Name: 細菌の持続性に及ぼす影響を解明するための化学化合物のハイスループットスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶ細菌の持続性に影響を与える化学化合物をハイスループットスクリーニングで同定する方法。マイクロアレイ培養と抗生物質処理を用い、薬剤パネルや遺伝子ライブラリーのスクリーニングに応用可能です。

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この研究の中で、オーマン・ラボのメンバーの貴重なインプットに感謝したいと思います。この研究は、NIH/NIAID K22AI125468キャリア移行賞とヒューストン大学のスタートアップ助成金によって資金提供されました。

1. 成長培地、フロキサシン溶液、 大腸菌 細胞株の調製
<ol><li>通常のルリア・ベルタニ(LB)培地:トリプトン10g/L、塩化ナトリウム10g/L(NaCl)、酵母エキス5g/Lを脱イオン化(DI)水に添加します。オートクレーブ処理で培地を殺菌する。</li>
	<li>LB寒天プレート:トリプトン10g/L、NaCl10g/L、酵母エキス5g/L、DI水中15g/L寒天を加え、オートクレーブ処理で培地を殺菌します。所望の温度(〜55°C)で、寒天培地の30mLを正方形のプレート(10 x 10cm)に注ぎます。プレートを乾かして4°Cで保管してください。</li>
	<li>変性LB培地:トリプトン10g/Lと5gの酵母エキスをDI水に加えます。オートクレーブ処理で培地を殺菌する。</li>
	<li>変性LB培地(浸透量を含む):2倍の変性LB培地と2倍の浸透量溶液を同量で混合する。2倍の変性LB培地を調製するには、トリプトン20g/Lと10gの酵母エキスをDI水中に加え、オートクレーブ処理で殺菌します。2x浸透液溶液を調製するには、目的の浸透量(2倍量)をDI水に溶解し、次いで溶液を殺菌してフィルター処理します。 注:目的の浸透量とその濃度は、表現型マイクロアレイスクリーニングアッセイ(プロトコル4を参照)から決定することができます。しかし、試験済み浸透量および関連する2倍濃度は、研究の性質に応じて調整することができる。例えば、1 mMの塩化ナトリウムの影響を調べるために、2xの浸透液溶液は2mMの塩化ナトリウム溶液となる。</li>
	<li>Ofloキサシンストック溶液(5 mg/mL):1mLのDI水に5mgのオフロキサシン(OFX)塩を加えます。10 M水酸化ナトリウム10μLを加えて、水中のOFXの溶解度を高め、次いで溶液を殺菌してフィルターします。アリコートを用意し、-20°Cで保管してください。 注:Ofloキサシンは、成長し、非成長細菌細胞14、21の両方に広く使用されているキノロン抗生物質です。大腸菌MG1655細胞のOFXの最小阻害濃度(MIC)は、0.039〜0.078 μg/mL19,20の範囲内である。また、アンピシリンやカナマイシンなどの他の抗生物質は、一般的にパーシスター研究で使用されることに注意してください。抗生物質の選択は、研究の性質に依存します。</li>
	<li>
大腸菌 MG1655細胞株:14mL試験管(スナップキャップ)に単一コロニーを有する通常LB培地2mLを接種し、250rpmおよび37°Cで軌道シェーカー中の細胞を培養する。 細胞が定常相に達したら、細胞培養500μLを500μLのグリセロール(無菌)を極低温バイアルに混ぜ、-80°Cで保存します。</li>
</ol>2. 既存のパーシスターを排除する細胞の伝播
<ol><li>一晩培養を調製するために、凍結した細胞ストックから少量の細胞を無菌ピペットチップ(グリセロール細胞ストックを解凍しない)で掻き取り、14mLスナップキャップ試験管内の2mLの改変LB培地中の細胞を接種する。250 rpmで軌道シェーカー中の細胞を培養し、37°Cで12時間培養します。</li>
	<li>最初の伝播<ol>
<li>12時間後、滅菌アルミニウム箔で覆われた250mLのバッフルフラスコで25mLの新鮮な改変LB培地に一晩培養250 μLを移す。</li>
		<li>細胞が指数位中相(OD600 = 0.5)に達するまで、250 rpmおよび37°Cで軌道シェーカーで細胞培養を成長させます。</li>
		<li>マイクロプレートリーダーを30分ごとに使用して、光密度を600 nm(OD600)で測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 番目の伝播<ol>
<li>OD600= 0.5で、250 mLバッフルフラスコ中のフレッシュ改質LB培地の25mLに第1フラスコから細胞培養の250 μLを希釈した。</li>
		<li>250 rpm で軌道シェーカーの 2 番目の細胞培養を、OD600=0.5 まで 37 °C 成長させます。</li>
		<li>光学密度を30分ごとに測定します。 注: 一晩培養すると、4、5、22個のパーシスターセルが大量に含まれる場合があります。上記の希釈/増殖サイクル法5は、細胞をマイクロアレイに移す前に、これらの既存のパーシスターを排除するために使用することができる。それらの排除は、プロトコル3に記載されているアッセイを用いて、一晩培養のパーシスターレベルを定量化することによって検証することができる。この方法は、以前の研究ですでに検証されています19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 既存のパーシスター細胞の排除の検証
<ol><li>第2の伝播(ステップ2.3を参照)の後、250 mLバッフルフラスコ中の25mLの新鮮な改変LB培地中の細胞培養(OD600 = 0.5)の250 μLを希釈した。 注:コントロールの場合、250 mLバッフルフラスコに25mLのフレッシュ改変LB培地を25 mLで一晩培養(ステップ2.1を参照)の250 μLを希釈します。フラスコに細胞を移す前に、一晩培養した細胞密度を、OD600=0.5 を得るために新たに改変したLB培地で調整すべきである。</li>
	<li>25 μLのOFXストック溶液(5 mg/mL)を細胞懸濁液に加え、フラスコを軽く振って、アッセイ培養を均質にします。OFXの最終濃度はアッセイ培養で5μg/mLです。</li>
	<li>250 rpm および 37 °C で軌道シェーカーにアッセイ培養をインキュベートします。</li>
	<li>治療中の1時間ごとに(0時間、OFXをアッセイ培養に添加する前の時点を含む)、フラスコから1.5mLマイクロ遠心チューブにアッセイ培養液の1mLを移す。</li>
	<li>マイクロ遠心分離管内のアッセイ培養物を17,000xgで3分間遠心分離する。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さずに上清の950μLを慎重に除去します。</li>
	<li>950 μL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液をマイクロ遠心分離管に加えます。</li>
	<li>抗生物質濃度が最小阻害濃度(MIC)を下回るまで、合計で3倍の洗浄ステップ3.5〜3.7を繰り返します。</li>
	<li>最終洗浄後、細胞ペレットを100 μLのPBS溶液に再懸濁し、10倍の濃縮試料を得ます。</li>
	<li>細胞懸濁液を10μLとし、96ウェルラウンドボトムプレートを使用して90 μLのPBS溶液で6回連続希釈します。</li>
	<li>抗生物質を含まない新鮮な寒天プレートに希釈細胞懸濁液の10 μLをスポットします。検出の限界を高めるには、新鮮な寒天プレートに残りの90μLの細胞懸濁液をプレートします。</li>
	<li>寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートし、コロニー形成ユニット(CFUs)を数えます。アッセイ培養の1mLにおけるCFUsの総数を計算しながら希釈率を考慮する。殺し曲線は、抗生物質治療の持続時間に関して対数CFU値をプロットすることによって生成される。 注:6時間OFX治療は、大腸菌細胞19、20の二倍化キル曲線を得るのに十分です。伝播された細胞のパーシスターレベル(6時間でCFUカウントで測定)は、一晩培養のそれよりも有意に少なくすべきである。プロトコル 2 および 3 で説明されている手順は、研究の設計に応じて通常の LB で実行できます。</li>
</ol>4. マイクロアレイプレートスクリーニング 
<ol><li>マイクロアレイ細胞培養の準備<ol>
<li>指数相細胞250μLを、50 mL遠心チューブで25mLの新しい改変LB培地に移します。細胞懸濁液を軽く混ぜて均質にします。 注: 指数位相セル (OD600 = 0.5) は、第 2 の伝搬ステップ (ステップ 2.3 を参照) から取得されます。</li>
		<li>希釈した細胞懸濁液を無菌50 mLリザーバに移します。</li>
		<li>マルチチャネルピペットを用いて、150μLの細胞懸濁液をマイクロアレイの各ウェル、すなわち、様々な浸透量体を含む96ウェルプレートに移す。 注: 浸透性を持たないウェルはコントロールとして機能します。</li>
		<li>マイクロアレイをガス透過性シール膜で覆います。</li>
		<li>プレートを37°Cで軌道シェーカーにインキュベートし、24時間250rpmでインキュベートします。 注:これらの実験では、様々な濃度で乾燥状態で広範囲の浸透性、pHバッファーおよび他の化学物質を含むフェノタイプマイクロアレイ(PM-9およびPM-10)などの市販のプレートを使用しました。これらのマイクロアレイは、ハーフエリア96ウェルプレートフォーマットです。使用するプレートの種類に応じて、培養量を調整する必要があります。マイクロアレイは手動で生成することもできます(下記参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロアレイプレートの手動準備<ol>
<li>75 μLの2x浸透液溶液をハーフエリア96ウェルプレートのウェルに移します。</li>
		<li>指数相細胞500μLを、50 mL遠心チューブ内の2x改変LB培地25 mLに移します。細胞懸濁液を軽く混ぜて均質にします。 注: 接種速度は、4.1で説明したマイクロアレイスクリーニングプロトコルと一致するように調整されました。</li>
		<li>2x浸透液を含むハーフエリア96ウェルプレートの各ウェルに75μLの細胞懸濁液を加えます。</li>
		<li>プレートを37°Cで軌道シェーカーにインキュベートし、24時間250rpmでインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パーシスターアッセイプレートの準備<ol>
<li>50 mL遠心分離管に5μg/mLのOFXを含む25mLの改変LB培地を調製し、滅菌貯留槽にこの培地を移します。</li>
		<li>190 μLの修正されたLB培地を、多流ピペットを使用して、リザーバからOFXを用いて、一般的なフラットボトム96ウェルプレート(パーシスターアッセイプレート)の各ウェルに移します。</li>
		<li>シェーカーからマイクロアレイを取り除き(24時間培養した後)、10μLの細胞培養物をマイクロアレイからパーシスターアッセイプレートのウェルに移し、OFXを用いて改質したLB培地を含む。</li>
		<li>パーシスターアッセイプレートから10μLの細胞懸濁液を取り、ラウンドボトム96ウェルプレートとマルチチャンネルピペットを使用して、PBS溶液290 μLで3回連続希釈します。</li>
		<li>連続希釈に続いて、マルチチャネルピペットを使用して、抗生物質を含まない新鮮な寒天プレート上のすべての連続希釈細胞懸濁液の10 μLをスポットします。</li>
		<li>パーシスターアッセイプレート(ステップ4.3.3で調製)をガス透過性の密閉膜でプレートを覆った後、37°Cで軌道シェーカーにインキュベートし、6時間250rpmでインキュベートします。</li>
		<li>シェーカーで6時間のインキュベーションを行った後、パーシスターアッセイプレートを取り出し、ステップ4.3.4-4.3.5を繰り返します。</li>
		<li>寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートし、CFUsを数えます。抗生物質治療の前および6時間後のCFUレベルは、各井戸のパーシスター分画を計算することを可能にする。OfX治療前のCFUカウントはまた、浸透量体の効果と 大腸菌 の生存率を評価するのに役立ちます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 特定された条件の検証
<ol><li>マイクロアレイスクリーニングから同定された浸透量を含む新たに改変されたLB培地のステップ2.3から25mLに指数位相細胞の250 μLを移す(プロトコル4を参照)。</li>
	<li>250 rpm で軌道シェーカーにフラスコをインキュベートし、37 °Cで 24 時間インキュベートします。</li>
	<li>24時間後、シェーカーからフラスコを取り出し、250 mLバッフルフラスコで25mLのフレッシュ改質LB培地に細胞培養液250μLを移します。</li>
	<li>25 μLのOFXストック溶液(5 mg/mL)を細胞懸濁液に加え、フラスコを軽く振ってアッセイ培養を均質にします。フラスコを37°Cおよび250rpmでシェーカーにインキュベートする。</li>
	<li>処理中の1時間ごとに、フラスコから1.5mLマイクロ遠心チューブにアッセイ培養液1mLを移す。</li>
	<li>マイクロ遠心分離管内のアッセイ培養物を17,000xgで3分間遠心分離する。</li>
	<li>950 μLの上清を取り出し、950 μLのPBSを加えます。</li>
	<li>洗浄手順 5.6 と 5.7 を 3x に対して繰り返します。</li>
	<li>最終洗浄後、細胞ペレットを100μLのPBS溶液で再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液を10μLとし、96ウェルラウンドボトムプレートを使用して90μLのPBS溶液で6倍を連続して希釈します。</li>
	<li>抗生物質を含まない新鮮な寒天プレートに希釈された細胞懸濁液の10 μLを見つける。検出の限界を高めるには、新鮮な寒天プレートに残りの90μLの細胞懸濁液をプレートします。</li>
	<li>寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートし、CFUsを数えます。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明する高スループットパーシスターアッセイは、大 腸菌 の持続性に対する様々な化学物質の影響を解明するために開発されました。商用PMプレートに加えて、マイクロアレイはステップ4.2で説明されているように手動で構築することができます。さらに、ここで提示されるプロトコルは柔軟性があり、96ウェルプレート形式の薬物パネルや細胞ライブラリなどの他のマイクロアレイをスクリーニングするために使用することができます。成長期を含む実験条件、接種速度および培地は、これらのライブラリーを試験するために調整することができる。例えば、慶應 E.大腸菌 ノックアウトコレクション23のようなセルライブラリをスクリーニングしたい場合、まず、マルチチャンネルピペットを使用して、新鮮な培地を含む96のウェルプレートに、ライブラリから株を移すことができる。細胞が望ましい成長期(例えば、指数または定常相)に達すると、細胞は、ノックアウト株のパーシスターレベルを列挙するためにステップ4.3で説明されているようにパーシスターアッセイプレートに移される。同様に、この戦略は、大 腸菌プ...

細菌培養は、異常に高いレベルの抗生物質に対して一時的に耐性があるパーシスター細胞の小さな亜集団を含む。パーシスター細胞は、抗生物質感受性の親族と遺伝的に同一であり、その生存は一過性の増殖阻害に起因する1。パーシスター細胞はグラディスホビー2によって最初に発見されたが、ペニシリン処理ブドウ球菌培養3でそれらを同定したときにジョセフ・ビガーによって最初に使用された。Balabanら4が発表した精巧な研究では、主に定常相を通過して形成されるタイプI変異体と、指数成長の間に連続的に生成されるII型の2つのパーシスタータイプが発見された。パーシスターは、抗生物質治療中に様々な間隔で培養サンプルを採取し、洗浄し、典型的な成長培地上でメッキし、抗生物質の不在時にコロニー形成できる生き残った細胞を数えるクロノジェニック生存アッセイによって検出される。細胞培養におけるパーシスターの存在は、初期指数崩壊が抗生物質感受性細胞の死を示す二額殺し曲線4、5によって評価される。しかし、殺死傾向は時間の経過とともに減少し、最終的には生き残ったパーシスター細胞を表す高原領域につながる。
パーシスター細胞は、結核6、嚢胞性線維症7、カンジダ症8および尿路感染症9などの様々な疾患に関連している。これまでに試験されたほとんどすべての微生物が、結核菌の高病原性抗酸菌6、黄色ブドウ球菌10、緑膿菌7およびカンジダ・アルビカンス8を含むパーシスター表現型を生成することが判明した。最近の研究はまた、パーシスター亜集団11、12からの多剤耐性変異体の上昇の証拠を提供する。この分野での多くの努力は、持続性メカニズムが非常に複雑で多様であることを明らかにしました。SOS応答13、14、活性酸素種(ROS)15、毒素/抗毒素(TA)系16、オートファジーまたは自己消化17およびppGpp関連ストリンジェント応答18に関連する確率的および決定的因子の両方が、パーシスター形成を促進することが知られている。
持続性表現型の理解において有意な進歩を遂げたにもかかわらず、浸透性の細菌性持続性に及ぼす影響は十分に理解されていない。最適な浸透圧の維持は細胞の成長、適切な機能および生存のために必要であるため、浸透圧の詳細な研究は、抗姉妹戦略の潜在的な標的につながる可能性がある。面倒な、ハイスループットスクリーニングは、持続性表現型19、20において重要な役割を果たす代謝産物および他の化学物質を同定するための非常に効果的なアプローチである。本研究では、マイクロアレイ、すなわち、各種浸透量体(例えば、塩化ナトリウム、尿素、亜硝酸ナトリウム、塩化カリウム)を含む96個のウェルプレートを用いた、大腸菌の持続性に大きな影響を与える浸透性を同定する方法19を紹介する。

<table><tbody><tr><td>14ml試験管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌株 MG1655</td><td>プリンストン大学</td><td></td><td>ブライニルセン研究室から取得</td></tr><tr><td>平底96ウェルプレート</td><td>USA Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>ガス透過性シーリング膜</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>ガンマ線照射による滅菌済みで、細胞毒素を含まない</td></tr><tr><td>半面積平底96ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1425-2</td><td>分子遺伝学グレード</td></tr><tr><td>オフロキサシン塩</td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC &ge;97.5</td></tr><tr><td>表現型マイクロアレイ(PM-9およびPM-10)</td><td>Biolog</td><td>N/A</td><td>PM-9およびPM-10プレートには、それぞれ様々な浸透圧と緩衝液が含まれていました</td></tr><tr><td>丸底96ウェルプレート</td><td>USA Scientific</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>認定 ACSグレード</td></tr><tr><td>硝酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>AC424345000</td><td>ACS試薬グレード</td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td></td><td>AAA186680B 純度98%</td></tr><tr><td>角型シャーレ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP1421-500</td><td>分子遺伝学グレード</td></tr><tr><td>Varioskan lux マルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>VLBL00D0</td><td>600nm</td></tr><tr><td>での光学密度測定に使用酵母エキス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1422-100</td><td>分子遺伝学グレード</td></tr></tbody></table>

細菌の持続性に及ぼす影響を解明するための化学化合物のハイスループットスクリーニング

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

細菌のパーシスターは、高濃度の抗生物質を容認する能力を有する表現型変異体の小さな亜集団として定義される。彼らは再発性慢性感染症に関連付けられているので、彼らは重要な健康上の懸念です。ストレス関連機構の確率的かつ決定論的なダイナミクスは持続性において重要な役割を果たしていることが知られているが、持続性状態との間でのフェロティピック切り替えの根底にあるメカニズムは完全には理解されていない。環境シグナルによって引き起こされる持続性因子(例えば、炭素、窒素、酸素源の枯渇)は広範囲に研究されているが、浸透性に及ぼす浸透率は未だ決定されていない。マイクロアレイ(すなわち、様々な化学物質を含む96ウェルプレート)を用いて、様々な浸透量体が 大腸菌 持続性に及ぼす影響を高スループットで解明するアプローチを設計しました。このアプローチは、薬物パネルや遺伝子ノックアウトライブラリなどの他のスクリーニングアレイに容易に適応できるため、変革的です。

図 1 は、実験プロトコルについて説明しています。希釈/成長サイクル実験(プロトコル2参照)は、一晩培養に由来するパー シスターを排除するためにKerenらら5によって行われた研究から適応した。 図2A は、OFX処理前後の細胞培養のCFUレベルを決定するために用いられる寒天プレートの代表的な画像である。これらの実験では、細胞をステップ4.2に記載した半分面積96ウェルプレート内の浸透量体を用いて改変LB培地で培養した。24時間軌道シェーカーでプレートをインキュベートした後、パーシスターアッセイは、一般的なフラットボトム96ウェルプレートを用いて行った(ステップ4.3参照)。ここでテストされている浸透病と濃度は、我々の前の研究に基づいて選択されました19我々は異なる濃度で様々な浸透金を含むPM-9プレートを使用してステップ4.1と4.3を実行しました (塩化ナトリウム, 塩化カリウム, 硫酸ナトリウム, エチレングリコール,...

本方法論文では、細菌の持続性に大きな影響を与える浸透性物質などの化合物を同定するためのハイスループットスクリーニング戦略を紹介する。

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

ここで説明するプロトコルにより、細菌の持続性に大きく影響する可能性のある条件を、高スループットで識別することができます。この方法は、薬物パネル、遺伝子ライブラリーなどの様々な領域のスクリーンに容易に適応可能である。この方法には同時に行われるさまざまなサブステップが含まれているため、視覚的なデモンストレーションは、研究者が正確な結果を得るためにタイミングを管理するのに役立つ。マイクロアレイ細胞培養を準備するから始めます。指数相細胞の250マイクロリットルを50ミリリットル遠心管で25ミリリットルの新鮮な改変LB培地に移す。その後、細胞懸濁液を穏やかに混ぜて均質にします。希釈した細胞懸濁液を無菌50ミリリットルの貯蔵所に移す。マルチチャネルピペットを使用して、細胞懸濁液の150マイクロリットルを様々な化学物質を含むマイクロアレイプレートの各ウェルに移す。マイクロアレイは、テキスト原稿に記載された方法に従って手動で生成することもできる。マイクロアレイプレートにガス透過性の天井膜を覆い、摂氏37度、250RPMの軌道シェーカーで24時間インキュベートします。パーシスターアッセイプレートを作るには、50ミリリットル遠心分離管にOfloxacatの1ミリリットル当たり5マイクログラムを含む25ミリリットルの修飾LB培地を調製し、この培地を無菌貯留槽に移します。修正されたLB培地の190マイクロリットルを一般的なフラットボトム96ウェルプレートの各ウェルに移します。24時間インキュベーション後、シェーカーからマイクロアレイを取り出し、10マイクロリットルの細胞培養液をマイクロアレイから、オフロキサシンとの改質LB培地を含むパーシスターアッセイプレートのウェルに移します。パーシスターエッセイプレートから10マイクロリットルの細胞懸濁液を取り出し、ラウンドボトム96ウェルプレートとマルチチャンネルピペットを使用してPBS溶液の290マイクロリットルで3回連続希釈します。その後、抗生物質を含まない新鮮な寒天プレートに、連続希釈された細胞懸濁液の10マイクロリットルを見つけます。パーシスターアッセイプレートをガス透過性の天井膜で覆い、摂氏37度、250 RPMの軌道シェーカーで6時間インキュベートします。6時間のインキュベーションの後、寒天プレートに連続希釈とスポッティングを繰り返します。寒天プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。次にコロニー形成ユニットまたはCFUsを数えます。抗生物質治療の前と6時間後にCFUレベルを使用して、各井戸のパーシスター分数を計算します。OfX治療前のCFUカウントはまた、大腸菌の生存率に対するオスモリトの影響を評価するのに役立ちます。マイクロアレイスクリーニングから同定されたオスモライトを含む新しい改変LB培地の250マイクロリットルの指数相細胞を25ミリリットルに移す。250 RPM、摂氏37度でフラスコを24時間インキュベートします。24時間後、シェーカーからフラスコを取り出し、250ミリリットルのバッフルフラスコ中の新鮮な改変LB培地の25ミリリットルに細胞培養物250マイクロリットルを移す。25マイクロリットルのOfloxacinストック溶液を細胞懸濁液に加え、フラスコを穏やかに振ってアッセイ培養を均質にします。フラスコを摂氏37度と250RPMのシェーカーでインキュベートします。治療中の1時間ごとに、Ofloxacinを添加する前の時点を含め、フラスコから1ミリリットルのアッセイ培養液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、それを17,000回Gで3分間遠心分離する。950マイクロリットルの上清を取り除き、950マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗います。最終洗浄後、細胞ペレットを100マイクロリットルのPBS溶液で再懸濁する。細胞懸濁液を10マイクロリットルにして、96ウェルラウンドボトムプレート内の90マイクロリットルのPBSで6回連続して希釈します。抗生物質フリー寒天プレートに希釈された細胞懸濁液の10マイクロリットルを見つける。検出の限界を高めるには、新鮮な寒天プレートに残りの90マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートします。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートし、CFUsを数えます。OFX処理前後の細胞培養のCFUレベルを決定するために使用される寒天プレートの代表的な画像をここに示す。最初の列は制御グループです。第2列は、100ミリモル硝酸ナトリウムで培養した細胞を有し、第3列には、60ミリモルの硝酸ナトリウムで培養した細胞が含まれている。簡単にするために、ここで焦点を当てているのは2つのオスモリ素だけです。96のウェルプレートでテストされた細胞培養物のプレートとパーシスター分画からのCFUデータのグラフィカルな表現をここに示す。分数を計算するために、パーシスター数は抗生物質治療前に得られた細胞数に正規化した。バイファシスキル曲線を生成するために、細胞を示されたオスモリ酸剤とバッフルフラスコを用いて25ミリリットルの修飾LB培地で24時間培養し、パーシスター列挙のためにパーシスターアッセイフラスコに移した。このプロトコルを試みるとき、寒天プレート上の細胞を見つけることは労働集約的であり、焦点を必要とすることに注意してください。ステップ中のエラーは、テストされている条件間でクロスコンタミネーションにつながる可能性があります。したがって、実験の前に複数のサンプルを同時に見つける練習が重要です。このプロトコルに従って、薬剤パネルおよび変異細胞ライブラリーをスクリーニングして、持続性への影響を調べることができる。このスクリーニングにより、細菌の持続性に大きな影響を与える多数のオスモリトおよびPS条件を同定しました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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細菌の持続性に及ぼす影響を解明するための化学化合物のハイスループットスクリーニング

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