September 11th, 2020
ここでは、自然にDNAを獲得する能力を利用して遺伝子改変できる 肺炎球 菌血清型1株519/43と自殺プラスミドについて述べる。原理の証明として、ニューモリシン(プライ)遺伝子の同質変異体が作られました。
このプロトコルは、以前は扱い難い血清型の遺伝子改変を可能にし、血清型を研究し理解することを可能にするため、重要です。これにより、ワクチン開発などの生物学的研究への道が開かれます。この手順を実演するのは、ロンドン大学衛生熱帯医学大学院の助教授であるVanessa S.Terra
氏です。プラスミドpSD1の生成を開始するには、pGEM-T Easy System Iのメーカーの指示に従ってライゲーションを行います。反応を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、化学的に有能な大腸菌Dh5-αをpSD1で形質転換し、50マイクロリットルの細胞と3マイクロリットルのpSD1ライゲーション反応を氷上で15分間インキュベートし、次に細胞を熱ショックにさらし、細胞を氷上に2分間置きます。
細胞を氷から取り出し、350マイクロリットルのSOC培地を加え、37°C、120RPMで2時間培養物をインキュベートします。0.4ミリモルのIPTG、青白の選択のために0.24ミリグラム/ミリリットルのX-Gal、および100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを添加したLuria-Bertani寒天で形質転換をプレート化し、プレート上で成長するすべてのコロニーがプラスミド骨格を持つようにします。pSD1を含む3つの白いコロニーを選び、10ミリリットルのL-Bに100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを補給して一晩で成長させます。
培養物を振とうしながら摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、培養物を3, 082 Gで遠心分離し、ペレットをプラスミド抽出に使用します。プラスミドDNAを抽出した後、pSD1プラスミドとスペクチノマイシンカセットの両方に対してBamH1制限酵素をセットします。
制限酵素消化反応およびコントロールを摂氏37度で3時間インキュベートします。制限が終了したら、電気泳動で製品を分析し、正しいバンドを切り取り、市販のキットを使用して精製します。次に、BamH1消化されたpSD1とスペクチノマイシンを用いてライゲーション反応を行います。
これにより、プラスミドpSD2が生成されます。前述のように、pSD2を化学的にコンピテントな大腸菌DH5-αに変換します。次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムのスペクチノマイシンとアンピシリンを添加したLBAで増殖する能力に基づいて、プラスミドpSD2を保有する形質転換体を選択し、プラスミドDNAを抽出します。
S.pneumoniae 519/43をBHIで一晩培養し、摂氏37度と二酸化炭素5%で静的に成長させます。翌日、培養物を10ミリリットルの新鮮なBHIブロスで1:50と1:100に希釈します。595ナノメートルのODが0.05〜0.1になるまで、37°Cで培養物を静的にインキュベートします。
適切なODに達したら、860マイクロリットルの培養物を取り、それを微量遠心チューブに移します。100マイクロリットルの100ミリモル水酸化ナトリウム、10マイクロリットルの20%BSA、10マイクロリットルの100ミリモル塩化カルシウム、2マイクロリットル/ミリリットルのCSP1および500ナノグラムのpSD2を追加します。反応を37°Cで静的に3時間インキュベートします。
次に、330マイクロリットルを5%血液寒天培地プレートにプレートし、1ミリリットルあたり100マイクログラムのスペクチノマイシンを3時間のインキュベーション期間にわたって1時間ごとに補充します。次に、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。スペクチノマイシン耐性コロニーを、100マイクログラム/ミリリットルのスペクチノマイシンを補充した別の血液寒天プレートに、および100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを補充した血液寒天プレートにパッチを当てます。これは、プラスミド骨格の存在をテストします。
両方のプレートセットを一晩インキュベートします。制限酵素消化により、pSD2の正しい組み立てを確認しました。次に、pSD2を使用して519.43の野生型細胞を形質転換しました。
一晩のインキュベーション後にスペクチノマイシンで成長したコロニーは、ポジティブな形質転換体と見なされました。ニューモリジン変異の表現型確認は、D39、519/43野生型、および変異型519/43デルタプライの溶血活性を評価することによって行われました。これは、100%と考えられている0.5%サポニンによる赤血球の溶血と比較されました突然変異体は赤血球を溶解する能力を失いました。
すべての陽性コロニーは、挿入の位置を評価するためのシーケンシングによってさらに確認されました。相同性領域の外側に結合部位を持つプライマーを使用しました。形質転換反応を行う際には、試薬を正しい順序で添加することが重要です。
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この記事では、S. pneumoniae 血清型1株519/43を遺伝的に改変する手法を、そのDNA獲得の自然な能力を活用して紹介しています。この研究では、pneumolysin(ply)遺伝子の同一遺伝子型変異体を作成し、さらなる研究への道を開いています。
Genetic modification of Streptococcus pneumoniae serotype 1 has been a longstanding barrier in infectious disease research, particularly for vaccine and therapeutic target validation in high-burden regions. This protocol enables functional genomics in a clinically relevant strain, supporting mechanistic de-risking of virulence factors like pneumolysin. By establishing a reliable mutagenesis system, it improves predictive confidence in target selection and accelerates preclinical evaluation pipelines.
The method fits within the discovery biology phase, enabling target validation through genetic manipulation prior to lead identification efforts.