血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築
2020年9月11日
ここでは、自然にDNAを獲得する能力を利用して遺伝子改変できる 肺炎球 菌血清型1株519/43と自殺プラスミドについて述べる。原理の証明として、ニューモリシン(プライ)遺伝子の同質変異体が作られました。
このプロトコルは、以前は扱い難い血清型の遺伝子改変を可能にし、血清型を研究し理解することを可能にするため、重要です。これにより、ワクチン開発などの生物学的研究への道が開かれます。この手順を実演するのは、ロンドン大学衛生熱帯医学大学院の助教授であるVanessa S.Terra
氏です。プラスミドpSD1の生成を開始するには、pGEM-T Easy System Iのメーカーの指示に従ってライゲーションを行います。反応を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、化学的に有能な大腸菌Dh5-αをpSD1で形質転換し、50マイクロリットルの細胞と3マイクロリットルのpSD1ライゲーション反応を氷上で15分間インキュベートし、次に細胞を熱ショックにさらし、細胞を氷上に2分間置きます。
細胞を氷から取り出し、350マイクロリットルのSOC培地を加え、37°C、120RPMで2時間培養物をインキュベートします。0.4ミリモルのIPTG、青白の選択のために0.24ミリグラム/ミリリットルのX-Gal、および100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを添加したLuria-Bertani寒天で形質転換をプレート化し、プレート上で成長するすべてのコロニーがプラスミド骨格を持つようにします。pSD1を含む3つの白いコロニーを選び、10ミリリットルのL-Bに100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを補給して一晩で成長させます。
培養物を振とうしながら摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、培養物を3, 082 Gで遠心分離し、ペレットをプラスミド抽出に使用します。プラスミドDNAを抽出した後、pSD1プラスミドとスペクチノマイシンカセットの両方に対してBamH1制限酵素をセットします。
制限酵素消化反応およびコントロールを摂氏37度で3時間インキュベートします。制限が終了したら、電気泳動で製品を分析し、正しいバンドを切り取り、市販のキットを使用して精製します。次に、BamH1消化されたpSD1とスペクチノマイシンを用いてライゲーション反応を行います。
これにより、プラスミドpSD2が生成されます。前述のように、pSD2を化学的にコンピテントな大腸菌DH5-αに変換します。次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムのスペクチノマイシンとアンピシリンを添加したLBAで増殖する能力に基づいて、プラスミドpSD2を保有する形質転換体を選択し、プラスミドDNAを抽出します。
S.pneumoniae 519/43をBHIで一晩培養し、摂氏37度と二酸化炭素5%で静的に成長させます。翌日、培養物を10ミリリットルの新鮮なBHIブロスで1:50と1:100に希釈します。595ナノメートルのODが0.05〜0.1になるまで、37°Cで培養物を静的にインキュベートします。
適切なODに達したら、860マイクロリットルの培養物を取り、それを微量遠心チューブに移します。100マイクロリットルの100ミリモル水酸化ナトリウム、10マイクロリットルの20%BSA、10マイクロリットルの100ミリモル塩化カルシウム、2マイクロリットル/ミリリットルのCSP1および500ナノグラムのpSD2を追加します。反応を37°Cで静的に3時間インキュベートします。
次に、330マイクロリットルを5%血液寒天培地プレートにプレートし、1ミリリットルあたり100マイクログラムのスペクチノマイシンを3時間のインキュベーション期間にわたって1時間ごとに補充します。次に、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。スペクチノマイシン耐性コロニーを、100マイクログラム/ミリリットルのスペクチノマイシンを補充した別の血液寒天プレートに、および100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを補充した血液寒天プレートにパッチを当てます。これは、プラスミド骨格の存在をテストします。
両方のプレートセットを一晩インキュベートします。制限酵素消化により、pSD2の正しい組み立てを確認しました。次に、pSD2を使用して519.43の野生型細胞を形質転換しました。
一晩のインキュベーション後にスペクチノマイシンで成長したコロニーは、ポジティブな形質転換体と見なされました。ニューモリジン変異の表現型確認は、D39、519/43野生型、および変異型519/43デルタプライの溶血活性を評価することによって行われました。これは、100%と考えられている0.5%サポニンによる赤血球の溶血と比較されました突然変異体は赤血球を溶解する能力を失いました。
すべての陽性コロニーは、挿入の位置を評価するためのシーケンシングによってさらに確認されました。相同性領域の外側に結合部位を持つプライマーを使用しました。形質転換反応を行う際には、試薬を正しい順序で添加することが重要です。
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概要
本記事では、DNAを取り込む天然の能力を利用して、S. pneumoniae 血清型 1 株 519/43 を遺伝的に改変する方法を提示します。本研究では、ニューモリシン（ply）遺伝子の同系変異体の作製を実証しており、今後のさらなる研究への道を開くものです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 遺伝子工学
- 病原体研究
背景
- Streptococcus pneumoniaeは、ヒトの重要な病原体です。
- この血清型の遺伝子改変は困難とされてきました。
- その遺伝学を理解することは、ワクチンの開発に寄与します。
- 本研究では、遺伝子操作に対する新しいアプローチを提示します。
研究の目的
- S. pneumoniae 血清型1の遺伝子改変を可能にする。
- 研究目的の変異株を作製する。
- ニューモリシンおよびその病原性における役割に関する研究を促進する。
使用方法
- pGEM-T Easy System Iを用いたプラスミドpSD1の作製。
- ライゲーション反応液を用いたE. coli Dh5-alphaへの形質転換。
- コンピテントセルのインキュベーションおよびヒートショックの手順。
- 標準的な分子生物学的手法による遺伝子改変の確認。
主要な結果
- ply遺伝子におけるアイソジェニック変異株の作製に成功したこと。
- 遺伝子改変における本プロトコルの有効性を実証したこと。
- ワクチン研究および開発への潜在的な影響。
- S. pneumoniae研究のための新しいモデルを確立したこと。
結論
- この手法により、これまで困難であったセロタイプの遺伝学的操作が可能になります。
- これにより、生物学的研究の新たな道が開かれます。
- 今後の研究において、この技術をワクチン開発に活用することができます。
よくあるご質問
産業界における重要性
肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）セロタイプ1の遺伝子改変は、感染症研究、特に疾病負荷の高い地域におけるワクチンおよび治療標的の検証において、長年の障壁となってきました。本プロトコルは、臨床的に重要な菌株での機能ゲノミクスを可能にし、ニューモリシンなどの毒性因子のメカニズム的なリスク低減をサポートします。信頼性の高い変異導入システムを確立することで、標的選択における予測精度が向上し、前臨床評価のパイプラインが加速されます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：臨床的に関連のある血清型において、アイソジェニックな変異株を作製することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：plyなどの毒性遺伝子の機能的検証のための、再現性のあるシステムを提供する。
- 戦略的価値：感染モデルにおける遺伝型と表現型を関連付けることで、標的のリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：溶血試験や感染モデルを含む標準化された表現型解析のために、定義された変異株を作製する。
- 運用上の価値：アッセイの再現性に不可欠なアイソジェニックコントロールを作製するためのワークフローを確立する。
- 戦略的価値：選択マーカーとカウンターセレクションを用いて、遺伝的変異体のスケールアップ可能なスクリーニングを可能にする。
翻訳・前臨床研究
- 科学的価値：腹腔内および経鼻投与チャレンジモデルを用いて、生体内で表現型と遺伝型の相関を容易にする。
- 運用的価値：下流の有効性および安全性試験のための、バリデートされた変異株ストックを構築する。
- 戦略的価値：セロタイプ特異的な病原性メカニズムを明らかにすることで、Go/No-Go判断に情報を提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法はディスカバリーバイオロジーのフェーズに該当し、リード化合物同定に向けた取り組みに先立ち、遺伝子操作によるターゲットバリデーションを可能にします。
- 探索生物学： 仮説に基づいた遺伝子ノックアウトを行い、病原性におけるパスウェイの関与を明らかにする。
- スクリーニング： 細胞ベースおよび動物モデルにおける比較表現型スクリーニングのため、同遺伝子性の変異体パネルを構築する。
- 分析： 溶血活性や組織内の細菌負荷などの従属変数の定量的な測定を可能にする。
- トランスレーショナルリサーチ： 血清型間の感染表現型を比較することにより、分子レベルの知見を前臨床結果へと結びつける。
- 企業の再利用： 他のワクチン候補抗原にも適用可能な、連続的な変異導入のためのプラットフォームを確立する。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 血清型特異的な病原性におけるメカニズムの曖昧さを軽減し、ターゲット検証の信頼性を向上させます。
- 運用の価値： S. pneumoniaeにおいて、定義された遺伝子変異体を作製するための標準化され、再現性のある手法を提供します。
- 戦略的価値： ターゲットの必須性と病原性への寄与を早期に評価することを可能にし、ポートフォリオの優先順位付けを改善します。
- ポートフォリオへの影響： 多額の費用を伴う前臨床投資の前に、病原性因子に関する機能的データを提供することで、リスクを調整した開発の推進をサポートします。
実施上の検討事項
- 分子クローニング、細菌形質転換、および対立遺伝子交換技術の専門知識が必要です。
- E. coliおよびS. pneumoniae用のエレクトロポレーションまたは化学形質転換システムを利用できる必要があります。
- プラスミドの完全性を確保するため、DNA調製、制限酵素消化、およびライゲーションの標準化されたプロトコルが必要です。
- 病原性S. pneumoniae株を取り扱うため、バイオセーフティーレベル2の封じ込め施設が必要です。
- 成功は、CSP1濃度や塩化カルシウム濃度を含むコンピテント細胞誘導条件の最適化に依存します。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Generation of Plasmid pSD1 and Chemical Transformation of E. coli Dh5α
2:03
Plasmid DNA Extraction, Restriction Digestion of pSD1 and Spectinomycin Gene, and Assembly of pSD2
3:03
Transformation of S. pneumoniae Strain 519/43
4:46
Results: Confirmation of Mutagenesis
5:43
Conclusion
