Name: 蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶ 蛍光標識リポソームの調製とin vivo細胞取り込み評価法。超音波処理、ロータリーエバポレーター、動的光散乱を用いてリポソームを合成し、フローサイトメトリーで組織特異的取り込みを解析する手法です。

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著者らは、フローサイトメトリーのトレーニングとサービスを提供してくれたMichael Solgaと他のフローサイトメトリーコアスタッフに感謝したいと思います。著者らはまた、シヴァ・サイ・クリシュナ・ダーサ、ダスティン・K・ボークナイト、メリッサ・A・マーシャル、ジェームズ・C・ガーメイ、シャンテル・マクスキミング、アディティ・ウパディエ、プラサド・スリカクラプのリポソーム調製(SSKD、DKB)、組織採取(MAM、JCG)、フローサイトメトリー染色とサンプル取得(AU、PS、CM)を支援してくれたことに感謝したい。この研究は、アストラゼネカ、R01HL 136098、R01HL 141123およびR01HL 148109、AHA 16PRE30770007、およびT32 HL007284助成金の支援を受けました。

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著者は開示するものは何もありません。

ここでは、(i)蛍光脂質色素で標識され、抗糖尿病化合物テサグリタザールを装填したリポソームを調製し、(ii)眼窩逆注射を介してマウスにリポソームを投与し、(iii)フローサイトメトリーによって細胞レベルでリポソームの取り込みを検出するための組織の採取、処理、および染色の3つの部分からなるプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、約150μmのリポソームの調製と、脂肪、血液、および脾臓への取り込みの評価を確認します。リポソーム調製はスケーラブルで、主に室温で実行され、逆相蒸発を利用して薬物の負荷と有機溶媒の除去を最大化します。このプロトコルを使用すると、精製リポソームサンプルで最大2 mg/mLのテサグリタザール濃度を達成できます。調製したリポソームは、HEPESバッファーに4°Cで1年以上保存できます。私たちの経験では、彼らは平均粒子サイズの最小限の変動を示しました。薬物含量損失の10%未満は、10kDa遠心フィルターで外用薬物からリポソームを限外濾過分離した後、分光光度法で実証された。
リポソームの調製中、考慮すべきいくつかの重要なステップと要因があります。まず、プロトコルステップの順序は重要であり、遵守する必要があります。第二に、テサグリタザールの負荷時に使用される溶液のpHは、溶解度と効果的な負荷を最大化するために7.4に維持する必要があります。第三に、機器とフィルターを適切に組み立てることで、各ステップの出力が適切なサイズと純度になります。例えば、100 nmおよび200 nmのフィルターが適切に組み立てられていない場合、より不均一で不適切なサイズのリポソームのバッチが生じる可能性があります。第四に、リポソームへのテサグリタザールの移動を最大化するには、薬物ローディングの前に酢酸Caを完全に除去する必要があります。Ca-アセテートの完全な除去をテストするには、高速沈降を使用してリポソームを除去し、非リポソーム溶液中のCa-アセテートレベルを測定します。第五に、各ステップでリポソーム調製物に添加されたすべての材料の質量を秤量して記録することが重要です。これにより、適切な濃度が計算され、必要な材料の比率が維持されます。最後に、手法が適切に実行されない場合、望ましくないレベルの異質性が存在する可能性があります。DLSや電子顕微鏡などの他のアプローチを使用して、このパラメータを徹底的に確認することが重要です。均質性を向上させるには、選択したフィルターサイズを調整するか、2つのフィルターを積み重ねることを検討してください。
さらに、このプロトコルを完全に実施する前に、フローサイトメトリー用のコントロールと抗体パネルを計画および最適化することが重要です(表1、 表3)。抗体は、染色に適切な濃度が使用され、蛍光色素間のオーバーラップが最小限であることを確認するために試験する必要があります。リポソーム調製中に使用される色素の励起と放出も、パネル計画に考慮する必要があります。私たちの結果では、アロフィコシアニン(APC)やAlexaFluor 647などの蛍光色素と同様の励起と発光を持つDiDを利用しました。したがって、抗体パネルでは、これらの蛍光色素に結合した抗体を選択しませんでした。さらに、アイソタイプコントロールはこのプロトコルに含まれていません。これは、このプロトコル用に選択された抗体が十分に検証された市販の抗体であるためです。ただし、以前に最適化されていない抗体の使用に関心がある場合は、完全な実験を行う前に、目的の組織のアイソタイプコントロールに対して抗体をテストすることを検討してください。
このプロトコルは、マウスの後処理から血液、脾臓、鼠径脂肪、および精巣上体脂肪組織を抽出して処理する方法を示していますが、この一般的なアプローチは他の組織にも適用できます。目的の組織に応じて、次の組織について公開されているように処理および消化プロトコルを変更する必要がある場合があります:肺21、肝臓22、腹腔3、骨髄3,23、脳24。
考慮すべきこの方法の重要な制限は、摂取が動物ごとに1つの時点でしか評価できないことです。したがって、このプロトコルを他の非侵襲的イメージング技術と組み合わせるか、評価を実施するための十分なリソースを確保するためにそれに応じて計画することが有利な場合があります。リポソームは最初の24時間で全身を循環し、リポソームを取り込む細胞の寿命や取り込みに対する反応によっては、細胞死やさらなる食作用が起こる可能性があります。私たちの以前の研究は、異なる時点でのDiD+ 集団の集団特性の変化を示しました3。そのため、より早い時点または関心のあるメカニズムの生物学に最も関連する時点での取り込みを評価することが重要です。さらに、このプロトコルでは組織全体の細胞取り込みの定量化を行うことができますが、フローサイトメトリーでは組織の局在を明らかにすることはできません。このアプローチを組織学的手法と組み合わせると、この制限に対処するのに役立ちます。
一般に、このプロトコルは、組織学や全身蛍光イメージングなどの既存の方法論を補完します。フローサイトメトリーのツールと方法の継続的な進歩により、より多くの特異的な細胞集団に対するより大きなパネルの開発が可能になります。このプロトコルは、細胞取り込みの評価を改善し、フローサイトメトリーによって観察された結果を検証する機会も提供するため、前述の方法に加えて使用することを提案します。例えば、脂肪組織中の粒子の大部分がフローサイトメトリーによってマクロファージによって取り込まれたことがわかった場合。同じ脂肪組織の追加のアリコートの免疫蛍光を保存、固定、切片化、およびマクロファージマーカー用に染色して、細胞型が実際にリポソームを取り込むことを確認することができます。このアプローチは、実施されるナノ粒子生体分布アッセイに厳密さを追加するはずです:細胞特異的ターゲティングの検証、細胞取り込みの定量化、オフターゲット取り込みの特定、そしてうまくいけば、観察された治療結果のための機構的仮説を生成するための情報を提供します。このプロトコルは、さまざまなリポソームを使用した将来の研究、他の組織での取り込みの調査、肥満や代謝異常、またはナノ粒子送達が実行可能な治療オプションであるその他の疾患の設定における新しい化合物のテストにも適応できます。

ナノ粒子の薬物送達を利用する治療法の開発への関心が高まるにつれて、粒子の分布と取り込みを調製および評価する方法は、進歩し続け、拡大し、研究コミュニティが利用できるようにする必要があります1,2。このプロトコルは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)-α/γアゴニストであるテサグリタザールを装填したDiD標識リポソームによる治療後にin vivoでリポソームを取り込んだ正確な細胞型を評価するために開発されました3,4。これらの研究では、どの細胞型がリポソームテサグリタザール治療によって直接影響を受けたか、標的部分の有効性を評価し、観察された治療結果を説明する仮説を立てることができました。さらに、様々な細胞種において確立された生物学的機能は、マクロファージ、樹状細胞、および肝臓特異的クッパー細胞などの貪食細胞がリポソームの大部分を占めることを示唆している5,6,7。このプロトコルを利用して、非古典的食細胞もリポソームを取り込むことができることを実証しました3,4。
このプロトコルは、テサグリタザールの可溶化、逆相蒸発によるリポソームの調製、および遠隔薬物ローディングの誘引剤として酢酸カルシウムを使用するための最適化された方法を提示します。提示された方法は、多くのラボでアクセス可能であり、入手が困難な材料や高温を必要とするステップが不足しています。このプロトコルは、in vivo8での循環の増加に最適なサイズのリポソームを生成します。さらに、Suらによって要約されているように、今日まで、インビボリポソーム分布および組織取り込みを評価する方法が詳細に研究および試験されてきた9。陽電子放出断層撮影法(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、および蛍光分子断層撮影法(FMT)法を適用して、組織特異的な生体分布と取り込みを定量化します9,10,11。これらの方法は、in vivoでの検出を最大化するように最適化されていますが、細胞分解能でin vivoでのリポソーム取り込みを定量化する能力はまだありません。ここで紹介するプロトコルは、フローサイトメトリーを使用してこのニーズを達成することを目的としています。最後に、このプロトコルでは、細胞の取り込みを脂肪組織を含むいくつかの組織に絞り込みました。肥満、代謝異常、および炎症の設定で治療を提供するためにナノ粒子を使用する可能性を調査した文献が増えています12、13、14、15、16、17。そのため、これらの病態に重要な役割を果たす組織の一つである脂肪組織を処理・分析するための効果的な方法を共有することが重要であると考えました。

<table><tbody><tr><td>1mLシリンジ</td><td></td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>10mLシリンジ</td><td></td><td>BD 302995</td><td></td></tr><tr><td>25ゲージ針、後眼窩注射用滅菌</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27ゲージ針、後眼窩注射用滅菌</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス B220 BV421</td><td>バイオレジェンド</td><td>103251</td><td>クローン RA3-6B2</td></tr><tr><td>抗マウスCD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>クローンAFS98</td></tr><tr><td>抗マウスCD11b PerCP Cy5.5抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td>クローン<td>M1/70</td></tr><tr><td>抗マウスCD11c APC ef780抗体</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>クローンN418</td></tr><tr><td>抗マウスCD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>クローン1D3</td></tr><tr><td>抗マウスCD3 FITC抗体</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553061</td><td>クローン 145-2C11</td></tr><tr><td>抗マウス CD31 BV605</td><td>バイオレジェンド</td><td>102427</td><td>クローン 390</td></tr><tr><td>抗マウス CD45 PerCP</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>557235</td><td>クローン 30-F11</td></tr><tr><td>抗マウス F4/80 PE Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>123114</td><td>クローン BM8</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ジェミニ バイオプロダクツ</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>脱塩スピンカラム</td><td>ThermoFisher</td><td>89889、89890</td><td>Zebaスピンカラム</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>動的光散乱、Nicomp 370</td><td>粒子サイジングシステム、Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &PERM細胞透過化キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ</td><td>ダーマセア</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>リポソーム押出機</td><td>ミリポアシグマ</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>ナノサイト</td><td>マルバーン機器Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>眼科用潤滑剤</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz 滅菌</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16% w/v aq. soln., メタノールフリー</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>挽き物用ポリエチレンバイアル</td><td>ウィートン</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump 熱療法ポンプとパッド</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>トラックエッチングポリカーボネート膜</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore ポリカーボネート親水性膜</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS システム</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

特に標的治療アプローチのために、in vivoで化合物を送達するためにリポソームを使用することへの関心が高まっています。リポソーム製剤に応じて、リポソームは、体内の異なる細胞型によって優先的に取り込まれ得る。これは、さまざまな疾患の進行が組織および細胞型特異的であるため、治療粒子の有効性に影響を与える可能性があります。このプロトコールでは、DSPC、コレステロール、およびPEG-2000 DSPEと脂質色素DiDを蛍光標識として使用して、リポソームを合成および蛍光標識する方法の1つを紹介します。このプロトコルは、in vivoでリポソームを送達し、フローサイトメトリーを使用してリポソームの細胞特異的取り込みを評価するためのアプローチも提示します。このアプローチは、リポソームを取り込む細胞の種類を決定し、細胞型および組織にわたるリポソーム取り込みの分布および割合を定量化するために使用することができる。このプロトコルでは言及されていませんが、免疫蛍光やサイトメーターでのシングルセル蛍光イメージングなどの追加のアッセイは、細胞内染色の評価を可能にするため、得られた所見や結論を強化します。プロトコルは、目的の組織に応じて適合させる必要がある場合もあります。

リポソーム生産
ここで発表された結果は、以前に公開された研究3,4,20の結果と同様です。ここで提示したプロトコルを利用することで、約150〜160 nmのリポソームが作製できると期待しています。DLSは、163.2 nmの平均リポソーム直径と-19.2 mVのゼータ電位を明らかにします(図1A)。極低温電子顕微鏡(クライオEM)イメージングは円形リポソームを明らかにし(図1B)、DLS図は平均直径からの比較的小さな標準偏差を明らかにします(図1C)。
リポソーム結合の陽性にはPBS処理コントロールが必要
このプロトコルを採用した私たちのグループの以前の研究では、脂肪SVF、脾臓、および血液中のどの細胞サブセットがin vivo投与の1週間後にリポソームに結合したかを調査しました3,4。PBS処理マウスを用いて、腹腔および脾臓細胞を、リポソーム処理マウスからのサンプルに用いたのと同じ抗体パネルで染色した。組織は、1週間の処理後に採取した(図2A)。PBS処理マウスからのサンプルは、正のDiDゲートを作成するためのDiD FMOとして機能しました(図2B、C)。正のゲートはDiD陽性の信号を使用して作成できますが、DiD信号を欠くサンプルを使用して、正のゲートにDiD陰性のサンプルが含まれていないことを確認する必要もあります。
蛍光シグナルを最適化するには滴定が必要
完全な実験を実行する前に、細胞染色中に使用される蛍光標識抗体の濃度やリポソーム調製中に使用される脂質色素の濃度など、さまざまな条件を最適化する必要があります。フローサイトメーターは蛍光強度の検出に上限があるため、リポソームに組み込まれた色素が多すぎると、サイトメーターを通過するサンプルのDiDシグナルのレベルが定量化できなくなります。さらに、リポソーム内のDiDが多すぎると、高レベルの非特異的色素移動につながる可能性があり、細胞の取り込み結果が歪む可能性があります。図3は、使用したフローサイトメーターの検出範囲内で最適なシグナルを生成する濃度を特定するために脂質色素の濃度を滴定した実験の結果を報告しています。これは、最終実験の対象組織である血液(図3A)、鼠径脂肪SVF(図3B)、および精巣上体脂肪SVF(図3C)で実施されました。試験用に選択された濃度は、リポソーム1mLあたり10mgのDiD(高、赤)、1mgのDiD(中、青)、または0.1mgのDiD(低、灰色)であった。リポソームに使用された最高濃度は高すぎ、3つの組織すべてでサイトメーターの定量可能範囲を超えました(図3A\u2012C、赤)。DiDの最低濃度は何らかのシグナルを示したが(図3 A\u2012C、灰色)、PBS処理細胞(図3A-u2012C、黒)を超える明確な集団は観察されなかった。定量すると、各組織および濃度のDiD MFIの算術平均は、PBSコントロールとDiDの中間濃度との間の明確な区別を示した(図3D)。したがって、プロトコルに示されているように、リポソーム調製に使用する中間濃度(図3、青色)を選択しました。
多抗体パネルを使用することで、異なる細胞サブセットによるリポソーム取り込みの同定が可能
表3に概説したパネルを用いて、細胞を、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹状細胞、単球、および内皮細胞に対するマーカーに対する抗体で染色した(図4)。組織タイプごとにわずかに異なるゲーティング戦略が必要ですが、同じ細胞タイプのほとんどをそれぞれで識別できます。いくつかの例外には、通常血液中に見られない内皮細胞、および通常他の組織よりも血中で高い頻度にある単球が含まれます。集団が特定されると、各細胞集団の合計サイズとそれらがDiD+である頻度を定量化できます。DiD+集団を特徴付けるために、さらなる計算を実行することができます:DiD+細胞の何パーセントがマクロファージ、内皮細胞などであるか。これらはゲーティング戦略の例ですが、サンプルを分析する唯一の方法ではないことに注意してください。分析は、選択したパネルと利用可能なフローサイトメーターによって決定されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> 図1:調製したリポソームの特性例。 (A)サイズとゼータ電位は上記のように測定され、表形式で報告されています。各パラメータは、平均±標準偏差として表されます。 (B) クライオEMを用いて調製したリポソームを画像化した。白いスケールバーの長さは50nmです。(c)DLSを用いて、この調製におけるリポソームの直径のヒストグラムを生成した。この図はOsinskiら3から改作されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> 図2:PBSまたはリポソーム処理マウスからの代表的なDiD染色。 (A)PBSおよびリポソーム処理の実験概略図。PBSまたはリポソームを1週間かけて3回注射した。組織は治療の8日目に採取された。(B、C)代表的なフロープロットは、リポソーム処理(C)マウスでは陽性のDiD染色を示していますが、PBS処理(B)マウスでは陽性ではありません。FSC、前方散乱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> 図3:リポソーム中のDiDの滴定。 3つの異なる濃度のDiDを用いてリポソームを調製し、マウスに注射した。灰色はリポソーム1 mLあたり0.1 mg DiDの低濃度を示し、青は1 mg DiD/mLリポソームの中間濃度を示し、赤は10 mg DiD/mLリポソームでの高濃度を示す。PBS処理マウスを陰性対照(黒)として用いた。血液(A、円)、鼠径脂肪(B、三角)、および精巣上体脂肪(C、四角)を注射後24時間で採取し、処理して単一細胞懸濁液を単離した。これらのサンプルを、検出可能なDiDのレベルまでフローサイトメーターで実行した。各治療群のオーバーレイを含む組織特異的ヒストグラムを提示して、濃度あたりの蛍光強度(A-u2012C)を示します。DiDの算術平均も組織及び濃度ごとに定量し、プロットした(D)。SSC = 側方散乱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> 図4:脂肪SVF、血液、および脾臓における細胞サブセットの代表的なフローサイトメトリー分析。 (A\u2012C)脂肪SVF(A)、脾臓(B)、および血液(C)中の細胞サブセットおよびDiD+細胞を同定するためのゲーティング戦略の概略表。略語:FSC =前方散乱;LD =生きている/死んでいる。L-DC =リンパ系樹状細胞;M-DC =骨髄性樹状細胞;SSC = 側方散乱。この図はOsinskiら3から改作されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コントロール</td>
			<td>目的</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">PBSまたは生理食塩水で治療したマウス</td>
			<td>このマウスの細胞を以下のフローサイトメトリーコントロールに使用します。</td>
		</tr><tr><td>1. 染色されていない細胞</td>
		</tr><tr><td>2. 生きている/死んだ単一の汚れ</td>
		</tr><tr><td>3. フルパネルで染色されたが、分析中に陽性のリポソームシグナルを決定するためのリポソーム蛍光を欠いている細胞</td>
		</tr><tr><td>これ/これらのマウス/マウスは、実験で非リポソームコントロールがあるため、リポソームがin vivoで効果があるかどうかを判断するためにも使用されます。</td>
		</tr><tr><td>アンロードされたリポソーム</td>
			<td>リポソームに化合物を装填する場合は、リポソームバッチの一部を化合物なしで合成する必要があります。これは、リポソーム単独の任意のインビボ効果を説明する。</td>
		</tr><tr><td>DiD 単独</td>
			<td>DiDは細胞膜にも取り込まれる可能性があるため、一部のマウスにリポソームに見られる量と同じ量の遊離色素を投与するように割り当てると、バックグラウンド膜染色を説明するのに役立ちます。</td>
		</tr><tr><td>蛍光マイナス1(FMO)コントロール</td>
			<td>これらは、パネル内の1つを除くすべての抗体で染色された細胞です。上のボックスの#3と同様に、これは分析中にその抗体の真陽性シグナルを決定するのに役立ちます</td>
		</tr></tbody></table>表 1: このプロトコルで使用するコントロール。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>解決</td>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>バッチ/マウスごとに必要なおおよその量</td>
		</tr><tr><td colspan="3">リポソーム製剤</td>
		</tr><tr><td>酢酸カルシウム</td>
			<td>H2O中の1 M酢酸カルシウム</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスバッファー</td>
			<td>H 2 O、pH7.4中の10 mM HEPES</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスのテサグリタザール</td>
			<td>10 mM ヘペスで</td>
			<td>10ミリリットル</td>
		</tr><tr><td colspan="3">組織の採取、処理、染色</td>
		</tr><tr><td>リン酸緩衝溶液(PBS)</td>
			<td>蒸留H2O中137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mMKH2PO4</td>
			<td>2ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>PBS-ヘパリン</td>
			<td>PBS中の0.1 mMヘパリン</td>
			<td>10ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスバッファー</td>
			<td>PBS中の20 mM HEPES</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>消化バッファー</td>
			<td>2 mg/mL コラゲナーゼ タイプ I (HEPES バッファー中)</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>AKC 溶解バッファー</td>
			<td>0.158 M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na 2 EDTA 中 ddH 2 O, pH7.2</td>
			<td>15ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>FACS バッファ</td>
			<td>PBS中の1%BSA、0.05%NaN3</td>
			<td>15ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>Fcブロック(希釈)</td>
			<td>FACS バッファ内の 1:50 Fc ブロック</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>固定バッファー</td>
			<td>PBS中の2%パラホルムアルデヒド</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>表2:準備するソリューション。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ある</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">細胞外染色(2x抗体ミックス)</td>
		</tr><tr><td>抗原</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>100 μLテストあたりのAb容量</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>パーCP</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>パーCP Cy5.5</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.5 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>F4/80 キー</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.25 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0.25 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1.0 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>等。。。</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>1.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">抗体ミックスを作成するには、カラムDで計算した抗体をFACSバッファーまたはブリリアントバイオレット染色バッファー*と組み合わせて、最終容量(50 μL x 1.2 x 合計#サンプル)にします。</td>
		</tr><tr><td colspan="4">ライブ/デッド染色 (1x)</td>
		</tr><tr><td>ライブ/デッド</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>200 uLテストあたりのL / Dボリューム</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>ライブ/デッド</td>
			<td>アクア</td>
			<td>0.67 μL</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td colspan="4">細胞内染色 (1x)</td>
		</tr><tr><td>抗原</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>50 μLテストあたりのAb容量</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>0.125</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*ブリリアントバイオレット染色バッファーは、ブリリアントバイオレット蛍光色素に結合した複数の抗体をパネルで使用する場合に使用してください。</td>
		</tr></tbody></table>表3:フロー染色に使用する抗体パネルの例と染色ミックスの計算。

このプロトコルの目的は、蛍光標識されたリポソームを合成し、フローサイトメトリーを使用して細胞レベルでリポソームのin vivo局在を同定することです。

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

私たちのプロトコールは、テサグリタザールをロードしたリポソームを調製するためのアクセス可能な方法と、細胞レベルでのリポソームの取り込みを評価するための徹底的なアプローチを組み合わせたものです。この手法は、低温で入手しやすい装置を使用して調製された蛍光標識リポソームの取り込みを評価するための偏りのない方法を提供します。酢酸カルシウムおよびテサグリタザールを充填した蛍光標識リポソームを調製するには、まず、室温、20キロヘルツ、および50%の電力で30秒間の超音波処理により、脂質のエーテルクロロホルム溶液を乳化するために半インチプローブを使用する。均質化された水と油のエマルジョン溶液を、専用のアダプター、ナノメートルゲージ、圧力調整弁を備えたロータリーエバポレーターにすぐに移し、エバポレーターを真空ラインに接続します。有機溶剤を除去するには、回転速度を毎分100回転、真空度を0.5気圧に設定します。ゲルが形成されて消えた後、真空を0.9気圧に増やし、2つの気密シリンジを複数回装備したリポソーム押出機で200ナノメートルのポリカーボネートフィルターを注ぐことでリポソーム水性分散液を前後にろ過します。動的光散乱によってサイズ分布を確認した後、2ミリリットルのスピンカラムを使用して、リポソームから捕捉されていないテサグリタザールを除去し、分光光度計を使用して捕捉された薬物濃度を決定します。次に、500マイクロリットル以下のリポソームサンプルをドライカラムゲルベッドに加えます。眼窩後注射でリポソームを投与するには、露出した目の上下の皮膚を優しく押し下げて、目を顔の平面より上に持ち上げます。次に、針の先端を目の前隅に慎重に挿入し、針が球体に触れないようにオーブの下にあることを確認し、リポソームを眼窩後腔にゆっくりと注入します。血液サンプルを採取するには、適切な実験エンドポイントで、マウスの胸郭の尾側端の端にある皮膚を慎重に切開し、胸筋が露出するまで動物の頭に向かって1センチメートルの直線を切断します。最初の切開部位で、頭に向かって線に垂直に 2 つの小さな切り込みを入れ、露出した領域の胸郭の片側にある胸筋を慎重に切り取ります。第3肋骨と第4肋骨の間に針をできるだけ胸郭の中心線に近づけて挿入し、シリンジをゆっくりと引き上げて採血を開始します。できるだけ多くの量が収集されたら、氷上に10マイクロリットルの0.5モルEDTAが入ったマイクロ遠心チューブに血液を移します。マウスの両側から鼠径部組織後パッドを抽出するには、1セットの鉗子を使用して腹膜を右側に保持し、2セットの鉗子を使用して皮膚の端を腹膜より上に保持します。皮膚をメンブレンからそっと引き離し、層を互いに分離します。皮膚の外縁をピンで留めて、脂肪貯蔵庫にアクセスしやすくし、皮膚に沿って鼠径脂肪組織貯蔵庫を配置します。そして、必要に応じて鉗子とハサミを使用して脂肪貯蔵庫の中央にある鼠径リンパ節を特定し、リンパ節を切除します。リンパ節を切除した後、鉗子を使用して、ピン留めされたポイントに最も近い脂肪貯蔵庫の端を慎重につかみ、脂肪組織と皮膚の間の結合膜に小さな切り込みを入れ始めます。膜へのアクセスを容易にするために切り込みを入れながら脂肪組織を皮膚から持ち上げ、氷上のHEPESバッファーを含むポリエチレンバイアルにデポを置きます。.腹腔の尾側端から精巣上体脂肪デポを抽出するには、鉗子を使用してマウスの背側端から最初の精巣上体脂肪デポを静かに引き抜き、このデポに付着した精巣上体と精管を見つけます。次に、脂肪デポと精巣上体および精管の間を慎重に切断して、脂肪を他の組織から分離し、氷上にHEPESバッファーを入れたポリエチレンバイアルにデポを置きます。すべての組織を採取したら、1〜2組のハサミを使用して、脂肪組織サンプルを0.5ミリメートルの組織片にミンチにします。次に、脂肪組織片のバイアルに1.5ミリリットルの2ミリグラム/ミリリットルのコラゲナーゼ緩衝液を加え、バイアルを摂氏37度、毎分150回転で30〜45分間振とうするインキュベーターに入れます。30分後、1ミリリットルのピペットを使用して、サンプルを数回回転させます。ティッシュピースがまだ大きすぎてピペッティングが簡単な場合は、サンプルをインキュベーターにさらに15分間戻します。サンプルが完全に分解されたら、フラグメントをさらに10回回転させて単一細胞懸濁液が作成され、各サンプルを個別の70マイクロメートルフィルターでサンプルごとに1本の50ミリリットルチューブに濾します。各ファイルを5ミリリットルのFACSバッファーですすいで、残りの細胞を収集し、各洗浄液を氷上の細胞サンプルの適切なバイアルにろ過します。すべてのサンプルをろ過したら、遠心分離により細胞を回収し、サンプルから脂肪細胞上清を吸引します。次に、間質血管画分ペレットをそのままにして上清を慎重に吸引し、チューブあたり1ミリリットルのFACS緩衝液にペレットを再懸濁します。次に、懸濁液を氷上の新しい1.5ミリリットルまたは1.7ミリリットルのチューブに移し、標準プロトコルによるフローサイトメトリー分析を行います。動的光散乱により、平均リポソーム直径は163.2ナノメートル、ゼータ電位はマイナス19.2ミリボルトであることが明らかになりました。極低温電子顕微鏡イメージングでは、動的光散乱によって測定された平均直径から得られる標準偏差が比較的小さい円形リポソームが明らかになります。PBS処理マウスからのサンプルのフローサイトメトリー解析は、DiD蛍光から1つのコントロールを差し引いたものとして使用して、DiDポジティブゲートを作成することができます。この代表的な分析で示されているように、DiDのリポソーム負荷濃度が10ミリグラム/ミリリットルの場合、DiDの負荷濃度は高すぎ、試験した3つの組織すべてにおいてサイトメーターの定量化可能な範囲を超えています。0.1ミリグラム/ミリリットルの濃度は何らかのシグナルを示しますが、PBS処理細胞を超える明確な集団は観察されません。したがって、1ミリグラム/ミリリットルの濃度は、PBSコントロールとの明確な区別を示しながら、分析装置でも読み取り可能であり、リポソーム調製に使用することが推奨されます。組織の種類ごとにわずかに異なるゲーティング戦略が必要ですが、それぞれで同じ細胞タイプのほとんどを同定できます。関心のある特定の集団が特定されると、各細胞集団の合計サイズとそれらがDiD陽性になる頻度を定量化できます。試薬や機器を準備し、各ステップの結果を予測することは非常に重要です。早い段階で予期しない結果が出ると、将来の結果が台無しになる可能性があります。組織学的手法は、組織全体におけるリポソームの局在を評価するために使用でき、イメージングフローサイトメトリーは、細胞ごとにリポソームの内在化を確認するために使用できます。

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蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

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