Name: 血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 学ぶ肺炎球菌血清型1株519/43の遺伝子改変法。自然なDNA取り込み能力を利用し、プルモリシン遺伝子のイソジェニック変異体を作成する手法を解説。ワクチン開発や病原体研究への応用が期待されます。

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髄膜炎トラストとMRCがこの作業に資金を提供してくれたことに感謝します。

1. SOE-PCR23による変異アンプリコンの生成とスペクチノマイシンカセットの増幅
<ol><li>まず、株519/43由来のプライ遺伝子の隣接領域の相同性アーム(それぞれply 5'(488 bp)およびply3'(715 bp))の増幅のためにPCRを実行します。プライマー plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATTACTATCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) および plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTTTATCCTCTACC).</li>
	<li>ply5'には次のPCR条件を使用します:94°Cで60秒間変性、ステップ2:94°Cで30秒間変性、ステップ3:58°Cで30秒間アニーリング、ステップ4:72°Cで30秒間伸長、ステップ5:ステップ2に戻って35サイクル繰り返し、ステップ6:72°Cで30秒間の最終伸長。<ol><li>ply3' には、ステップ 4 とステップ 6 の延長時間が 60 秒であることを除いて、同じ PCR 条件を使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲル電気泳動によりPCR産物を分析し、ゲルからアンプリコンを切除します。</li>
	<li>製造元の説明書(材料表)に記載されているプロトコルに従ってPCRアンプリコンを精製します。</li>
	<li>SOE-PCRのテンプレートとして、等モル量の両相同性アームを使用します。NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTG plyRv2_NotI GGGGGGTGGTGCCATGGCCATGCCATGCCTGCCTGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTGCCTCCTCCTTGCCTCCTCCCCTCCTCCCCTCCTCCTCCTTGCCTGGCCTCCTCCTCCTCCTGGCCTGGCCTGGCCTGGCCTGGTTTCCTGGCCTGGCCTGGTTTCCTCCTGGCCTGGTTTCCTCCTCCTGGCCTGGTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGCCTGGTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCTCCCTGGTTGCCTGGCCTGGCCTCCTCCTCC plyFw1_</li>
	<li>以下のSOE-PCR条件を使用します(ステップ1:94°Cで2分間変性、ステップ2:94°Cで30秒間変性、ステップ3:58°Cで30秒間アニーリング、ステップ4:68°Cで60秒間伸長、ステップ5:ステップ2に戻って25サイクル繰り返し、ステップ6:最終伸長を68°Cで90秒間)。</li>
	<li>SOE-PCR産物をゲル電気泳動で分析します。ゲル抽出キットを使用してゲルから切り取り、提供された指示に従ってください。</li>
	<li>以下のPCR条件を用いてプラスミドpR412からスペクチノマイシンカセットを増幅する: ステップ1:94°Cで60秒間変性、 ステップ2:94°Cで30秒間変性、 ステップ3:55°Cで30秒間アニーリング、 ステップ4:68°Cで60秒間伸長、 ステップ5:ステップ2に戻り、25サイクル繰り返します。 ステップ6:68°Cで60秒間の最終延長。<ol><li>プライマー BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) および BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC) を使用してください。プラスミドpR412は、Marc PrudHomme博士(CNRS-ポール・サバティエ・トゥールーズ・フランス大学)から取得しました。</li>
	</ol></li>
	<li>PCRアンプリコンをゲル電気泳動で解析する。得られたPCRアンプリコンを上記のように切り出し精製する。</li>
</ol>2. プラスミドpSD1の生成と 大腸菌 Dh5αの化学変換
<ol><li>pGEMT-easyシステムIの製造元の指示に従ってライゲーションを実行します(材料表)。マイクロ遠心チューブに、5 μLの2xライゲーションバッファー、1 μLのpGEMTeasy、2 μLのply_SOE産物、1 μLのT4 DNAリガーゼおよび水を20 μLの総容量に加えます。4°Cで一晩インキュベートします。 これによりプラスミドpSD1が生成されます。</li>
	<li>化学的に有能な 大腸菌 Dh5αをpSD1で変換します。まず、50 μLの化学的に有能な 大腸菌 Dh5αと3 μLのpSD1ライゲーション反応を氷上で15分間インキュベートします。次に、細胞を熱衝撃(42°C、30秒)にさらして続行します。細胞を氷上に2分間置きます。</li>
	<li>細胞を氷から取り出し、350 μLのS.O.C培地を加えます。培養液を37°C、120rpmで2時間インキュベートする。</li>
	<li>0.4 mM IPTG、青/白選択用の0.24 mg/mL X-Gal、および100 μg/mLアンピシリンを添加したルリアベルタニ寒天培地(LBA)で形質転換をプレート化し、プレート内で増殖するすべてのコロニーがプラスミド骨格を持つようにします。白色コロニーはpSD1を含む。</li>
	<li>3つの白いコロニーを選び、100 μg/mLのアンピシリンを添加した10 mLのLBで一晩増殖させます。培養物を振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>翌日、培養液を3,082 x g で遠心分離し、ペレットをプラスミド抽出に使用します。</li>
</ol>3. プラスミドDNA抽出、pSD1およびスペクチノマイシン遺伝子の制限消化およびpSD2のアセンブリ
<ol><li>市販のキットに付属の説明書に従ってプラスミドDNAを抽出します(材料表)。</li>
	<li>pSD1プラスミドと、以前に増幅および精製したスペクチノマイシンカセットの両方に対してBamHI制限消化をセットアップします。 表 1 に記載されている以下の条件と数量を使用してください。</li>
	<li>制限酵素処理反応とコントロールを37°Cで3時間インキュベートします。</li>
	<li>電気泳動で制限ダイジェストを分析し、バンドを切除し、市販のキットに付属の説明書に従って精製します(材料表)。</li>
	<li>次に、BamHI-消化されたpSD1およびスペクチノマイシン(ステップ3.2から)を使用して、製造元の説明書(材料の表)に従ってライゲーション反応を調製する。マイクロ遠心チューブに、5 μLの2xライゲーションバッファー、2 μL pSD1、2 μLのスペクチノマイシンカセット、1 μLのT4 DNAリガーゼの反応成分を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 これによりプラスミドpSD2が生成されます。</li>
	<li>プラスミドpSD2を、ステップ2.2に記載の化学的に有能な 大腸菌 Dh5αに形質転換する。</li>
	<li>プラスミドpSD2を保有する形質転換体は、100 μg/mLのスペクチノマイシンとアンピシリンを添加したLBAでの増殖能に基づいて選択します。</li>
	<li>上記のようにプラスミドDNA抽出(pSD2)を実行し、製造元の指示に従って(μL)を実行します。</li>
</ol>4. 肺炎球菌 519/43株の形質転換
<ol><li>S. pneumoniae 519/43をBHIで一晩培養し、37°C、5%CO2で静的に増殖させます。</li>
	<li>翌日、培養物を10 mLの新鮮なBHIブロスで1:50および1:100に希釈します。OD595nm が0.05〜0.1になるまで、培養液を37°Cで静的にインキュベートします(0.1 ODに近いDNAの最適な取得)。</li>
	<li>ODが0.1に達したら、860 μLを取り、マイクロ遠心チューブに移します。この同じマイクロ遠心チューブに、100 μLの100 mM NaOH、10 μLの20%(w/v)BSA、10 μLの100 mM CaCl 2、2 μLの50 ng/mL CSP124 および500 ngのpSD2を追加します。</li>
	<li>反応液を37°Cで3時間静置インキュベートします。</li>
	<li>330 μLを、100 μg/mLのスペクチノマイシンを添加した5%血液寒天プレート(BA)に、3時間かけて1時間ごとにプレートします。</li>
	<li>プレートを37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。スペクチノマイシン耐性コロニーを、100 μg/mLのスペクチノマイシンを添加した別のBAプレート、および100 μg/mLのアンピシリンを添加したBAプレートにパッチします。上記の条件下で両方のプレートセットを一晩インキュベートします。アンピシリンプレートは、プラスミド骨格の存在について試験するためのものである。</li>
	<li>NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTG) および SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCTAATTTCCG) plyFw1_プライマーを用いたPCRによりスペクチノマイシンカセットの存在を確認する。変異領域の外側に付着するプライマーplySCN1(CCAATGGAATCGCTAGGCAAGAGATAA)およびplySCN2(ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT)を用いてPCRにより変異を確認します。</li>
	<li>プライマーplySCN1(CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA)、plySCN2(ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT)、およびスペクチノマイシンカセットsqr1(CCTGATCCAACATGTAAGATTACC)sqf2(CGTAGTTATCTTGGAGAATA)spec_sqf1(GGTACTTACATGTTTGGATGGATCAGG)およびspec_sqr2 TATTCTCTCTCCAAGATAACTACGGのそれらの結合部位を有するプライマーを使用してシーケンシングすることにより、ゲノムの正しい位置への組み込みを確認します。</li>
</ol>

<ol><li>Bentley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+of+the+Capsular+Biosynthetic+Locus+from+All+90+Pneumococcal+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes.</a> PLoS Genetics. 2 (3), 31(2006).</li>
<li>Calix, J. J., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+pneumococcal+serotype%2C+11E%2C+has+a+variably+inactivated+wcjE+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene.</a> The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).</li>
<li>Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+New+Capsular+Serotype+%286C%29+within+Serogroup+6+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+Report+of+Putative+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+6D+among+Nasopharyngeal+Isolates+from+Fijian+Children%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).</li>
<li>Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+6+Variants+with+Glycosyltransferases+Synthesizing+Two+Differing+Repeating+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).</li>
<li>Calix, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+Characterization+of+Two+Capsule+Subtypes+among+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+20+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Serological+Characterization+of+a+New+Pneumococcal+Serotype%2C+6H%2C+and+Generation+of+a+Pneumococcal+Strain+Producing+Three+Different+Capsular+Repeat+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).</li>
<li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).</li>
<li>Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pneumococcus%3A+Epidemiology%2C+Microbiology%2C+and+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215(2013).</li>
<li>Leimkugel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Outbreak+of+Serotype+1+Streptococcus+pneumoniae+Meningitis+in+Northern+Ghana+with+Features+That+Are+Characteristic+of+Neisseria+meningitidis+Meningitis+Epidemics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).</li>
<li>Yaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+and+Molecular+Characteristics+of+a+Highly+Lethal+Pneumococcal+Meningitis+Epidemic+in+Burkina+Faso%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso.</a> Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).</li>
<li>Antonio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+pneumococci+obtained+from+Gambian+children+aged+2-29+months+with+invasive+pneumococcal+disease+during+a+trial+of+a+9-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine.</a> BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81(2008).</li>
<li>Kwambana-Adams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+pneumococcal+meningitis+among+older+children+%28%E2%89%A55+years%29+and+adults+after+the+implementation+of+an+infant+vaccination+programme+with+the+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+Ghana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana.</a> BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575(2016).</li>
<li>Antonio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonality+and+outbreak+of+a+predominant+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+clone+from+The+Gambia%3A+Expansion+of+ST217+hypervirulent+clonal+complex+in+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa.</a> BMC Microbiology. 8 (1), 198(2008).</li>
<li>Staples, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+an+Australian+serotype+1+Streptococcus+pneumoniae+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak.</a> Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).</li>
<li>Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((African+meningitis+belt+pneumococcal+disease+epidemiology+indicates+a+need+for+an+effective+serotype+1+containing+vaccine%2C+including+for+older+children+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults.</a> BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22(2010).</li>
<li>Hill, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasopharyngeal+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+Gambian+infants%3A+a+longitudinal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study.</a> Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).</li>
<li>Ebruke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+in+nasopharyngeal+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+genotypes+in+healthy+Gambians+before+and+after+the+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine.</a> PeerJ. 3, 90(2015).</li>
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<li>Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+6-phospho-%CE%B2-glucosidase+%28BglA3%29+is+involved+in+virulence+and+nutrient+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism.</a> Infection and Immunity. 84 (1), (2015).</li>
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<li>Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+pneumolysin+deficient+mutant+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+strain+519%2F43+and+phenotypic+characterisation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation.</a> Microbial Pathogenesis. 141, 103999(2020).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

肺炎連鎖球菌、特に血清型1は、侵襲性肺炎球菌疾患および髄膜炎を引き起こす世界的な脅威であり続けている。血清型1に対して保護されるべきさまざまなワクチンの導入にもかかわらず、アフリカでは、この血清型は依然として高い罹患率と死亡率につながる発生を引き起こす可能性があります13。この血清型を遺伝的に操作する能力は、その臨床的関連性のために非常に重要です。この研究に記載されている方法は、この血清型内の代表的な株の遺伝子操作を可能にします。侵襲性株519/43(ST5316)、デンマークの髄膜炎患者からの臨床分離株25。
ここで紹介した方法論は、外因性DNAを取得できるため、主に選択された株によって成功しましたが、肺 炎球菌 の形質転換に使用される従来のプロトコルに加えられた変更により、形質転換プロトコルの典型的な成功率は約70%です。
この方法論では、通常の線状DNAの代わりに自殺プラスミドを使用すること...

肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae、肺炎球菌)は、世界的に罹患率と死亡率の主な原因の1つです。最近まで、100近くの血清型のS.肺炎が発見されています1,2,3,4,5,6,7。毎年、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)は、5歳未満の子供の約70万人が死亡していると主張しています8。肺炎球菌は、世界中の細菌性肺炎、中耳炎、髄膜炎、敗血症の主な原因です9。
アフリカの髄膜炎ベルトでは、血清型1が髄膜炎の発生の原因であり、非常に毒性の高い配列型である配列型(ST)ST217が優勢です10、11、12、13、14、15。髄膜炎の病理学におけるその重要性は、アフリカの髄膜炎ベルト16における髄膜炎菌の重要性に例えられています。血清型1はしばしばIPDの主な原因です。しかし、それは非常にまれに馬車で見つかります。実際、ガンビアでは、この血清型はすべての侵襲性疾患の20%を占めていますが、健康な保因者の0.5%にしか見られませんでした14,17,18,19。有能な肺炎球菌における遺伝子交換および組換えは、侵襲性疾患ではなくキャリッジで一般的に起こる20。さらに、血清型1は、肺炎球菌の中で説明されている最も短い保菌率の1つ(わずか9日)を有することが示されている。したがって、この血清型は他の血清型よりもはるかに低い組換え率を有する可能性があることが提案されている21。
血清型1株の保菌率が低い理由と、サハラ以南のアフリカの侵襲性疾患におけるその重要性を理解するには、詳細な研究が必要です。
ここでは、特定の血清型1株、519/43のゲノムワイド突然変異誘発を可能にするプロトコルを報告します。この株は、新しいDNAを簡単に取得してゲノムに組み換えることができます。この方法はまだ系統間ではありませんが、519/43バックグラウンドで行うと非常に効率的です(他のターゲットは変異しており、原稿は準備中です)。519/43株を使用し、その自然な能力を利用し、外因性DNAの提供方法を置き換えるだけで、この血清型1株のニューモリシン遺伝子(プライ)を変異させることができました。この方法は、異なる血清型を介してDNAを通過させる必要なしにワンステップで行われるため、Harveyら22 によって提示されたものの改良を表しています。それにもかかわらず、また株間の変動性のために、すべての菌株に標準化された方法はありません。特定の遺伝子を変異させ、その効果を観察する能力は、血清型 1 S. pneumoniae 株の深い理解を可能にし、サハラ以南のアフリカの髄膜炎におけるこれらの株の役割についての答えを提供します。

<table><tbody><tr><td>AccuPrime Pfx DNA ポリメラーゼ</td><td></td><td>12344024</td><td>フラグメントの増幅に使用</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9518</td><td>ステージ 1 (pSD1)</td></tr> <tr><td>血液寒天培地</td><td>オキシド</td><td>CM0055</td><td>S. pneumoniae 形質転換体</td></tr><tr><td>ウシ血清 アルブミン</td><td>シグ</td>マのプレートに使用<td>55470</td><td>S. pneumoniae Transformation</td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td></td><td>Oxoid CM1135</td><td>S. pneumoniae細胞の増殖に使用される</td></tr><tr><td>塩化カルシウム Cacl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td>S. pneumoniae Transformation</td></tr><tr><td>Competence stimulating peptide 1</td><td>AnaSpec</td><td>AS-63779</td><td>S. pneumoniae 形質転換</td></tr><tr><td>ルリアブロス寒天培</td>地に使用 <td>ギブコ</td><td>22700025</td><td>pSD1およびpSD2のめっきおよび選択</td></tr>に使用されます <tr><td>ルリアブロスベース(ミラーの製剤)</td>ギ<td>ブコ</td><td>12795027</td><td>pSD1およびpSD2</td></tr>モ<tr><td>ナークゲル抽出キット</td><td>NEB</td><td>T1020S</td> DNAゲルモナークプラスミド<td>からバンドを抽出するために使用されます</td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>細胞からプラスミドを抽出するために使用</td></tr><tr><td>pGEM T-easy</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>Suicide Plasmid</td></tr><tr><td>S.O.C.</td><td>形質転換後の細胞の回収に使用される</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td> <td>Sigma</td><td>S0899</td><td>S.pneumoniae 形質転換</td></tr><tr><td>に使用されます スペクチノマイシン塩酸塩</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1426</td><td>細菌の選択に使用されます</td></tr><tr><td>サブクローニング効率 DH5&alpha;コンピテントセル</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>pSD1 および pSD2 の作製に使用</td></tr></tbody></table>

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

肺炎連鎖球菌 血清型1は、低中所得国、特にサハラ以南のアフリカで依然として大きな問題となっています。その重要性にもかかわらず、この血清型の研究は、それを改変するための遺伝的ツールの欠如によって妨げられてきました。本研究では、血清型1臨床分離株(株519/43)を遺伝子改変する方法について述べる。興味深いことに、これは肺炎球菌が自然にDNAを取得する能力を利用することによって達成されました。しかし、ほとんどの肺炎球菌とは異なり、線状DNAの使用は成功しませんでした。この重要な株を変異させるには、自殺プラスミドを使用する必要がありました。この方法論は、その生物学と病原性の両方の観点から、このとらえどころのない血清型をより深く理解するための手段を提供しました。この方法を検証するために、主要な既知の肺炎球菌毒素であるニューモリシンは、よく知られたわかりやすい表現型を持っているため、変異しました。予想通り、突然変異体が赤血球を溶解する能力を失ったことを示しました。目的の血清型で重要な遺伝子を変異させることができれば、腹腔内および鼻腔内感染時の機能喪失変異体の表現型が他の血清型で観察されたものとは異なる表現型を観察することができました。要約すると、この研究は、株519/43(血清型1)が遺伝子組み換え可能であることを証明しています。

ここで説明するプロトコルは、PCRを使用して左右の相同性アームを増幅すると同時に、 プライ 遺伝子の中央領域から191 bpを削除することから始まります。PCRを実行している間、BamHI部位が左相同性アームの3'側および右相同性アームの5'末端に導入されます(図1A)。これに続いて、左右の相同性アームが1つのアンプリコンに融合されたPCR-SOEが続きます(図1B)。次に、このSOE-PCRアンプリコンをTAクローニングを使用してpGEMTeasyにクローニングし、プラスミドpSD1を生成します(図1C)。形質転換が成功すると、アンピシリンに耐性のある白いコロニーが得られます。青色コロニーは、空のpGEMTeasyプラスミドを含む形質転換体になります。次に、pSD1は、SOE-PCR時に導入されたBamHI部位で消化され(図1D)、スペクチノマイシンカセットにライゲーションされます...

ここでは、自然にDNAを獲得する能力を利用して遺伝子改変できる 肺炎球 菌血清型1株519/43と自殺プラスミドについて述べる。原理の証明として、ニューモリシン(プライ)遺伝子の同質変異体が作られました。

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

このプロトコルは、以前は扱い難い血清型の遺伝子改変を可能にし、血清型を研究し理解することを可能にするため、重要です。これにより、ワクチン開発などの生物学的研究への道が開かれます。この手順を実演するのは、ロンドン大学衛生熱帯医学大学院の助教授であるVanessa S.Terra氏です。プラスミドpSD1の生成を開始するには、pGEM-T Easy System Iのメーカーの指示に従ってライゲーションを行います。反応を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、化学的に有能な大腸菌Dh5-αをpSD1で形質転換し、50マイクロリットルの細胞と3マイクロリットルのpSD1ライゲーション反応を氷上で15分間インキュベートし、次に細胞を熱ショックにさらし、細胞を氷上に2分間置きます。細胞を氷から取り出し、350マイクロリットルのSOC培地を加え、37°C、120RPMで2時間培養物をインキュベートします。0.4ミリモルのIPTG、青白の選択のために0.24ミリグラム/ミリリットルのX-Gal、および100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを添加したLuria-Bertani寒天で形質転換をプレート化し、プレート上で成長するすべてのコロニーがプラスミド骨格を持つようにします。pSD1を含む3つの白いコロニーを選び、10ミリリットルのL-Bに100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを補給して一晩で成長させます。培養物を振とうしながら摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、培養物を3, 082 Gで遠心分離し、ペレットをプラスミド抽出に使用します。プラスミドDNAを抽出した後、pSD1プラスミドとスペクチノマイシンカセットの両方に対してBamH1制限酵素をセットします。制限酵素消化反応およびコントロールを摂氏37度で3時間インキュベートします。制限が終了したら、電気泳動で製品を分析し、正しいバンドを切り取り、市販のキットを使用して精製します。次に、BamH1消化されたpSD1とスペクチノマイシンを用いてライゲーション反応を行います。これにより、プラスミドpSD2が生成されます。前述のように、pSD2を化学的にコンピテントな大腸菌DH5-αに変換します。次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムのスペクチノマイシンとアンピシリンを添加したLBAで増殖する能力に基づいて、プラスミドpSD2を保有する形質転換体を選択し、プラスミドDNAを抽出します。S.pneumoniae 519/43をBHIで一晩培養し、摂氏37度と二酸化炭素5%で静的に成長させます。翌日、培養物を10ミリリットルの新鮮なBHIブロスで1:50と1:100に希釈します。595ナノメートルのODが0.05〜0.1になるまで、37°Cで培養物を静的にインキュベートします。適切なODに達したら、860マイクロリットルの培養物を取り、それを微量遠心チューブに移します。100マイクロリットルの100ミリモル水酸化ナトリウム、10マイクロリットルの20%BSA、10マイクロリットルの100ミリモル塩化カルシウム、2マイクロリットル/ミリリットルのCSP1および500ナノグラムのpSD2を追加します。反応を37°Cで静的に3時間インキュベートします。次に、330マイクロリットルを5%血液寒天培地プレートにプレートし、1ミリリットルあたり100マイクログラムのスペクチノマイシンを3時間のインキュベーション期間にわたって1時間ごとに補充します。次に、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。スペクチノマイシン耐性コロニーを、100マイクログラム/ミリリットルのスペクチノマイシンを補充した別の血液寒天プレートに、および100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを補充した血液寒天プレートにパッチを当てます。これは、プラスミド骨格の存在をテストします。両方のプレートセットを一晩インキュベートします。制限酵素消化により、pSD2の正しい組み立てを確認しました。次に、pSD2を使用して519.43の野生型細胞を形質転換しました。一晩のインキュベーション後にスペクチノマイシンで成長したコロニーは、ポジティブな形質転換体と見なされました。ニューモリジン変異の表現型確認は、D39、519/43野生型、および変異型519/43デルタプライの溶血活性を評価することによって行われました。これは、100%と考えられている0.5%サポニンによる赤血球の溶血と比較されました突然変異体は赤血球を溶解する能力を失いました。すべての陽性コロニーは、挿入の位置を評価するためのシーケンシングによってさらに確認されました。相同性領域の外側に結合部位を持つプライマーを使用しました。形質転換反応を行う際には、試薬を正しい順序で添加することが重要です。

constructing-mutants-serotype-1-streptococcus-pneumoniae-strain

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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