシュア・S・シャープは、ヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントを含むタンパク質高次構造解析の技術を製品化しようとする小さな会社、GenNext Technologies, Inc.に大きな財政的関心を開示しています。

水素重水素交換、化学架橋、共有標識、天然スプレー質量分析、イオン移動性など、質量分析ベースの構造技術は、その柔軟性、感度、複雑な混合物を処理する能力により急速に普及しています。FPOPは質量分析ベースの構造技術の分野での人気を高めているいくつかの利点を誇っています。ほとんどの共有標識戦略と同様に、ほとんどのポストラベリングプロセス(トリプシン消化、脱糖分解など)と互換性のあるタンパク質トポグラフィーの安定した化学的スナップショットを提供し、水素重水素交換を妨げる逆交換やスクランブルの問題を回避します。しかし、特定のアミノ酸を標的とする従来の共有ラベル技術とは異なり、FPOPは単一の実験で幅広いアミノ酸の標識を行うことができます。さらに、FPOPは、タンパク質が天然の立体構造14の化学的スナップショットを凍結するために展開することができるよりも速く一次ヒドロキシルラジカルタンパク質反応を完了することができるが、いくつかの二次反応は、遅いタイムスケール20、31、3231,<sup class="xre...

タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、溶媒曝露されたタンパク質の表面積の超高速共有修飾によるタンパク質地形変化の測定に新たな技術であり、続いてLC-MS1による検出を行う。FPOPは、過酸化水素のUVレーザーフラッシュ光分解により、その一部に高濃度のヒドロキシルラジカルを生成する。これらのヒドロキシルラジカルは、非常に反応性と短命であり、FPOP条件2の下でおよそマイクロ秒のタイムスケールで消費される。これらのヒドロキシルラジカルは、水を介して拡散し、一般に高速(〜106M-1 s6 -1)から拡散制御3に至るまで、運動速度で溶液中の様々な有機成分を酸化する。ヒドロキシルラジカルがタンパク質表面に遭遇すると、ラジカルはタンパク質表面上のアミノ酸側鎖を酸化し、そのアミノ酸(最も一般的には1つの酸素原子の純加量)の質量シフトを生じる4。任意のアミノ酸における酸化反応の速度は、そのアミノ酸の固有反応性(側鎖および配列コンテキストに依存する)4、5,5およびその側鎖の拡散ヒドロキシルラジカルへのアクセス可能性の2つの要因に依存し、これは平均溶媒アクセス可能な表面積6,77と6密接に相関する。グリシンを除くすべての標準的なアミノ酸は、FPOP実験でこれらの反応性の高いヒドロキシルラジカルによって標識されているように観察されています, 大きく異なる収率ではあるが;実際には、Ser、Thr、Asn、およびAlaは、高ラジカル用量の下で、慎重かつ敏感な標的ETDフラグメンテーション88、99によって同定される以外、ほとんどのサンプルで酸化されると見られることはほとんどありません。酸化後、試料を消光して過酸化水素および二次酸化剤(スーパーオキシド、一酸化酸素、ペプチジルヒドロペルオキシドなど)を除去する。次いで、クエンチされたサンプルをタンパク質分解して酸化ペプチドの混合物を生成し、構造情報は、様々なペプチドの酸化生成物のパターンにおいて化学的「スナップショット」として凍結される(図1)。質量分析(LC-MS)に結合された液体クロマトグラフィーは、そのペプチドの酸化および非酸化バージョンの相対的な強度に基づいて、所定のタンパク質分解ペプチドにおけるアミノ酸の酸化量を測定するために使用されます。異なる立体構造条件下で得られた同じタンパク質のこの酸化足跡を比較することにより(例えば、リガンド結合対リガンドフリー)、タンパク質の所定の領域の酸化量の差は、その領域66,77の溶媒アクセス可能表面積の違いと直接相関することができる。タンパク質の地形情報を提供する能力は、FPOPタンパク質の高次構造決定のための魅力的な技術を作ります, タンパク質の治療の発見と開発中を含みます10,,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> 図 1: FPOP の概要タンパク質の表面は、高反応性ヒドロキシルラジカルによって共有結合的に修飾される。ヒドロキシルラジカルは、側鎖の溶媒のアクセス性に強く影響される速度でタンパク質のアミノ酸側鎖と反応する。地形変化(例えば、上に示したリガンドの結合に起因する)は、相互作用の領域におけるアミノ酸をヒドロキシルラジカルと反応することから保護し、LC-MSシグナルにおける修飾ペプチドの強度の低下をもたらす。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
FPOP溶液中に存在する異なる成分(例えば、リガンド、賦形剤、緩衝剤)は、過酸化水素3のレーザー光分解に際して発生するヒドロキシルラジカルに対して異なる清掃活性を有する。同様に、過酸化物濃度、レーザーフルエンス、および緩衝剤組成のわずかな変化は、効果的なラジカル用量を変更し、サンプル間および異なる実験室間でFPOPデータの再生を困難にする可能性があります。したがって、利用可能なヒドロキシルラジカル線量,を、12、13、14、15、16,13の利用可能なヒドロキシルラジカル線量の1つを用いて、各サンプル中のタンパク質と反応させることができるヒドロキシルラジカル用量15を16比較できることが重要である。,14ヒドロキシルラジカル線量計は、ヒドロキシルラジカルのプールのための(そして溶液中のすべてのスカベンジャーと)アナライトと競合することによって作用します。ヒドロキシルラジカルの有効用量は、線量計の酸化量を測定することによって測定される。なお、「有効ヒドロキシルラジカル用量」は、発生したヒドロキシルラジカルの初期濃度とラジカルの半減期の両方の機能である。これら2つのパラメータは、部分的に相互に依存しており、理論運動モデリングはやや複雑になる(図2)。2つのサンプルは、形成されたヒドロキシルラジカルの初期濃度を変更することによって同じ効果的なラジカル用量を維持しながら、最初のラジカル半減期を大きく異なることができる。彼らはまだ同じフットプリント17を生成します。アデニン13およびTris12は、酸化のレベルをリアルタイムでUV分光法で測定できるため、効果的なヒドロキシルラジカル用量に問題がある場合に研究者が迅速に特定し、その問題をトラブルシューティングすることができるため、便利なヒドロキシルラジカル線量計です。この問題を解決するためには、リアルタイムでアデニン吸光度変化からの信号を監視できる照射部位の直後にフローシステムに位置するインライン線量計が重要である。これは、ヒドロキシルラジカル清掃能力17の広く異なるレベルを有するバッファーまたは他の賦形剤でFPOP実験を行うのに役立つ。このラジカル投与量補償はリアルタイムで行うことができるが、有効ラジカル用量を調節することによって同じコンフォーマーに対して統計的に区別できない結果をもたらす。
本プロトコルでは、内部光学ラジカルドシメータとしてアデニンを用いたラジカル投与量補償を用いた典型的なFPOP実験を行うための詳細な手順を有する。この方法により、調査員はリアルタイムで補正を実行することにより、異なる清掃能力を有するFPOP条件全体のフットプリントを比較することができます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> 図2:ドシメトリー報酬の運動シミュレーション1 mM アデニン線量計応答は、5 μM リソザイム分析物で 1 mM 初期ヒドロキシルラジカル濃度 (▪OH t1/2=53 ns)で測定し、対象線量計応答(黒)として設定した。スカベンジャー賦形ヒスチジンの1mMを添加すると、量濃度応答(青色)は比例的にタンパク質酸化量(シアン)と共に減少する。ヒドロキシルラジカルの半減期も減少する(▪OH t1/2=39ns)。生成されたヒドロキシルラジカルの量が増加すると、スカベンジャー(赤色)の不在時に1mMヒスチルラジカル(赤)で達成した1mMヒスチジンスカベンジャーを用いてサンプル中の酸化された線量計の同等の収量を得るために(▪tOH/29=29)、同様に起こるタンパク質酸化量(マゼンタ)が減少する一方で(tOH19/ns=29)。=シャープJ.S.、アムファーマセウトRev 22、50-55、2019の許可を得て適応。 22,<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>アデニン</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>147440250</td> 水<td>溶性 3.5 mM</td></tr> まで <tr><td>アパーチャー</td><td>エドモンド オプティクス</td><td>39-905</td><td>1000 &mu;m 絞り径、金メッキ銅 絞り</td></tr><tr><td>ホルダー</td><td>Edmund Optics</td><td>53-287</td><td>25.8mm 外径、精密ピンホール マウント</td></tr><tr><td>Catalse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-40</td><td>ウシの肝臓からのカタラーゼ、凍結乾燥粉末、&ge;10,000単位/mg タンパク質</td></tr><tr><td>COMPex Proレーザー</td><td>Coherent</td><td>1113836</td><td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrFレーザー, No XeCl</td></tr><tr><td>Dithiotheitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td></tr><tr><td>フラクションコレクター</td><td>GenNext Technologies, Inc.</td><td>N / A</td><td>自動フラクションコレクター</td></tr>フュー<tr><td>ズドシリカキャピレイ</td><td>モレックス</td><td>1068150023</td><td>ポリマイクロフレキシブルフューズドシリカキャピラリーチューブ、内径100&マイクロ;m、外径375&マイクロ;m、TSP100375</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Acros Organics</td><td>119951000</td><td>L(+)-グルタミン、99%</td></tr><tr><td>レンズ用ホルダー</td><td>Edmund Optics</td><td>03-668</td><td>53 mm 外径、3ネジ調整可能リングマウント</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>過酸化水素、30% (認定 ACS)、Fisher Chemical</td></tr><tr><td>LC-MS/MS システム</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>Orbitap Fusion Tribrid質量分析計に結合されたDionex Ultimate 3000</td></tr><tr><td>Masスペックグレード アセトニトリル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A955-1</td><td>アセトニトリル、オプティマLC / MSグレード、フィッシャーケミカル</td></tr><tr><td>質量分析グレードギ酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A117-50</td><td>ギ酸、99.0 +%、Optima&trade;LC/MS グレード、フィッシャーケミカル</td></tr><tr><td>質量分析グレード 水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W6-4</td><td>水、オプティマ LC/MS グレード、フィッシャーケミカル</td></tr><tr><td>MES バッファー</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M0164</td><td>MES ヘミソジウム塩</td></tr><tr><td>メチオニンアミド</td><td>バケム</td><td>4000594.0005</td><td>H-met-NH2.HCl</td></tr><tr><td>マイクロ V クランプ</td><td>トールラボ</td><td>VK250</td><td>マイクロ V クランプ ステンレス鋼ブレード付き</td></tr><tr><td>電動ステージ</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>68-638</td><td>50mm トラベル 手動制御付き電動ステージシステム</td></tr><tr><td>ナノ C18 コラム</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>164534</td><td>絶賛 PepMap 100 C18 HPLC カラム</td></tr><tr><td>光学ベンチ</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>56-935</td><td>18インチ x 18インチ ブレッドボード</td></tr><tr><td>FPOPモジュールシステムのパイオニア</td><td>GenNext Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>インライン FPOP ラジカル線量測定システム</td></tr><tr><td>ポストホルダー</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>58-979</td><td>3" 長さ、&frac14;-20 スレッド、ポストホルダー</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP331-500</td><td>リン酸ナトリウム二塩基性七水和物 (無色から白色の結晶)、フィッシャー・バイオ試薬</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP330-500</td><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(無色から白色の結晶)、フィッシャーバイオ試薬</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81065</td><td>100 &micro;L、モデル1710 RN SYR、小型リムーバブルNDL、22s ga、2インチ、ポイントスタイル3</td></tr>シ<tr><td>リンジポンプ</td><td>KDサイエンティフィック</td><td></td><td>788101レガート&nbsp;101シリンジポンプ</td></tr><tr><td>Trap C18</td>カラム <td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td>Thermo Scientific&nbsp;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC カラム</td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>252859</td><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>プロメガ</td><td>V5111</td><td>シーケンシンググレード 修正トリプシン</td></tr><tr><td>UV 平凸レンズ</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>84-285</td><td>直径 30 mm x 120 mm FL コーティングなし、UV 平凸レンズ</td></tr></tbody></table>

タンパク質トポグラフィ変化の測定のためのタンパク質の高速光化学酸化におけるリアルタイム補正の実現

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、タンパク質の溶媒にアクセス可能な表面積をプローブする質量分析ベースの構造生物学技術です。この技術は、溶液中で自由に拡散するヒドロキシルラジカルとのアミノ酸側鎖の反応に依存する。FPOPは過酸化水素のレーザー光分解によってその際にこれらのラジカルを生成し、マイクロ秒のオーダーで枯渇するヒドロキシルラジカルのバーストを作り出す。これらのヒドロキシルラジカルが溶媒にアクセス可能なアミノ酸側鎖と反応する場合、反応生成物は質量分析法により測定および定量することができるマスシフトを示す。アミノ酸の反応速度はそのアミノ酸の平均溶媒アクセス可能な表面に部分的に依存するため、タンパク質の所定の領域の酸化量の測定された変化は、異なる立体間のその領域の溶媒アクセシビリティの変化(例えば、リガンド結合対リガンドフリー、モノマー対集合体)に直接相関することができる。FPOPは、タンパク質とタンパク質の相互作用、タンパク質の立体構造変化、タンパクリガンド結合など、生物学における多くの問題に適用されてきました。ヒドロキシルラジカルの利用可能な濃度は、FPOP実験における多くの実験条件に基づいて変化するので、タンパク質検体が暴露される有効なラジカル用量を監視することが重要である。このモニタリングは、FPOP反応からの信号を測定するためにインライン線量計を組み込むことによって効率的に達成され、レーザーフルエンスはリアルタイムで調整され、所望の酸化量を達成する。この補正により、コンフォメーション変化、リガンド結合面、タンパク質間相互作用界面を反映したタンパク質トポグラフィーの変化を、比較的低いサンプル量を用いて異種サンプルで決定することができます。

リン酸緩衝液中のアダリムマブバイオシミラーの重鎖ペプチド足跡と55°Cで1時間加熱した場合の比較は、興味深い結果を示す。学生のt検定は、これら2つの条件で有意に変化するペプチドの同定に使用されます(p ≤ 0.05)。ペプチド20-38、99-125、215-222、223-252、260-278、376-413、および414-420は、タンパク質が熱されて凝集体を形成する際に溶媒から有意な保護を示す(図5)30。この実験では、加熱および凝集時に地形変化を経験するペプチド領域を同定した。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig05.jpg"> 図5:アダリムマブの重鎖のペプチドレベルのフットプリント。ペプチドは、室温でのアダリムマブ(青)の平均酸化、および(オレンジ...

タンパク質の高速光化学酸化は、タンパク質の構造特性を示す新たな手法です。異なる溶媒添加剤およびリガンドは、ヒドロキシルラジカル清掃特性を多様に有している。異なる条件でタンパク質構造を比較するために、反応で生成されたヒドロキシルラジカルのリアルタイム補償が反応条件を正常化するために必要である。

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

この方法は、タンパク質の確認とタンパク質相互作用の測定を容易にします。バッファー組成物、サンプルの純度およびタンパク質濃度の要件は、困難な構造上の問題に対処する方法を可能にする柔軟です。この手法により、多種多様な異なるバッファー システムでサンプルを圧縮できます。私たちのドシメトリー法を使用して、研究者はラベリング反応がリアルタイムでどれだけうまく機能しているかを監視することができます。この技術の1つのアプリケーションは、研究者が広く異なる薬物製剤をテストし、それらがタンパク質構造にどのような影響を与えるかをテストすることができるので、医薬品開発にあります。FPOP 光ベンチを準備します。まずレーザーをオンにし、外部トリガ、一定エネルギー、ガス交換なしにレーザーを設定します。レーザーが温まった場合、パルス当たりのレーザーエネルギーをパルスあたり80〜120ミリグラムに設定し、ブタントーチを使用して、インライン線量計がレーザー暴露後に265ナノメートルで吸収信号を読み取る場所で毛細管のポリイミドコーディングを穏やかに燃焼させます。糸くず拭き取りとメタノールを使用して毛細血管から残骸を静かに拭き取り、洗浄した毛細管をレーザーのビームパスを通ってインライン線量計に入れる。インライン線量計の上部にあるレバーを押してヒンジを開き、磁気ホルダーを取り外します。磁気ホルダーを使用してインライン線量体の機械溝にキャピラリーを置き、キャピラリーを所定の位置に保ち、レバーが所定の位置にロックされるまでヒンジを押すキャピラリーの上に線量計ヒンジを閉じます。ドシメトリーソフトウェアの開始フラッシュボタンをクリックしてエキシマレーザーの発射を開始し、レーザー発射で線量測定ソフトウェアの10〜20ヘルツの間でプリセットの繰り返しレートを設定すると、その動きの範囲を通して電動ステージが移動し、ビームがアパーチャーの中心にとどまり、キャピラーのシルエットを全体に観察することができます。次に、キャピラリーを1分間20マイクロリットル/分で水で洗い流し、データ収集を開始する前に、ドーシメータソフトウェアの開始データと自動ゼロをクリックして、水に対するドーシメータをゼロにします。FPOP実験を行うため、過酸化水素を2マイクロリットルのFPOP溶液に加え、ピペットを使用して、チューブ底部の溶液を遠心分離で素早く回収し、ガスタイトな注射器を使用して溶液をシリンジポンプにロードします。スキャン・ポンプを開始して、適切な流量でシリンジポンプの流れを開始し、265ナノメートルの吸収信号が廃棄物容器内のサンプルを集めるのが安定するまで、インライン線量計を使用してリアルタイムのアデニン読み取りを監視します。あらかじめ設定された繰り返し速度の終了エネルギーでレーザーの発射を開始するには、線量計ソフトウェアの開始

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