Name: 胸膜普及のマウスモデルに対する近赤外光免疫療法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 学ぶ近赤外光免疫療法（NIR-PIT）を用いた胸膜播種肺癌マウスモデルでの抗腫瘍効果評価法。バイオルミネセンスイメージングで治療効果をリアルタイムにモニタリングし、抗体・光吸収体複合体の標的性と治療効果を確認する。

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何一つ

すべてのin vivo実験は、名古屋大学動物の世話と使用委員会の実験動物資源のケアと使用のためのガイド(承認#2017-29438、#2018-30096、#2019-31234、#2020-20104)に従って行われました。名古屋大学動物センターで、生後6週間のホモ接合性腺腺ヌードマウスを購入・維持した。マウスで処置を行う場合、イオブルラン(導入:4-5%、メンテナンス2-3%)で麻酔を行った。足は麻酔の深さを確認するためにピンセットで押された。
1. IR700とmAbの結合
<ol><li>インキュベート mAb (1 mg, 6.8 nmol) IR700 NHSエステル (66.8 mg, 34.2 nmol, 5 mmol/L で DMSO) で 0.1 mol/L Na2HPO4 (pH 8.6) で 1 時間 15-25 °C.</li>
	<li>カラム(例えば、セパデックス)を使用して混合物を精製します。準備し、PBSで列を洗います。次に、この混合物をカラムに塗布し、精製されたIR700結合抗体を含むドロップを収集します。このIR700結合抗体は、抗体の増重化コンジュゲート(APC)と呼ばれる。</li>
	<li>APC中のタンパク質およびIR700濃度を測定する。<ol>
<li>分光光度計を用いてタンパク質およびIR700の校正曲線を調製する。</li>
		<li>アルブミンの標準的な濃度を、キットプロトコルに従ってタンパク質アッセイキットと混合します(材料表、クマシーブリリアントブルー(CBB)タンパク質染色を参照)。595 nm波長のアルブミンの吸光度を測定し、y = ax + b (x: 濃度、y: 吸光度) を使用してタンパク質の較正曲線(線形近似式)をプロットします。</li>
		<li>同じ手順で690 nmで吸収したIR700のキャリブレーションカーブを取得します。IR700の標準濃度は0.1-5 μM(0.1954-9.77 μg/mL)で推奨されます。</li>
		<li>APCのタンパク質濃度とIR700濃度を、較正曲線[x=(y-b)/a(x:濃度、y:吸光度)]を使用して測定します。</li>
		<li>モル濃度の結果を持つmAb当たりのIR700染料の数を決定する。 注: mAb分子当たりの IR700 分子の最適な結合数を決定することが重要です。一般に、1つのmAb分子に結合した約3つのIR700分子は、インビトロとインビボの両方に有効であろう。抗体当たり(例えば、6個)に結合したIR700の多くは、インビボ実験中に肝臓に閉じ込められるのが容易になる。IR700に結合した抗体の比率は1:2-1:4の範囲であった。IR700の割合は、必要に応じて減少した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>APCの形成の確認として、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行います。蛍光画像を使用して700nmのゲルを画像化し、キットプロトコルに従うタンパク質染色キットを使用してゲル中のタンパク質を染色します(材料表、CBBタンパク質染色を参照)。</li>
</ol>2.胸膜普及モデルの生成
<ol><li>ルシファーゼ発現標的細胞を調製し、1.0×106個の標的細胞をリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の100μLで一時停止する 注:肺癌やMPMなどの胸部内がん細胞は、標的細胞として適しています。ルシファーゼ発現細胞をルシファーゼ遺伝子トランスフェクションで調製し、10個の細胞通路>後に高いルシファーゼーゼの発現を確認した。細胞は、10%のウシ胎児血清およびペニシリン(100 IU/mL)およびストレプトマイシン(100mg/mL)を添加した培地で培養した。細胞数は、腫瘍の増殖速度および治療の時間経過(1.0.×10 5-6.0×106細胞/体重)に従って調整した。</li>
	<li>8-12週齢の雌のホモ接合性腺性ヌードマウスを調製し、好ましい体重は19〜21gである。</li>
	<li>イオブルラン(導入:4-5%、メンテナンス2-3%)で処置中にマウスを麻酔する。反応がないことを確認するためにピンセットで尾を押してください。</li>
	<li>ポリスチレンフォームでストッパーを作り、先端が肺の損傷を防ぐために5 mmに残るように30 G針にストッパーを取り付けます。きれいな鉗子で針先を曲げるか、気胸を避けるために70%EtOHで洗浄された硬い物体に押し付けることによって(図1)。 注意:自分を突き刺さないように注意してください。針を曲げるために鉗子を使用してください。針にストッパーを取り付ける際は、止めを持ち込まないでください。細胞を注射器に充填する前にストッパーを付ける方が安全です。</li>
	<li>注射器(1mL)をターゲット細胞で満たし、30Gの針にストッパーを取り付けます。</li>
	<li>処置の前に70%のEtOHで動物の胸部を消毒する。</li>
	<li>肋間腔を通して、針をマウスの胸に突き刺します。その時の肋骨に当たって抵抗が起き、針先が上下に動いた。肋間空間を通過した後、マウスに対して注射器を押し付け、100 μLの標的細胞を注入する(図2)。 メモ:針が胸腔に正しく入ると、マウスは深く呼吸します。針先の曲がりにより、気胸や肺への細胞の不適切な注入を避けることができる。 注意:右胸壁穿刺は、心臓壁穿刺のリスクを回避するために推奨されます。</li>
	<li>マウスを2~3回ロールし、胸腔全体に細胞を広げます。</li>
	<li>マウスを清潔で暖かいケージに戻し、外来まで監視します。処置後、マウスは麻酔から目を覚まし、正常に動作します。</li>
</ol>3.生物発光の測定
メモ: データ収集に使用するソフトウェアは、資料一覧に記載されています。
<ol><li>胸膜普及モデルの生成を確認するために、細胞を胸腔に注入した後、毎日生物発光画像を評価する。</li>
	<li>マウスを麻酔し(ステップ2.3)、D-ルシフェリン(15mg/mL、200 μL)で腹腔内注射する。</li>
	<li>マウスが画像撮影の前後に正常に呼吸していることを確認します。麻酔中の低体温症を防ぐために必要に応じてヒーターを使用してください。</li>
	<li>注射後10分、マウスを生物発光イメージング(BLI)測定装置にセットする。画像取得の場合は、ソフトウェアの取得コントロールパネルを開きます。[ルミネセント]、[写真]、および[オーバーレイ] (図 3)を選択します。</li>
	<li>露出時間を自動に設定します。ビニングを小さく設定します。</li>
	<li>f/ストップは、発光の場合は1、写真には8に設定します。f/stop は、充電された結合デバイス検出器が受け取る光の量を制御します。</li>
	<li>[ビューのフィールド] を[C]に設定します。</li>
	<li>マウスサンプルのイメージングの準備ができたら、[取得]をクリックしてイメージングを取得します。十分なルシファーゼ活性を有するマウスは、さらなる研究のために選択された。 注:適切な胸膜普及モデルは、腹側から見ると胸部の拡散部位に強い発光を示す。BLI画像が胸郭で拡散せず、注射部位でのみ拡散する場合、腫瘍は皮下に移植される可能性がある。</li>
	<li>画像を表示した後、表示形式を「輝度」に設定します。ツールパレットパネル(図4A)を開きます。</li>
	<li>[ROI ツール] を選択します。画像上の生物発光領域の範囲を指定するには、Circleを使用することをお勧めします。</li>
	<li>[ROI を測定]をクリックして、表面の生物発光強度を測定します(図4B)。</li>
	<li>ROI 測定パネルの左隅にある[測定を設定]を使用して、必要な値/情報を選択します。このデータ テーブルを.csv ファイルとしてエクスポートします (図 4C)。</li>
	<li>.csv ファイルでの生物発光強度の定量として、総磁束 (p/s) の値を使用します。</li>
</ol>4.拡散発光イメージング断層撮影(DLIT)
メモ: データ収集に使用するソフトウェアは、資料一覧に記載されています。
<ol><li>X線の武装ボタンをオンにします。</li>
	<li>マウスを麻酔し(ステップ2.3)、D-ルシフェリン(15mg/mL、200 μL)をマウスに腹腔内注入します。DLIT を 3.2 から 3.7 まで連続的に撮影するには、この手順をスキップします。</li>
	<li>射出後10分、BLI装置にマウスをセットします。</li>
	<li>ソフトウェアの取得コントロールパネルを開きます。[ルミネセント]、[写真]、[CT]、[スタンダードワンマウス]、[オーバーレイ]を選択します。その他の設定は、3.4-3.6 と同じでした (図 5A)。</li>
	<li>取得コントロール パネルの[イメージング ウィザード] を選択します。</li>
	<li>[生物発光]を選択し、DLITを選択します(図5B)。</li>
	<li>測定する波長としてホタルを選択します (図5C)。</li>
	<li>[イメージング対象] を[マウス] に設定し、露出パラメータを自動設定、視野をC-13.4 cmに設定し、件名の高さを1.5 cmに設定します (図5D)。</li>
	<li>X線を押すと通電します。を取得します。</li>
	<li>CTの順次画像データを開きます。</li>
	<li>ツール パレットでサーフェス の地形を開きます。[表示] (図 6A) を選択します。</li>
	<li>紫色の表示がボディサーフェスのみを表示するので、しきい値を調整します(図6B)。次に、件名のヌード マウスを選択し、サーフェスの生成をクリックします。マウスの輪郭が正確に描画されていることを確認します(図6C)。</li>
	<li>ツールパレット、DLIT 3D 再構築プロパティタブを開きます。 次に、[解析]タブを開き、選択した各波長データのデータを確認します。最後に、[再構築] ボタンをクリックします (図 6E)。</li>
	<li>設定された DLIT イメージの胸腔内に BLI が存在するかどうか確認します。</li>
</ol>5. 生体内胸膜普及モデル用NIR-PIT
<ol><li>パワーメーターで690 nm波長(NIR)レーザーの光量を測定し、出力を100 mW/cm2に調整します。 注:レーザー光は正確なコイルサイズと一貫性があります。したがって、光エネルギーは50cm以内の距離に関係なくほとんど変化しない。火傷など、有害事象が多い場合は、出力を 40 mW/cm2の範囲内で減らします。</li>
	<li>70%のEtOHで尾部をきれいにし、NIR照射の前に24時間尾静脈を介してAPC(100 μg)を静脈内に注入する。注射部位に圧力をかけて出血をコントロールする。 メモ:射出用にAPCのボリュームを50~200μLに調整します。</li>
	<li>マウスを麻酔し(ステップ2.3)、仰向けに置きます。非標的部位へのNIR照射を避けるために、他の部位をアルミ箔で遮蔽する(図7A)。100 J/cm2のレーザーでNIR光を照射;腫瘍が腹に戻って播種されれば、NIR光照射線量は複数方向に分けられる(図7B)。 注:インビトロの結果や火傷などの有害事象に応じて、30-150 J /cm2で用量を調整してください。</li>
	<li>NIRの照射が完了し、マウスが目を覚ますと、ケージに戻します。</li>
	<li>BLIを観察し、時間の経過とともにROIを測定します(3.2-3.12参照)。</li>
	<li>エキビボイメージングの場合、APC注入後24時間、NIR照射の直前に、二酸化炭素を有するマウスを安楽死させる。<ol>
<li>マウスの胸の内側を観察するには、胸郭を取り除き、肋骨と胸骨を切断します。APC投与なしでコントロールと一緒に蛍光画像(700 nm)をキャプチャします。その後、露出した胸郭にD-ルシフェリン(150 μg/mL)を塗布し、BLIを取り出します(3.2-3.7参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

本研究では、MPMの胸膜普及モデルに対するNIR-PITの治療効果を測定する方法を実証した。非常に選択的な細胞の殺しはNIR-PITで行われた;したがって、正常組織はほとんど損傷を受けていなかった23,24,25.この種の選択的細胞殺死により、NIR-PITは普及したモデル9,26において安全であることが実証された。ただし、いくつかの手順で別の方法が可能です。胸膜普及モデル27,28,29,30に対して種々の方法が報告されている。...

がんは、何十年もの研究にもかかわらず、死亡率の主要な原因の1つです。その理由の一つは、放射線療法と化学療法が非常に侵襲的な技術であり、治療上の利点を制限する可能性があるということです。侵襲性の低い技術である細胞または分子標的療法は注目を集めています。光線免疫療法は、免疫療法と光線療法を組み合わせることで、治療効果を相乗的に高める治療法です。免疫療法は、腫瘍微小環境の免疫原性を高め、免疫調節抑制を低減することによって腫瘍免疫を高め、体内の腫瘍の破壊をもたらす。光線療法は、光増感剤と光線の組み合わせで原発性腫瘍を破壊し、腫瘍細胞から放出される腫瘍特異的抗原は腫瘍免疫を増強する。腫瘍は、標的細胞に特異的かつ選択的であるほど、感知剤を用いて選択的に治療することができる。光線療法のモダリティには、光力学療法(PDT)、光熱療法(PTT)、光化学ベースの治療法1が含まれる。
近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、光化学系療法と免疫療法1,2を組み合わせた最近開発された抗腫瘍光線療法の方法である。NIR-PITは、近赤外シリコンフタロシアニン色素IRdye 700DX(IR700)をモノクローナル抗体(mAb)に結合させることにより、特定の細胞表面分子を標的とする分子標的療法です。標的細胞の細胞膜は、NIR光(690nm)3で照射すると破壊される。
従来の光化素子と抗体または標的PDTを組み合わせることによって標的光療法を使用するという概念は、30年以上前の4,5です。これまでの研究では、それらを抗体に結合させることによって、従来のPDT剤を標的にすることを試みてきた。しかし、これらのコンジュゲートは、フォトエンサイザー6、7の疎水性のために肝臓に閉じ込められたため、限られた成功がありました。また、NIR-PITのメカニズムは、従来のPDTとは全く異なります。従来の光化剤は、光エネルギーを吸収し、励起状態に脱臼し、地盤状態に移行し、アポトーシスを引き起こすエネルギー変換から生じる酸化ストレスを生成します。しかし、NIR-PITは光化学反応8を通じて膜上の光増感剤を凝集させることによって細胞膜を直接破壊することによって急速な壊死を引き起こす。NIR-PITは、多くの点で従来のターゲットPDTよりも優れています。従来の光増感剤は、低い消光係数を有し、単一の抗体分子に多数の光増感剤を付着させる必要があり、結合親和性を低下させる可能性がある。ほとんどの従来の感知剤は疎水性であり、免疫反応性や生体内標的蓄積を損なうことなく、抗体に対して感知剤を結合することは困難です。従来の光化剤は、通常、可視範囲で光を吸収し、組織の浸透を減少させる。
肺がんや悪性胸膜中皮腫(MPM)細胞などの胸部腫瘍を標的とするNIR-PITに関するいくつかの研究が報告されている9,10,11,12,13,14,15,16,17.しかし、胸膜普及MPMまたは肺癌モデル9、10、11、12におけるNIR-PITの有効性を説明した報告はごくわずかである。皮下腫瘍異種移植モデルは、標準的な腫瘍モデルであると考えられるが、現在、新しい治療法18の抗腫瘍効果を評価するために広く使用されている。しかしながら、皮下腫瘍微小環境は、真悪性表現型19、20、21、22を適切に再現する適切な組織構造や状態の発達に対して寛容ではない。理想的には、直交性疾患モデルは、抗腫瘍効果のより正確な評価のために確立されるべきである。
ここでは、NIR-PITを用いて治療した胸膜播種肺癌のマウスモデルにおける有効性評価の方法を示す。胸膜流布マウスモデルは、胸腔に腫瘍細胞を注入することによって生成され、ルシファーゼ発光を用いて確認される。マウスを、胸部へのIR700およびNIR照射と共役したmAbの静脈内注射で治療した。治療効果を、ルシファーゼ発光を用いて評価した。

<table><tbody><tr><td>0.25w/v% トリプシン-1mmol/l EDTA 4Na フェノールレッド</td><td>和光</td><td>209-016941</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>1mLシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-01T</td><td>マウス実験用</td></tr><tr><td>30G ニードル</td><td>ニプロ</td><td>1907613</td><td>マウス実験用</td></tr><tr><td>BALB/cSlc-nu/nu</td><td>日本 SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td>用ゲルタンパク質染色用</td></tr><tr><td>Coomassie (bradford) Plus protein assay</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td>APC 濃度を測定するため</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td>IR700</td></tr><tr><td>D-Luciferin (カリウム塩)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14681</td> 生物<td>発光イメージングおよび DLIT</td></tr><tr><td>GraphPad Prism7</td> <td>の結合に使用統計解析用GraphPadソフトウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>700nm蛍光画像解析用</td></tr><tr><td>IRDye 700DX Ester Infrared Dye</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Wako</td><td>095-06573</td><td>for mice anesthesia</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>for capturing生物発光画像とDLIT</td></tr><tr><td>リビングイメージ</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>生物発光画像とDLIT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH(ミズーリ州セントルイス、ミズーリ州、米国)</td><td>S9763</td><td>IR700</td></tr><tr><td>NIR</td><td>レーザーChangchun New Industriesの結合のための使用 Optoelectronics Technology</td><td>MRL-III-690R</td><td>NIR照射用</td></tr><tr><td>Novex WedgeWell 4〜20%、Tris-Glycine、1.0 mm、ミニタンパク質ゲル、12ウェル</td><td>Invitrogen</td><td>XP04202BOX</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS サンプルバッファー (x4)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>光パワーメーター</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td> に <td>NIR レーザーの出力を測定するための使用&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>和光</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>パールトリロジーイメージングシステム</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>700 nm フルオレフィカル画像をキャプチャ</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (x100)</td><td>和光</td><td>168-23191</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>ピュロマイシン二塩酸塩</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>ルシフェラーゼトランスフェクション</td></tr>用 <tr><td>RediFect Red-Fluc-Puromycin レンチウイルスPrticles</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS960002</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Sephadex G25 column (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)</td><td>17-0851-01</td><td>IR700</td></tr><tr><td>UV-1900i</td><td>島津</td><td></td>製作所の<td>APC濃度測定用</td></tr>標識用</tbody></table>

胸膜普及のマウスモデルに対する近赤外光免疫療法

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

光線免疫療法の有効性は、皮下マウスモデルよりも正交性マウスモデルでより正確に評価することができる。胸膜普及モデルは、肺がんや悪性胸膜中皮腫などの胸部内疾患の治療方法の評価に使用できます。
近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、NIR光への曝露後に光吸収体(IR700Dye)によって引き起こされる毒性と腫瘍標的性抗体の特異性を組み合わせた、最近開発されたがん治療戦略です。NIR-PITの有効性は、様々な抗体を使用して報告されています;しかし、この戦略の治療効果を正交性モデルで示した報告はごくわずかである。本研究では、NIR-PITを用いて治療した胸膜播種肺癌モデルの有効性評価の例を示す。

抗ポドプラニン抗体NZ-1をIR700と共役にして、NZ-1-IR700を生成した。SDS-PAGEでNZ-1とIR700の結合を確認した(図8)。ルシファーゼ発現H2373(H2373-luc)は、ルシファーゼ遺伝子10で悪性中皮腫細胞(H2373)をトランスフェクトすることにより調製した。
生後8~12週齢の雌ホモ接合性腺腺ヌードマウスを麻酔し、1×105 H2373-luc細胞を胸腔に注入した。マウスへの腫瘍細胞の注射の日は1日目と示された。
4日目に、BLIおよびDLITを、D-ルシフェリン(15mg/mL、200 μL)を腹腔内に注射した後に行い、胸腔内で十分なルシメラーゼ活性を有するマウスを更なる研究のために選択した(図9)。NZ-1-IR700(100 μL)の百マイクログラムを、尾静脈を介して静脈内注射した...

近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、抗体光吸収体(IR700Dye)とNIR光を利用してがん細胞を破壊する新たながん治療戦略です。ここでは、生物発光イメージングを用いた胸膜播種肺癌および悪性胸膜中皮腫のマウスモデルにおけるNIR-PITの抗腫瘍効果を評価する方法を提示する。

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...

この方法は、臨床的に関連する腫瘍モデルにおける胸部腫瘍に対するNIR-PITの治療効果を評価するために使用することができる。胸膜播種癌モデルを用いたNIR-PITの処置は理解し、実行しやすい。マウスの普及モデルを設定するには、ポリスチレンフォームを使用してストッパーを作り、70%エタノールで消毒します。針をストッパーに取り付け、先端を栓から5ミリメートル伸ばします。清潔な鉗子で、または70%エタノールで洗浄された硬い物に対して30ゲージの針の先端を曲げ、PBSの100マイクロリットルの6つの標的腫瘍細胞に1回10で注射器を充填する。麻酔でペダル反射への応答の欠如を確認します, 19〜 21グラム, 8〜12週齢, 女性, ホモ接合, 高胸腺ヌードマウス.肋間空間を通して針を胸に挿入し、肋骨に接触しないように針を上下に動かします。先端が肋間空間を通過したら、マウスに押し付けられてターゲットセルの全容を注入するようにシリンジを置きます。注射後、マウスを2~3回ロールして胸腔全体に細胞を広げ、完全に回復するまでモニタリングしてマウスをケージに戻します。細胞注射の24時間後及びその後毎日、麻酔化された腫瘍細胞注入マウスに、D-ルシフェリン1ミリリットル当たり15ミリグラムの200マイクロリットルを注入する。10 分後、マウスを生物発光イメージャーに入れ、取得コントロールパネルをイメージャーソフトウェアで開きます。[ルミネセント]、[写真]、[オーバーレイ]を選択します。[露出時間] を [自動]、[ビニング] を [小] に、[F/ストップ] を [ルミネセント] に 1、写真用に 8 回に設定し、[C. ビューのフィールド] をクリックして生物発光を画像化します。表示形式をラジアンに設定し、[ツール パレット]パネルの[対象ツールの領域]から円を選択します。[対象領域を測定]をクリックしてサーフェスの生物発光強度を測定し、[測定を設定]を使用して実験に関連する値を選択します。このデータ テーブルを csv ファイルとしてエクスポートします。次に、ファイル内の生物発光強度定量の合計フラックス値を使用します。腫瘍注入マウスの近赤外光線療法を行う前に、パワーメーターを使用して690ナノメートル波長レーザーの光量を測定し、出力を平方センチメートルあたり100ミリワットに調整します。治療の24時間前に、腫瘍注入動物の尾静脈を介してPBSの50〜200マイクロリットルに100マイクログラムの抗体光化剤を静脈内注射する。光線療法の日に、麻酔付き共役剤を注入した腫瘍を含むマウスを、スピーニン位置に置き、非標的部位をアルミニウム箔で遮蔽する。すべてのシールドを配置したら、100ジュール/平方センチメートルのレーザーを使用して、胸腔に近赤外光を約30秒間照射します。照射が完了し、マウスが目覚めると、動物をケージに戻し、実証したように毎日生物発光を測定する。本代表分析では、IR700による抗ポドプラニン抗体の結合がSDS-PAGE分析により確認された。腫瘍細胞注射後、生物発光イメージングおよびびまん性発光イメージング断層撮影を行い、胸腔内で十分なルシメラーゼ活性を発現するマウスを決定して、さらなる研究を行う必要があります。注射後5日目に、抗ポドプラニン抗体IR700注射マウスは、胸部腫瘍における高いIR700蛍光およびルシメラーゼ活性を示し、IR700結合体抗体が播種された胸膜腫瘍部位に到達することを示す。特に、近赤外光線免疫療法で治療された胸膜拡散マウスはルシファーゼ活性の低下を示し、対照群の相対光単位は徐々に強度の増加を示す。必要なNIR照射エネルギーは細胞系や抗体に依存するため、事前にインビトロで条件を確認してください。

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Medicine

医学

光線力学療法(PDT)は、肺がん治療のための非侵襲的かつ非外科的な方法です。光増感剤は腫瘍組織に選択的に蓄積し、酸素と適切な波長の光の存在下で腫瘍細胞死を引き起こします。このビデオでは、担腫瘍マウスにナノ粒子を含む光増感剤を用いたin...

PDTのin vivo抗腫瘍効果分析:担がんマウスにおける光増感剤の光毒性能を決定する技術

このビデオでは、免疫不全マウスの胸腔に肺がん細胞懸濁液を注入することにより、胸膜播種のマウスモデルを生成する方法を示します。...

胸膜播種性肺癌のマウスモデルの確立

このビデオは、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を示す改変マウスモデルで肺がんを治療するための近赤外線光免疫療法技術を示しています。腫瘍細胞上の特定の抗原に結合する抗体-光増感剤コンジュゲート(APC)をマウスに注入すると、マウスは近赤外線に曝露され、APCに光化学変化が誘導され、結合した腫瘍細胞の壊死につながります。治療の有効性は、ルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを注入し、腫瘍の成長と相関する生物発光を経時的に測定することによって監視されます。...

マウスモデルにおける肺癌治療のための近赤外光免疫療法技術

このビデオでは、近赤外光免疫療法により混合3D細胞培養から特定の細胞を選択的に除去する技術を紹介しています。この方法では、NIR光吸収剤と結合した抗体を用いて、標的細胞を正確に同定します。その後の赤外光の照射により細胞死が誘導され、標的細胞が3D培養から効果的に排除されます。...

混合3D培養における標的細胞排除のための近赤外光免疫療法

特定の細胞を他の細胞を傷つけずに除去することは、特に確立された組織において非常に困難ですが、組織工学の分野では細胞除去法が緊急に必要とされています。ここでは、近赤外光免疫療法(NIR-PIT)を用いて、混合3D細胞培養から特定の細胞を除去する方法を紹介します。...

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

多能性幹細胞由来の奇形の治療戦略に関する研究は、幹細胞治療の臨床翻訳にとって重要です。ここでは、まず、マウスや、その後、選択的にターゲットに幹細胞由来の奇形を生成し、小動物照射を用いた生体内でのこれらの腫瘍を扱うのためのプロトコルについて述べる。...

小動物モデルにおける外部ビーム放射線を用いた多能性幹細胞由来の奇形の対象となる、選択的な治療

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光制御された生物学的に活性な化合物のin vitroおよびin vivo評価-癌光薬理学の潜在的な薬剤候補

肺転移の選択的光変換のための外科的プロトコルを含む肺転移からの腫瘍細胞の再分配を研究する方法を提示し、続いて第三次臓器における再播種性腫瘍細胞の同定を行います。...

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腫瘍内金ナノロッドによる近赤外光の光熱変換によるマウス腫瘍モデルにおける標的軽度温熱療法の誘導

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胸膜普及のマウスモデルに対する近赤外光免疫療法

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