Name: シリコンナノワイヤと細胞間電気結合の研究のための光刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶシリコンナノワイヤを用いた細胞内光刺激法で、高い空間分解能と細胞特異性を持つ電気的インターロゲーションを実現します。心筋細胞や脳細胞など様々な細胞タイプの生体電子学的研究に応用可能です。

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この研究は、空軍科学研究局(AFOSR FA9550-18-1-0503)によってサポートされています。

倫理基準の遵守を確保するために、げっ歯類の心臓から心筋細胞を隔離することに関連するすべての動物の手順は、シカゴ大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって最初に承認されました。さらに、すべての動物実験は、シカゴ大学IACUCからの指導に従って完全に行われました。
1. 細胞-SiNWsハイブリッドの調製
<ol><li>メーカーのガイドラインに従って、商用キットを使用して、一次心筋細胞(CM)を分離します。</li>
	<li>10%の熱不活性化ウシ胎児血清、1%ペニシリンストレプトマイシン、および1%L-グルタミンを補った一次細胞分離のための完全なDMEMを準備する。</li>
	<li>MFs-CM懸濁液から筋線維芽細胞(MF)を分離するには、分離した細胞を組織培養皿(ステップ1.1.1.1から2つの心臓から単離された細胞)に1時間前プレートします。CMはフィブロネクチンまたはコラーゲン処理面を接着する必要がありますので、MFsだけが組織培養表面に付着します。</li>
	<li>濃縮されたCM細胞懸濁液を吸引する。これらのCMは、セクション3に記載されているように、ヘテロ細胞結合実験に使用することができる。MM で MF を洗い上がって、MF の皿から残っている CM を取り除きます。</li>
	<li>新鮮な培養培地をMFに加え、〜80%コンフルエント(2-4日)になるまで増殖させます。1 日おきにメディアを変更します。</li>
	<li>細胞の準備ができたら(80%コンフルエント)、下記のハイブリダイゼーションステップ(ステップ1.7)のためにSiNWを準備します。 注: これには多くの種類のSiNWを使用できます。本実験では、コアシェルp-i-n接合構成を有する化学蒸着(CVD)によって成長させたSiNWを、前述の16に用いた。CVD成長の間、SiNWはシリコンウエハ基板上で成長し、最終的にはSiNWで覆われたシリコンチップとして保持されます。</li>
	<li>ダイヤモンドの筆記者を使用して、CVD成長SiNWでウエハーから3mm x 3mmチップをカットします。鋭利な鉗子を使用してウエハを処理し、SiNWを破壊する可能性があるため、鉗子に触れる表面積を最小限に抑えます。</li>
	<li>チップを70%エタノールでリンスし、バイオセーフティラミナーフローフードでUV光下で30分間乾燥させてチップを殺菌します。</li>
	<li>完全な培養培地を使用して、無菌マイクロ遠心チューブにチップを移し、余分なエタノールをすすります。</li>
	<li>培養メディアの1 mLを追加し、1-10分間超音波浴でチップを超音波処理します。SiNWがメディアにリリースされると、メディアは曇りになるはずです。 注:短い持続時間と低いパワーが長いSiNWをもたらすように、超音波処理の時間とパワーは、異なる超音波装置や異なるセルのために最適化する必要があります。</li>
	<li>SiNWs懸濁液を5mLの培養培地に加え、MFで100mm組織培養皿に播種します。部分的に内部化された SiNW が使用する前に別の 1 時間座って、内部化を完了することを許可します。 注: セルの種類によって SiNW の濃度や内部化時間が異なる場合があります。</li>
	<li>1:50の比率で無菌20 mM酢酸でコラーゲンストック溶液(3mg/mL)を希釈してコラーゲンコーティング液を調製します。35mmガラス底皿に0.5 mLコーティング溶液を加え、37°Cで1時間座るようにします。 溶液を取り除き、滅菌PBSで皿を洗いすります。</li>
	<li>3mLのトリプシンで細胞を37°Cで2分間処理して、細胞-SiNWsハイブリッドを収穫します。 10 mLの培養培地を加え、ピペットでハイブリッドを激しくすすいます。細胞を200 x g で5分間静かに遠心分離し、内部化されたSiNWで細胞を損傷しないようにします。余分な培地を取り除き、1 mL培地で細胞を懸濁し、コラーゲン処理ガラス底皿に播種します。 注:ハイブリッドは、単独で播種することができ、細胞内または細胞間の結合を調査するか、またはVITROで異細胞結合を調査するためにCMを使用して。</li>
	<li>細胞の細胞質(カルセイン-AM、4 μM)および膜(膜マーカー、2μM)を37°Cで30分間標識し、共焦点顕微鏡を用いて細胞をイメージングすることにより、SiNW内在化の最終検証を行います。SiNWは反射性が高く、反射光を蛍光の代わりに使用して可視化することができます。</li>
</ol>2. 細胞内・細胞間調査のための細胞の調製
<ol><li>コラーゲンコーティング液を1.12のように調製</li>
	<li>細胞内電気刺激のために、低い播種密度を有する培養ハイブリッド。セクション1.11から細胞を数えるために標準的なヘモサイトメーターを使用してください。そして、培養培地で35mmガラス底皿に50,000個の細胞を種付けします。細胞間調査では、より高い細胞密度(1皿あたり50万個の細胞)を使用してください。CMとMFの間の細胞間結合のために、新たに単離されたCMとのハイブリッドを共同培養する。</li>
	<li>光学刺激実験を行う前に細胞が一晩付着することを可能にする。細胞間調査では、実験が行われる前に細胞間ギャップ接合部を発現するために細胞が37°Cで48時間を許容する。</li>
	<li>50 μg Fluo-4 AMに DMSO 50 μL を加えて、カルシウム感受性染料ストック液(-20 °C)を調製します。1 μLの色素を1 mLのDMEMに希釈して染色液を調製します。</li>
	<li>細胞から培地を吸引し、1mLの染色液を加える。色素を37°Cで20〜30分間細胞に内在させます。 滅菌PBSで染料とリンスを2回吸引する。</li>
	<li>最後に、1 mLのプレ温フェノールレッドフリーDMEM培地を添加し、細胞内Fluo-4を37°Cで30分間の脱エステル化を行います。</li>
	<li>細胞を顕微鏡に移してイメージングと刺激を行います。</li>
</ol>3. 光学的イメージングと刺激
<ol><li>加湿したマイクロインキュベーターを37°Cに予熱し、気泡-CO2 混合物(95:5)を加えます。</li>
	<li>カルシウムイメージングと光学刺激のために、コリメートレーザーラインを光路に結合した顕微鏡を使用してください。 注:走査共焦点顕微鏡は、その点刺激能力に最も簡単なオプションです。しかし、この手順は、ビームスプリッターを使用して光路の無限空間にコリメートレーザービームを結合することにより、任意の標準的な蛍光顕微鏡を使用して行うことができる。任意の顕微鏡の目的は、それを通過したコリメートレーザーが焦点を合わせるように設計されています。レーザー波長は励起光に近いはずですので、二色性鏡によって反射され、励起フィルタによって通過します。</li>
	<li>SiNWを可視化し、明視野顕微鏡、透過光、反射光を使用して刺激部位を決定します。次に、SiNWの所定位置で刺激点を維持しながら、蛍光モードへの光路を再構成する。</li>
	<li>SiNWサイズと細胞タイプごとに最適な刺激力とパルス長さを検証し、刺激を受けた細胞への光熱損傷を最小限に抑えます。典型的な刺激プロトコルについては、細胞内カルシウム活性の2〜10sベースライン記録を行う。次に、1~10mWの電力と1~10ミリ秒のレーザーパルス(30~300kW/mm2に対応)を1回塗布してSiNWを刺激し、得られたカルシウム波を2~10秒に記録します。 注: 各 SiNW サイズとセルに対して、光パワーとパルス長を最適化することが不可欠です。これは、刺激された細胞への光熱損傷を最小限に抑えるために必要です。</li>
	<li>さらに分析するために、必要に応じて光学刺激の記録されたムービーを転送します。</li>
</ol>4. ビデオ処理
<ol><li>ImageJ18で利用可能な「dF over F」マクロ17を用いて蛍光4の変化を可視化し、各画素の蛍光数の変化を計算し、残りのベースラインの平均値で正規化する。出力 (浮動小数点形式) を 8 ビットに変換して、さらに処理を行います。</li>
	<li>ImageJ で利用可能な選択中中央値フィルタを使用して、dF/F ムービーをさらに処理します。2 ピクセルの半径の中央値より 10 以上のピクセル値を削除し、そのピクセル値を中央値に置き換えるパラメーターを定義します。</li>
	<li>Matlab コンピュータ ビジョン ツールボックスに実装されているように、ルーカス カナデ アルゴリズムを使用して各フレームのオプティカル フローを計算します。この関数の出力は、各画像の各点におけるオプティカルフローのx成分とy成分を含むベクトル場であった(補足 ファイル1でコードが入手可能である)。 メモ: セル内の平均オプティカル フロー <ν> は、セル内のカルシウムフラックスの開発に対応します。光流量の微分Δ<ν>は、シグナルが最大になった場所を特定することで、カルシウムシグナルが活性化された時点を提供します。さらに、最大の Δ<ν> の大きさは、カルシウム波前線が細胞を通過する速度と相関しています。</li>
	<li>以下の式に従って、カルシウム透過の細胞間速度を計算する。 vCa2+ = rij / ( t max,j - tmax,i ) ここで、tmax、jおよびtmax、iは、それぞれセル j と i の活性化の時間であり、rijはセルの中心間の距離です。</li>
</ol>

<ol><li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectric+controls+of+cell+proliferation%3A+ion+channels%2C+membrane+voltage+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li>
<li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions%3A+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li>
<li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497(2016).</li>
<li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116(2017).</li>
<li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li>
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<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li>
<li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).</li>
<li>Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).</li>
<li>Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li>
<li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte%3A+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li>
<li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091(2019).</li>
<li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Researach%22%5BJournal%5D)">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li>
<li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+%3A+Active+players+in+%28atrial%29+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Herzschrittmacherther+Elektrophysiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li>
<li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li>
<li>Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33(2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ここでは、細胞の細胞内電気刺激を行う簡単な方法を示しました。このデモでは、SiNW でプレハイブリダイズされた MF を使用し、CM と共培養しました。一般に、増殖する細胞の多くはSiNWを内在化する傾向があり、他の多くの細胞タイプでこの方法論を使用することができます。また、細胞内刺激を実証する一方で、細胞外刺激にも同じ原理を用いることができる。これは、自発的に内部化する15個の細胞の内皮カスケードを遮断するか、SiNWsを内部化しない細胞を使用することによって行うことができる。例えば、CMはいくつかのナノ構造20,21を内部化することが判明したが、SiNWs15を自発的に内部化しない。ここで使用したSiNWを、化学気相蒸着(CVD)装置を用いて合成した。SiNWs合成の詳細な手順については、他の場所で見られる詳細な手順に関する追加のリソースを参照してください。</su...

すべての生物は、細胞の挙動を調節するために、イオンの形で電気を使用します。細胞膜には、イオンの受動的かつ能動的な輸送を可能にする、さまざまなタイプの特定のイオンチャネルが含まれています。これらのイオンは、神経活動や骨格や心筋収縮などの興奮性細胞の機能を支配する。しかし、生体電気は非興奮性細胞においても重要な役割を果たし、細胞増殖1、神経免疫2、3、4、幹細胞分化5などの多くの細胞機能を支配する。
ここ数十年、バイオ電気の分野は、バイオエレクトロニクスインターフェースのための多くの技術の開発に貢献している、関心の高まりのレベルを引き付けています。マイクロ電極パッチピペットは、細胞内記録および刺激6のゴールドスタンダードである。この方法論では、ガラスピペットを特定の条件下で引っ張り、小さなミクロンの細孔サイズで鋭いエッジを形成します。このピペットはバッファーで満たされ、ピペットは細胞内容積とのバッファーの直接接触を可能にする。これにより、極めて高い信号対雑音比、細胞の電気的活動の正確な制御、および非常に高い時間分解能をもたらす生体電気インターフェースが得られます。この方法論は、最近ナノピペット構成7に縮小された非常に強力なツールですが、いくつかの重要な技術的な制限に関連しています。細胞質ゾル希釈効果8は、機械的振動と同様に、その有用性を短期的な尋問に制限し、高価な特殊な機器と高いレベルの技術スキルを必要とします。さらに、そのかさばりは、同時に記録または刺激することができる細胞の数を制限し、その侵襲性のために、実験全体を通して再構成することはできません。これらの限界を克服するために、マイクロ電極アレイが開発されましたが、電極の大きさは空間分解能と細胞内アクセスを制限します。ナノ電極アレイは細胞内の記録と刺激を可能にするが、細胞質ゾル9、10にアクセスするには研磨エレクトロポレーションが必要である。さらに、これらすべての方法論は基質結合であり、したがって、3次元(3D)組織の内部にある細胞にアクセスしない体外細胞培養物、または外部の表面細胞に限定される。
光遺伝学11 は、これらの3Dおよび生体内の制限に対処するために広く使用されている。しかし、光遺伝学的方法は、原形質膜に分布する光活性化形質膜イオンチャネルの摂動に基づいており、3D空間分解能12 および細胞内能力を制限する。
我々は最近、シリコンナノワイヤ(SiNW)が異なる非興奮性細胞、すなわち心臓筋線維芽細胞およびオリゴデンドロサイト13とのサブミクロン空間分解能を有する細胞内生体電気的尋問を行うために使用できることを示した。さらに、これらのSiNWを用い、3D心臓組織内での元生体細胞特異的な調合を行い、心臓細胞が生体内で電気的に結合する方法を調べる。この方法論の主な利点は、そのシンプルさです。遺伝子組み換えやかさばる計測は必要ありません。多くの細胞は、超音波処理やエレクトロポレーション15を必要とせず、写真応答SiNWsを自発的に内部化します。さらに、それらは、自然に内皮カプセル化を逃れ、細胞質体および細胞内小器官13,15とのシームレスな統合を形成する。これらのセル-SiNW複合材料は、セルシリコンハイブリッドと呼ばれる、元の細胞のダイナミックで柔らかく、汎用性の高い性質だけでなく、SiNWの光電能力を有する。ハイブリダイゼーション後、細胞-SiNWハイブリッドは、標準的な組織培養技術を使用して収穫することができ、細胞内生体電気刺激などの様々な用途に使用することができます。細胞間生体結合を研究するそしてインビボ細胞特異的尋問のために。効果的な刺激は高い光学パワー密度とSiNWの共局在化を必要とするため、2Dと3Dの両方で高い空間分解能を実現できます。このプロトコルでは、方法論と結果の分析方法について詳しく説明します。インビトロでの細胞内および細胞間調査に焦点を当てていますが、この方法論のインビボ実装は、他の多くの生物学的シナリオに直接利用することができます。

<table><tbody><tr><td>35 mm ガラス底皿</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas Spinning Disk Confocal</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange Plasma membrane Stain</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I、ラットテール</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Diamond Scribing Pen</td><td>Ted Pella</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸、グルタミン無</td><td>10313039</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>DMSO、無水</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、熱不活性化、</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチンヒトタンパク質、血漿</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, 細胞透過性</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM 培地</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>OKO full environmental control chamber (constant温度、湿度、CO2)</td><td>OKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

シリコンナノワイヤと細胞間電気結合の研究のための光刺激

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

筋線維芽細胞はシリコンナノワイヤ(SiWn)を自発的に内部化し、バイオエレクトロニクスアプリケーションの魅力的なターゲットとなっています。これらのセルシリコンハイブリッドは、通常の細胞挙動への摂動を最小限に抑えた、鉛のない光学変調機能を提供します。光学機能は、SiNWの光熱および光電特性によって得られる。これらのハイブリッドは、標準的な組織培養技術を使用して収穫し、異なる生物学的シナリオに適用することができます。ここでは、これらのハイブリッドを使用して心臓細胞の電気結合を研究し、筋線維芽細胞がどのように互いに結合するか、または心筋細胞と比較する方法を実証します。このプロセスは、結合されたレーザーラインを有する蛍光顕微鏡を超える特別な装置なしで達成することができる。また、培養中の異なる細胞内および細胞間のカルシウム伝搬の定量化を可能にするカスタム構築MATLABルーチンの使用も示されている。筋線維芽細胞は、心筋細胞のそれよりも遅い電気応答を有することが示されている。さらに、筋線維芽細胞間伝播は、細胞内速度に匹敵する速度であるが、ギャップ接合部またはナノチューブを介した受動的な伝播を示唆するが、わずかに遅い結果を示す。この技術は非常に適応性が高く、インビボやインビボ調査のために他のセルラーアリーナに簡単に適用できます。

細胞内サイトゾルへの直接アクセスを可能にするこの方法論の能力は、SiNWの細胞内への自発的な内在化に依存する。SiNWは多くの細胞型15に自発的な内在化を行うが、心筋細胞やニューロンなどの一部の細胞は、その内在化を可能にするためにSiNWを治療する必要がある。このプロトコルでは、200-300 nmの直径および心臓MFに対して〜1〜3μmの長さのp-i-n SiNWの内部化プロセスを説明 する。 標準的な位相コントラスト光学を用いて、コンフルエント細胞は容易に明らかであった。しかし、SiNWはほとんど見えなくなり、その場所を定義することは不可能でした。したがって、反射物体のみが見え、背景が暗い暗い暗視野顕微鏡を使用しました。しかし、この対照的に、細胞は反射的ではないため、見ることができません。細胞内のSiNWの位置を示すために、我々は細胞内のSiNWsの核外配置が明らかになるように、画像を重ね合わせた。SiNWと細胞の共局在化は明らかですが、SiNWが実際に細胞内に内在し、形質膜上に...

このプロトコルは、細胞内光学バイオ変調のためのシリコンナノワイヤの使用を、簡単かつ容易に行う方法で説明する。この技術は、多様な細胞タイプに適応性が高く、インビトロおよびインビボ用途にも使用できます。

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

この技術は、標準的な光学顕微鏡のみを用いて、非常に高い空間分解能と細胞特異性を有する細胞内生体電気的尋問を可能にする。この方法は、細胞および細胞内の特定の位置の刺激および電気的尋問を促進し、3D ex vivo組織製剤でだけでなく、インビトロで行うことができる。この技術は、心臓細胞や脳細胞などの多くの細胞アリーナのバイオ電子調査と、すべての非興奮性細胞間の電気的コミュニケーションを可能にします。筋線維芽細胞を筋筋細胞懸濁液から分離するために、100ミリメートルの組織培養皿に分離された細胞を1時間予めプレートし、心筋細胞が付着する繊維をネック化して処理した表面を必要とする。インキュベーションの終了時に、下流共培養用の上清を含む濃縮心筋細胞を収集する。DMEMで筋線維芽細胞をリンスして残りの心筋細胞を排除し、さらに2〜4日間のインキュベーションの前に新鮮な培養培地で細胞を供給する。細胞が80%のコンフルエンシーに達したら、ダイヤモンドの筆記者を使用して、化学気相成長シリコンナノワイヤを持つウエハーから3ミリメートルチップを3%切ります。70%エタノールでチップをすすいるために鋭い鉗子を使用して下さいます。すすい後、バイオセーフティラミナーフローフードの紫外線下で30分間、チップを無菌マイクロ遠心分離管に移す前に空気乾燥させます。完全な細胞培養培地リンスを使用して残りのエタノールを除去し、1〜10分間超音波処理浴中の新鮮な培養培地の1ミリリットルでチップを超音波処理する前に。上清は、ナノワイヤーが放出されると曇るはずです。シリコンナノワイヤー懸濁液を5ミリリットルの新鮮な培養培地に混ぜ、ナノワイヤー溶液をミオ線維芽細胞の皿に種付けします。細胞培養インキュベーターで4時間後、新鮮な培養培地で皿を5回洗い、非内在化したナノワイヤを除去し、さらに1時間細胞をインキュベートし続け、部分的に内在化されたナノワイヤを完全に組み込むことができるようにします。次に、作りたてのコラーゲンコーティング液を500マイクロリットルの35ミリメートルガラス底皿に加えます。摂氏37度で1時間のインキュベーションを行った後、滅菌PBSで皿を洗い上げ、3ミリリットルのトリプシンを3ミリリットルのトリプシンで37°Cで2分間収穫します。細胞が剥離したら、10ミリリットルの培養培地で反応を停止し、ピペット処理により激しくすすぐ、細胞にダメージを与えないように200G以上の遠心分離を行わない。その後、ハイブリッド細胞ペレットを1ミリリットルの新鮮な培地で再中断し、コラーゲンコーティングガラス底皿に細胞を播種する。ナノワイヤの内部化を検証するには、標準的なプロトコルに従って蛍光サイトゾルと膜色素で細胞にラベルを付け、共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化します。シリコンナノワイヤは反射性が高く、反射光を可視化するために蛍光の代わりに使用することができます。筋線維芽細胞シリコンナノワイヤーハイブリッド心筋細胞共培養をセットアップするには、各細胞タイプの適切な数をコラーゲンコーティングガラス底皿に播種します。そして、細胞を摂氏37度で48時間培養し、細胞間ギャップ接合部を形成できるようにした。実験当日、培養上清を、調製したカルシウム感受性染料を1ミリリットルの培地に交換し、摂氏37度で20~30分間培養する。インキュベーションの終わりに、滅菌PBSでプレートを2回洗浄し、プリ温めのフェノールレッドフリーDMEMの1ミリリットルで細胞を処理する前に。その後、細胞内カルシウム色素が37°Cで30分間脱エステル化し、ベースライン画像を取得します。光学イメージングと刺激の前に、加湿したマイクロインキュベーターを顕微鏡に予熱し、光路に連結したレーザーラインを用いて、カルシウムイメージングと光学刺激を摂氏37度と5%気泡時代の二酸化炭素混合物に予熱します。顕微鏡の準備ができたら、ミクロインキュベーターに筋線維芽細胞ハイブリッド心筋細胞共培養液を入れ、明視野顕微鏡でナノワイヤを可視化し、適切な刺激部位を見つけます。サイトが特定されたら、ナノワイヤの事前定義された位置に刺激点を維持しながら蛍光モードへの光路を再構成し、各シリコンナノワイヤーサイズとセルタイプに最適な刺激力とパルス長さを検証します。ベースライン細胞内カルシウム活性の2〜10秒の記録を取得し、1~10メロワットの電力と1〜10ミリ秒の持続時間の単一のレーザーパルスでナノワイヤを刺激する前に、得られたカルシウム波をさらに2〜10秒間記録する。実験の最後に、光学刺激の記録されたムービーを適切なソフトウェアプログラムに移し、さらなる分析を行う。標準的な位相コントラスト光学を使用して、合流細胞は光顕微鏡によって容易に見られる。しかし、シリコンナノワイヤーはほとんど見えないので、この方法ではその位置を定義することは不可能です。しかし、光と暗いフィールド画像のスーパー面付けは、光反射シリコンナノワイヤーのペリー核配置の視覚化を可能にする。共焦点顕微鏡を用いて、蛍光マーカー染色されたサイトゾルや細胞質膜を可視化し、シリコンナノワイヤの細胞内位置をより明白にすることができる。標準的な顕微鏡を用いて、明視野画像を得て、刺激されるシリコンナノワイヤの位置を特定することができる。自発的に鼓動する心筋細胞と休息中の筋線維芽細胞の短いベースラインビデオを取得することができます。刺激後、共培養中のカルシウム伝播を記録することができる。異なるセルが励起される時間は、平均オプティカルフローの変化がその最大値に達した時点で決定できます。オプティカルフローは、各セル領域内の活性化時間の同定に役立つ計算が可能です。細胞内速度は、細胞内伝搬速度の逆を表す線の傾きを用いて、ハイマグラフを使用して細胞ごとに決定することができる。例えば、ここでは、単一の共培養内の細胞相互作用について測定された異なる細胞間および細胞内速度の要約が観察できる。この方法は、細胞シリコンハイブリッドを直接組織に注入し、生体内電気会社を研究するための3D ex vivo製剤を使用することにより、インビボ研究に利用することができる。

silicon-nanowires-optical-stimulation-for-investigations-intra

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

電位感受性色素は、その単一細胞から複数の神経節の回路への範囲は調整可能な解像度と、そのようなモルモット腸神経系の神経叢としてそのままニューラルネットワークからの電気活動の光学的記録を有効にする方法このプロトコルは示しています。...

電位感受性色素を用いてモルモット腸ネットワークにおける電気活動の光学的記録

ChR2を表現成人生まれのニューロンは嗅覚神経回路の機能に向けての貢献を検討するために、スライスの電気生理学的な準備に操作することができます。...

ニューロンの光刺激のために手ごろな価格のLEDアレイを使用する

我々は、大規模な複数の単一ユニットの記録とシリコンプローブとげっ歯類を動作中のローカルフィールドポテンシャルの方法について説明します。ドライブ製造、ドライブとプローブ注入プロセスへのプローブの添付ファイルが簡単に複製するのに十分詳細に示されています。...

動作げっ歯類の可動シリコンプローブによるニューロンの大規模なレコーディング

このビデオは、細胞外マトリックスでコーティングされたマイクロ流体チップを使用して、電気刺激を通じて神経幹細胞と前駆細胞またはNPCを区別する方法を示しています。コーティングされた領域に播種して付着した後、NPCは成長し、直流を印加するとニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトへの分化が引き起こされます。...

電気刺激による神経幹細胞と前駆細胞の分化

赤外線神経刺激は、聴覚系に関連するものを含む神経種類の範囲内の電気刺激の代替として提案されている。このプロトコルは一次聴覚神経細胞の培養における赤外線神経刺激のメカニズムを研究するためのパッチクランプ法を説明しています。...

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

このプロトコルは、金ナノロッドの光吸収に伴う一時的な加熱を使用して、ニューロン細胞の分化と細胞内カルシウム活性を刺激する方法を概説しています。これらの結果は、神経補綴物や神経科学の基礎研究における新たな応用の可能性を秘めています。...

神経細胞の金ナノロッド補助光刺激

有機半導体ポリマーの使用に基づく、可視光によるin-vitro細胞培養の電気的活動の刺激方法が説明されています。...

生細胞共役ポリマーにより電気的活動の光制御

神経細胞培養は、単一ニューロンまたはニューロンの人口への影響を通じて新興脳刺激技術を研究するための良いモデルです。ここに提示バス電極によって直接生成または時間変化する磁場によって誘起される電界によりパターニング神経細胞培養物の刺激のための異なる方法があります。...

電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起

ここでは、光伝達用光ファイバと神経記録用電極アレイを用いたオプトロードシステムの製造方法について紹介する。チャネルロドプシン-2を発現するトランスジェニックマウスを用いた インビボ 実験は、同時光遺伝学的刺激および電気生理学的記録のためのシステムの実現可能性を示す。...

同時光遺伝学的変調と電気的神経記録のためのオプトロードアレイ

光を使って心臓の細胞や組織を制御することで、非接触で刺激を受けることができるため、細胞の自然な状態や機能を保つことができるため、基礎研究や治療への応用に有用なアプローチとなっています。...

非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

このプロトコルは、光学的および電気的双方向バイオインターフェーシングのための高度な材料製造と ex vivo...

健康および虚血 性ex vivo ラット心臓における双方向電気および光電子界面

学ぶシリコンナノワイヤを用いた細胞内光刺激法で、高い空間分解能と細胞特異性を持つ電気的インターロゲーションを実現します。心筋細胞や脳細胞など様々な細胞タイプの生体電子学的研究に応用可能です。

シリコンナノワイヤと細胞間電気結合の研究のための光刺激

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