蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

私たちのプロトコールは、テサグリタザールをロードしたリポソームを調製するためのアクセス可能な方法と、細胞レベルでのリポソームの取り込みを評価するための徹底的なアプローチを組み合わせたものです。この手法は、低温で入手しやすい装置を使用して調製された蛍光標識リポソームの取り込みを評価するための偏りのない方法を提供します。酢酸カルシウムおよびテサグリタザールを充填した蛍光標識リポソームを調製するには、まず、室温、20キロヘルツ、および50%の電力で30秒間の超音波処理により、脂質のエーテルクロロホルム溶液を乳化するために半インチプローブを使用する。

均質化された水と油のエマルジョン溶液を、専用のアダプター、ナノメートルゲージ、圧力調整弁を備えたロータリーエバポレーターにすぐに移し、エバポレーターを真空ラインに接続します。有機溶剤を除去するには、回転速度を毎分100回転、真空度を0.5気圧に設定します。ゲルが形成されて消えた後、真空を0.9気圧に増やし、2つの気密シリンジを複数回装備したリポソーム押出機で200ナノメートルのポリカーボネートフィルターを注ぐことでリポソーム水性分散液を前後にろ過します。

動的光散乱によってサイズ分布を確認した後、2ミリリットルのスピンカラムを使用して、リポソームから捕捉されていないテサグリタザールを除去し、分光光度計を使用して捕捉された薬物濃度を決定します。次に、500マイクロリットル以下のリポソームサンプルをドライカラムゲルベッドに加えます。眼窩後注射でリポソームを投与するには、露出した目の上下の皮膚を優しく押し下げて、目を顔の平面より上に持ち上げます。

次に、針の先端を目の前隅に慎重に挿入し、針が球体に触れないようにオーブの下にあることを確認し、リポソームを眼窩後腔にゆっくりと注入します。血液サンプルを採取するには、適切な実験エンドポイントで、マウスの胸郭の尾側端の端にある皮膚を慎重に切開し、胸筋が露出するまで動物の頭に向かって1センチメートルの直線を切断します。最初の切開部位で、頭に向かって線に垂直に 2 つの小さな切り込みを入れ、露出した領域の胸郭の片側にある胸筋を慎重に切り取ります。

第3肋骨と第4肋骨の間に針をできるだけ胸郭の中心線に近づけて挿入し、シリンジをゆっくりと引き上げて採血を開始します。できるだけ多くの量が収集されたら、氷上に10マイクロリットルの0.5モルEDTAが入ったマイクロ遠心チューブに血液を移します。マウスの両側から鼠径部組織後パッドを抽出するには、1セットの鉗子を使用して腹膜を右側に保持し、2セットの鉗子を使用して皮膚の端を腹膜より上に保持します。

皮膚をメンブレンからそっと引き離し、層を互いに分離します。皮膚の外縁をピンで留めて、脂肪貯蔵庫にアクセスしやすくし、皮膚に沿って鼠径脂肪組織貯蔵庫を配置します。そして、必要に応じて鉗子とハサミを使用して脂肪貯蔵庫の中央にある鼠径リンパ節を特定し、リンパ節を切除します。

リンパ節を切除した後、鉗子を使用して、ピン留めされたポイントに最も近い脂肪貯蔵庫の端を慎重につかみ、脂肪組織と皮膚の間の結合膜に小さな切り込みを入れ始めます。膜へのアクセスを容易にするために切り込みを入れながら脂肪組織を皮膚から持ち上げ、氷上のHEPESバッファーを含むポリエチレンバイアルにデポを置きます。.腹腔の尾側端から精巣上体脂肪デポを抽出するには、鉗子を使用してマウスの背側端から最初の精巣上体脂肪デポを静かに引き抜き、このデポに付着した精巣上体と精管を見つけます。

次に、脂肪デポと精巣上体および精管の間を慎重に切断して、脂肪を他の組織から分離し、氷上にHEPESバッファーを入れたポリエチレンバイアルにデポを置きます。すべての組織を採取したら、1〜2組のハサミを使用して、脂肪組織サンプルを0.5ミリメートルの組織片にミンチにします。次に、脂肪組織片のバイアルに1.5ミリリットルの2ミリグラム/ミリリットルのコラゲナーゼ緩衝液を加え、バイアルを摂氏37度、毎分150回転で30〜45分間振とうするインキュベーターに入れます。

30分後、1ミリリットルのピペットを使用して、サンプルを数回回転させます。ティッシュピースがまだ大きすぎてピペッティングが簡単な場合は、サンプルをインキュベーターにさらに15分間戻します。サンプルが完全に分解されたら、フラグメントをさらに10回回転させて単一細胞懸濁液が作成され、各サンプルを個別の70マイクロメートルフィルターでサンプルごとに1本の50ミリリットルチューブに濾します。

各ファイルを5ミリリットルのFACSバッファーですすいで、残りの細胞を収集し、各洗浄液を氷上の細胞サンプルの適切なバイアルにろ過します。すべてのサンプルをろ過したら、遠心分離により細胞を回収し、サンプルから脂肪細胞上清を吸引します。次に、間質血管画分ペレットをそのままにして上清を慎重に吸引し、チューブあたり1ミリリットルのFACS緩衝液にペレットを再懸濁します。

次に、懸濁液を氷上の新しい1.5ミリリットルまたは1.7ミリリットルのチューブに移し、標準プロトコルによるフローサイトメトリー分析を行います。動的光散乱により、平均リポソーム直径は163.2ナノメートル、ゼータ電位はマイナス19.2ミリボルトであることが明らかになりました。極低温電子顕微鏡イメージングでは、動的光散乱によって測定された平均直径から得られる標準偏差が比較的小さい円形リポソームが明らかになります。

PBS処理マウスからのサンプルのフローサイトメトリー解析は、DiD蛍光から1つのコントロールを差し引いたものとして使用して、DiDポジティブゲートを作成することができます。この代表的な分析で示されているように、DiDのリポソーム負荷濃度が10ミリグラム/ミリリットルの場合、DiDの負荷濃度は高すぎ、試験した3つの組織すべてにおいてサイトメーターの定量化可能な範囲を超えています。0.1ミリグラム/ミリリットルの濃度は何らかのシグナルを示しますが、PBS処理細胞を超える明確な集団は観察されません。

したがって、1ミリグラム/ミリリットルの濃度は、PBSコントロールとの明確な区別を示しながら、分析装置でも読み取り可能であり、リポソーム調製に使用することが推奨されます。組織の種類ごとにわずかに異なるゲーティング戦略が必要ですが、それぞれで同じ細胞タイプのほとんどを同定できます。関心のある特定の集団が特定されると、各細胞集団の合計サイズとそれらがDiD陽性になる頻度を定量化できます。

試薬や機器を準備し、各ステップの結果を予測することは非常に重要です。早い段階で予期しない結果が出ると、将来の結果が台無しになる可能性があります。組織学的手法は、組織全体におけるリポソームの局在を評価するために使用でき、イメージングフローサイトメトリーは、細胞ごとにリポソームの内在化を確認するために使用できます。