Name: ゼノプス胚細胞由来粘膜上皮上オルガノイド:生成、培養、高解像度ライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶXenopus laevis胚由来深層外胚葉細胞を用いた粘膜上皮オルガノイドの生成と培養法。24時間で成熟し、共焦点顕微鏡による高解像度ライブイメージングで細胞遷移と上皮形成の動態を追跡できます。

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キム・ラボとランス・デイビッドソンのメンバーのコメントとサポートに感謝します。この研究は、基礎科学研究所(IBS-R0250Y1)からHYKにヤングサイエンティストフェローシップによって支援されました。

動物の使用と実験プロトコルは、基礎科学研究所(IBS 18-01)および韓国先端科学技術研究所(KA2017-22)の機関動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 胚
<ol><li>標準的な手順を使用してX.laevis胚を取得する:手動で刺激された雌のカエルから卵を収集し、体外受精18、19を行う。</li>
	<li>pH 819で1/3x修飾バースの生理食布(MBS;以下の1X MBSのレシピを参照)で2%システインで約5分間穏やかな攪拌を有する受精胚を脱ゼリーする。</li>
	<li>ライブイメージングの任意のステップ:特定のタンパク質を蛍光的に標識し、オルガノイド内のそれらのダイナミクスを観察するには、セクション5に進みます。</li>
	<li>(オプション)オルガノイド内の表面的な外胚細胞の汚染を監視するには、ステージ914で胚の頂端表面にNHS-ローダミンを付ける。1 mg/mL NHS-ローダミンで1mg/mLの胚を1/3x MBS(pH 9.0)で30分間、穏やかな栄養でインキュベートする。1/3x MBSで満たされたペトリ皿に15分間移して胚を3回洗います。</li>
	<li>ステージ10の最初の兆候が検出されるまで、好ましい温度(14〜26°C)で1/3x MBSで胚を培養する(すなわち、花見でのブラストオレの周りの暗い色素細胞の出現)。</li>
</ol>2. 微小手術用具、溶液、培養器の調製
<ol><li>マイクロサージャリー20のための外科グレードの鉗子とヘアツール(ヘアループとヘアナイフ)のペアを含む必要なツールを準備します。</li>
	<li>胚用の培養培地を準備する:1X MBSはNaCl(88 mM)、KCl(1mM)、NaHCO 3(2.4 mM)、MgSO 4(0.82 mM)、Ca(NO3)2(0.33mM)、CaCl2(0.41m)、ヘペス(10mM)で作られています。 10 M NaOH で pH を 7.4 に調整します。 注:オプション:pHを示すためにフェノールレッドの滴を追加します。</li>
	<li>胚組織およびオルガノイドのための次の培養培地を準備する:アミ(DFA)21のためのダニルチクの新鮮な1%抗生物質および抗ミコティック溶液を補充した。NaCl(53 mM)、Na2CO3(5mM)、グルコン酸カリウム(4.5mM)、グルコン酸ナトリウム(32mM)、CaCl2(1 mM)、MgSO4(1mM)でDFAを調製します。 粒状のビシンでpHを8.3に調整します。フィルターDFA(0.2 μmボトルトップフィルター)、アリコート、-20 °Cで保存します。</li>
	<li>上記のレシピを使用して、CaCl2 とMgSO4を省略して、外因性から深い細胞を分離するためのカルシウムおよびマグネシウムフリーDFAを準備します。アリコートと20°Cで保管してください。</li>
	<li>胚細胞凝集用の非接着PCRチューブを用意します。<ol>
<li>単離した胚細胞の自発的な凝集を誘導するために、ラウンド底PCRチューブを1%BSA(蒸留水100mLで1g)の200 μLで一晩または室温で2時間コーティングして非接着PCRチューブを調製します。各チューブは、1つのオルガノイドを組み立てるために使用されます。</li>
		<li>BSAコーティングPCRチューブをDFAで3回リンスし、残留BSAを除去します。</li>
		<li>PCRチューブに200 μLのDFAを充填します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 深部外皮細胞の分離
<ol><li>ステレオスコープの下でヘアツールを使用して、初期段階10に達する胚を選択して収集します。</li>
	<li>使い捨て可能な移管ピペットを使用して、選択した胚をDFAで満たされたペトリ皿に移す。</li>
	<li>胚の動物側を破壊することなく、植物側から鋭い鉗子を使用して胚のビテリン膜を取り除く。 注意:胚を空気にさらさないように注意してください。溶液に気泡を導入したり、胚を表面に持ち込んだりすると、胚が破裂する。</li>
	<li>動物のキャップを分離するには、動物側の胚を上に置きます。</li>
	<li>切除する動物キャップの程度を視覚的に推定し、ヘアナイフで動物帽の端に沿って最初の切開を行います。ヘアナイフを外側に引っ張って切り傷を付けます。</li>
	<li>ステップ 3.5 を繰り返して、動物のキャップを切除するための小さな切り傷のチェーンを作成します。</li>
	<li>中皮前駆体の封入を防ぐために、ヘアナイフを使用して動物キャップの厚層のエッジをトリミングします。 注:分離された動物のキャップの治癒と凝集を防ぐために、10分以内に次のステップに進んでください。通常、我々は、複数のオルガノイドを組み立てるために一度に5〜10の動物の帽子を分離します。</li>
	<li>動物キャップから深い外因性細胞を分離するには、切除された動物のキャップを、使い捨て可能な移動ピペットでカルシウムおよびマグネシウムフリーのDFAで満たされたペトリ皿に移します。移動中に気泡を発生しないように注意してください。</li>
	<li>ヘアツールを使用して、次のステップのための十分なスペースを維持するには、動物側を上に向けて動物のキャップを配置し、他の外植から寛大な距離を維持します。</li>
	<li>5~10分待ってから、ステレオスコープの下で外植を監視します。暗色顔面層の端から深い細胞が緩んだら、ステレオスコープの下でヘアナイフを使用して、明るい色の深い外層細胞から表面層を持ち上げ始める。</li>
	<li>端から始めて、表面的な層をヘアナイフで慎重に取り外す(剥がす)。</li>
	<li>深い外界細胞を最小吸引(10\u201215 μL)で収集し、次のステップで凝集媒体に転送されるカルシウムおよびマグネシウムフリーDFAの量を制限します。 注:剥離された表面的な細胞は、残りの深い外異性細胞を汚染することを防ぐためにメディアから除去することができます。</li>
</ol>4. 粘膜上皮オルガノイドの生成
<ol><li>収集した深い外皮細胞を、200 μLのDFAを含む非粘着性PCRチューブに移します。培地を穏やかにピペット(2\u20123回)し、転化した細胞をPCRチューブに分散させます。 注: 時間のポスト集約 (hpa) として指定されたタイミングは、このステップから始まります。得られたオルガノイドのサイズは、PCRチューブに添加された深い外起細胞の数によって制御される。1つ以上の動物のキャップからの深い外界細胞は、オルガノイドの所望の大きさに応じて使用することができる。</li>
	<li>PCR チューブを閉じます。PCRチューブを直立に保ち、底部で自発的な凝集を誘発します。</li>
	<li>ステレオスコープの下で集約プロセスを監視します。細胞は通常、1時間以内にPCRチューブの底部に集まり、サイズに応じて2〜3時間以内に球状の凝集体に組み立てられます。</li>
	<li>粘液性上皮オルガノイドの開発中に生画像化または薬物検査を行うために、2hpaで凝集体を収集し、採取中に凝集体に損傷を与えることを避けるために、拡大された先端(滅菌はさみで切断)を取り付けた200μLピペットを使用して凝集物を収集する。</li>
	<li>培養中の粘膜上皮オルガノイドに凝集体を開発できるようにするには、5 hpaのPCRチューブから球状の凝集体を収集し、DFAで満たされたペトリ皿に移します。</li>
	<li>他の集約から遠く離れた位置に集約を配置して、融合を防ぎます。因子を加えずに室温で培養した24時間以内に、成熟した粘膜上皮オルガノイドは、分化した上皮の表面を覆う繊毛を叩く作用で回転することが観察できる</li>
</ol>5. (オプション) オルガノイドの開発の高解像度ライブイメージング
<ol><li>マイクロインジェクション用のmRNAを準備します。<ol>
<li>オルガノイド形成の初期段階で起こる上皮化を可視化するために、上皮特異的なゾヌラオクルデンタンパク質-1(ZO-1)のmRNAを調製し、pCS2-ZO1-RFPおよびpCS2-mem-GFPプラスミド(ランス・デビッドソンからの贈り物)を増幅することによって細胞膜を概説する。</li>
		<li>プラスミドDNAを抽出して直線化し、次にSP6/T7インビトロ転写キットを使用してキャップされたmRNAを転写します。</li>
		<li>転写されたmRNAをアリクォートし、-80°Cで保存する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>受精胚にmRNAをマイクロインジェクトする<ol>
<li>受精胚を1x MBSの3%Ficollに入れる。</li>
		<li>マイクロローダーチップを使用してmRNAの3〜4 μLを引き込まれたガラスの針(内径10\u201230 μmの長くて細かいテーパー針チップ)にロードします。</li>
		<li>マイクロインジェクターに針を取り付け、マイクロインジェクションのためのmRNAの一定の容積を提供するために時間と圧力を調整する。</li>
		<li>動物の極の尖体表面のすぐ下にmRNAを注入する。皮質の膨張によって引き起こされる明確な淡色の円形のパッチは、マイクロインジェクション時に見える。</li>
		<li>注射した胚を1/3X MBSに移し、9.5の段階に培養する。</li>
		<li>蛍光ステレオスコープ(GFP(488/510)およびRFP(532/588)の励起/発光設定)の下で蛍光標識された胚を収集します。</li>
		<li>ステップ 1.3 に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オルガノイド(セクション3および4)を、所望の発達段階まで組み立てて培養する。</li>
	<li>ライブイメージングを実行します。<ol>
<li>シリコングリースを使用して、カバーガラスをカスタムミルアクリルチャンバーに接着して、ガラス底イメージングチャンバーを準備します。 注:密封室は、培養メディアの漏洩を防ぐために。</li>
		<li>イメージングチャンバーにDFAを充填します。</li>
		<li>鉗子を使用して容器から1つの六角形透過電子顕微鏡(TEM)グリッド(75メッシュ)を選び、グリッドの端に少量のグリースを適用します。 注: メッシュのサイズは、集計がグリッド上に配置されるように、集計の直径よりも小さくする必要があります。</li>
		<li>TEM グリッドを撮像チャンバの底面に固定するために軽く押し下げます。</li>
		<li>凝集体を撮像チャンバーに移し、グリッド内に配置します。 注: グリースの横に集約を配置しないようにします。実験を通して、凝集体は物理的な圧縮を防ぐためにチャンバの底部に接触することなくTEMグリッドに座るべきである。</li>
		<li>イメージングチャンバをDFAで満たし、カバーガラスとグリースで密封します。 注:チャンバは、イメージング中の乱流や動きを防ぐために、気泡なしで気密にする必要があります。</li>
		<li>粘膜上皮オルガノイド形成の進行に従うために、共焦点顕微鏡を用いて(2hpaから)凝集物のタイムラプスzスタック画像を収集する。 注:通常、動的な細胞の挙動に従うために20Xの目的を使用して15分ごとに約120 μmの厚さのZスタックを収集しますが、これらの仕様は実験の目的のために最適化する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. (任意)固定および免疫染色によるオルガノイドの開発をイメージング
<ol><li>オルガノイドを固定溶液で満たしたガラスバイアルに移すことによって、開発の望ましい段階でオルガノイドを固定します。 注: 完全な固定を確実にするために、サンプルの 20 倍の固定ソリューションのボリュームを追加します。特に断らない限り、ヌテエーターで以下のプロセスを実行します。一般に、オルガノイドは、PBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定されています。しかし、特定のタンパク質を検出するために異なる固定剤が必要になることがあります。例えば、PBSでは4%PFAを用いて、F-アクチンおよびアセチル化チューブリンを検出しました。インテレクチン(ITLN)およびZO-1を検出するために、オルガノイドは氷冷デントの溶液(4:1メタノール:ジメチルスルホキシド)で一晩-20°Cで固定されています。 デントの固定オルガノイドは、洗浄前に逐次脱水する必要があります(ステップ6.3)。抗体インキュベーションおよび洗浄の持続時間は、特定のニーズに合わせて最適化できます。</li>
	<li>オルガノイドを室温(RT)で15分間、または4°Cで一晩固定します。</li>
	<li>RTで15分間PBST(0.1%トリトンX-100のPBS)で3回洗浄します。</li>
	<li>ブロック非特異的結合をPBST(PBSGT)で10%ヤギ血清で1時間RTで行う。</li>
	<li>一次抗体(1:200)をPBSGTで一晩4°Cでインキュベートする。</li>
	<li>RTで15分間PBSTで3回洗浄します。</li>
	<li>2次抗体(1:200)をPBSGTで一晩4°Cでインキュベートする。</li>
	<li>RTで15分間PBSTで3回洗浄します。</li>
	<li>固定および免疫染色されたオルガノイドをイメージングチャンバーに移し、共焦点イメージングを進めます。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

X.ラエビス胚の深部外胚細胞から生成された粘膜上皮オルガノイドは、体外における多能性前駆物質の上皮化および分化を研究するための強力なツールである。インビトロ臓器新生13および粘膜上皮15、17、22の開発に使用される広く採用されている動物キャップアッセイ16とは対照的に、このプロトコルで提示された深い外発性オルガノイドは、表面上皮14の組織組織駆動再生段階を監視する明確な機会を提供する。約2hpaで、新たに生成されたZO-1陽性上皮細胞(図2)は、オルガノイドの有端表面に現れ始め、組織が固まるか、またはコンプライアンスを低下させるとオルガノイド全体を覆うように集団を増加させる。粘液産生ゴブレット細胞の上皮の再生とその後の系統指定は、1日以内に化学的に定義された培養培地で自発的に進行する。これらの急速に発達する粘膜上皮オルガノイドは、上皮再生の進行段階で、動的細胞の挙動をリアルタイムで、高解像度で調べるプラットフォームを提供する。また、粘液性上皮の発達、恒常性、および関連疾患2、9、23の間に生じる根本的な疑問の調査を可能にする。特に、オルガノイド14で同定された上皮性ゴブレット細胞前駆体への移行中の深部前駆細胞の機械的感受性は、粘液分泌性のゴブレット細胞が過剰または過産である異常な基底分化に関連する呼吸器疾患をリンクさせるのに役立つ可能性がある23。
このプロトコルは、これらのオルガノイドを生成するための簡単なアプローチを提供していますが、実験で成功するためのいくつかの重要なステップがあります。動物キャップからの深い外因性細胞の分離中に表面上皮細胞の汚染を防ぐために、ステレオスコープの下でカルシウムおよびマグネシウムフリーDFAに入れられた動物キャップを監視し、動物帽の暗色色顔料表層の分離を開始する適切なタイミングを検出する必要があります。組織がカルシウムおよびマグネシウムフリーDFAにあまりにも長く保たれている場合、組織全体が解離し、深い外皮凝集体では深い細胞と表面的な細胞を区別することは不可能であろう。深い外胚体凝集体に表面細胞がないことを確認するために、マイクロサージャリーの前に、胚の頂端表面にNHS-ローダミン(ステップ1.414)を蛍光的に標識することをお勧めします。これにより、結果として得られたオルガノイドに存在する場合、表面細胞を容易に同定することができます。上皮再生は組織力学14によって調節されるため、自己組織化オルガノイドに対する意図しない力の発生を避けるために不可欠である。特に、ライブ凝集体の撮像窓との自由な接触を可能にするため、ライブイメージング中に、ライブイメージングチャンバのガラス底面との接触を避けることを提案する。このin vitro-粘液性上皮の培養された自己組織化された3Dモデルは、上皮の再生およびゴブレット細胞の系統指定の間に生じる基本的な質問に答える難解なツールとして機能する。

粘膜上皮の損傷、感染、および疾患は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および原発毛様体異胞体ジスキネジー1、2、3、4などの肺障害にしばしば見られる粘液の産生およびクリアランスの障害と関連している。オルガノイド技術の最近の進歩は、例えば、粘液性上皮の再生を再現する気管圏と呼ばれる基底細胞由来の肺オルガノイドが、治療上電位1、5、6を有する有望なモデルとして生じる。しかし、その使用は、定義された培養条件の欠如とオルガノイド産生における低効率の一部で、現在限られている。ヒト気道およびカエル表皮における粘膜上皮は、組織形態、細胞組成、及びその機能7、8、9、10、11、12において著しく類似している。両生物とも、粘膜上皮は粘液と抗菌物質を分泌して第一線の防御を提供し、繊毛の同期作用を通じて有害な粒子および病原体を取り除く。
ここでは、ゼノプス・ラエビス胚13,14の多能性前駆体を用いて粘膜上皮オルガノイドを生成する簡単なプロトコルについて説明する。以前は、外因性増殖因子と細胞外マトリックスがない場合、初期の胃圏期外皮から微小単離された深部細胞が自発的に凝集体に集まり、その表面上の上皮を再生し、24時間以内に多分化および他の補助細胞を介して粘膜上皮に成熟することを報告した。急速な発展に加えて、このプロトコルは、多能性の深い外胚細胞の上皮性ゴブレット細胞前駆細胞への移行に直接アクセスする明確な機会を提供し、無傷の胚および外胚(動物キャップとも呼ばれる)からは利用できない破壊された上皮14の再生ステップを再現する。生成されるオルガノイドの数と大きさは、ゼノプス胚からの出発物質を制御することによって高効率でスケーラブルである。浮遊培養中のオルガノイドは、高解像画像、機械的検査、薬物治療、および遺伝的特徴付け14を含むさらなる分析のために、所望の段階で容易に選別および伝達することができる。この胚細胞の表面上の上皮の自発的な組織力学主導の再生は、粘膜上皮組織性オルガノイドをもたらし、粘膜上皮の生物学を研究するための新しい3次元(3D)モデルを提供する。

<table><tbody><tr><td><ストロング>機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュアルステージガラスマイクロピペットプーラー</td><td>成重</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>ピコリットルマイクロインジェクター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>Dumont #5</td><td></td></tr><tr><td>ヘアナイフ</td><td></td><td>リファレンス (Kay, B.K.;Peng, H.B., 1991)</td><td></td></tr><tr><td>ヘアループ</td><td></td><td>リファレンス (Kay, B.K.;Peng, H.B., 1991)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG注射</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン</td><td>Sigma</td><td>cg10-10vl</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10M水酸化ナトリウム</td><td></td><td>Σ72068</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td></td><td>Σ C3881</td><td></td></tr><tr><td>硝酸カルシウム</td><td></td><td>Σ C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Σ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td></td><td>Σ 230391</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Σ</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>重曹</td><td>シグマ</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S9625</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム試薬グレード、97%、粉末-25g</td><td>シグマ</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>デゼリー溶液</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-システイン塩酸塩一水和物</td><td>シグマ</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム水酸化物 10M</td><td>シグマ</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>フィコール溶液</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィコール</td><td>シグマ</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>DFA 溶液</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>0.22mmフィルター</td><td>ミリポア</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質抗真菌溶液</td><td>シグマ</td><td>A5955</td><td></td></tr>ビ<tr><td>シン</td><td>シグマ</td><td>B3876</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C3881</td><td></td></tr>硫酸<tr><td>マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>グルコン酸カリウム</td><td>シグマ</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>222321</td><td></td></tr><tr><td>グルコン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>G9005</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mRNA in vitro 転写</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP6/T7 in vitro転写キット</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mRNAマイクロインジェクション</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ</td><td>ハーバード装置</td><td>GC100-10</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフマイクロローダーピペットチップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A25547</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>シグマ</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>PCRチューブコーティング</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>PCRチューブSSI</td><td></td><td>SSI-3245-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カスタムミルドアクリルチャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス24mmX50mm</td><td>デュラン</td><td>B01_001650</td><td></td></tr><tr><td>SPI六角形TEMグリッド、ニッケル金メッキ(50メッシュ)</td><td>SPI</td><td>275HGN-XA</td><td></td></tr><tr><td>SPI六角TEMグリッド、ニッケル金メッキ(75メッシュ)</td><td>SPI</td><td>2775GN-XA</td><td></td></tr><tr><td>シリコーングリース</td><td>信越</td><td>HIVAC-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20mlスクリュートップキャップバイアル</td><td>ウィートン</td><td>WH.986580</td><td></td></tr><tr><td>2mlスクリュートップキャップバイアル</td><td></td><td></td><td></td></tr>ベン<tr><td>ジルアルコール</td><td>シグマ305197</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベンジル安息香酸シ</td><td>グマ</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sgima</td><td>D4540</td><td></td></tr>グル<tr><td>タルアルデヒド10%EMグレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清ジャク</td><td>ソン</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Paraforlamdehyde</td><td></td><td>Sigma P6148</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>LPS溶液</td><td>CBP007B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次抗体 (1:200)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセチル化チューブリン</td><td>Sigma</td><td>クローン 6-11B-1</td><td></td></tr><tr><td>Itln1</td><td>Proteintech</td><td>11770-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>ケラチン</td><td>発生研究 ハイブリドーマバンク</td><td>1h5</td><td></td></tr><tr><td>ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS2-mem-GFP</td><td></td><td>ランス・デビッドソン</td><td></td>博士からの贈り物</tr><tr><td>pCS2-ZO1-RFP</td><td></td><td>ランス・デビッドソン</td><td></td>博士からの贈り物</tr></tbody></table>

ゼノプス胚細胞由来粘膜上皮上オルガノイド:生成、培養、高解像度ライブイメージング

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

粘膜上皮は、粘液産生および繊毛介在性クリアランスの作用を通じて異物を除去することにより、第一の防御線を提供する。粘膜上皮の多くの臨床的に関連する欠陥は、体内の深部で起こると推測される。ここでは、 ゼノプス・ラエビス 胚から微小外科的に単離された多能性前駆物質から生成された粘液性上皮の難解な3Dモデルを紹介する。粘液性上皮器官は、深い外因性細胞から新たに生成された上皮で覆われ、後に24時間以内に固有の表皮と区別できない明確なパターン多色細胞、分泌細胞、粘液産生ゴブレット細胞で飾られている。オルガノイドの頭蓋表面に出現する間葉から上皮への動的細胞転移の完全な配列は、高解像度のライブイメージングによって追跡することができる。これらのインビトロ培養、自己組織化粘液性上皮オルガノイドは、生成、定義された培養条件、数とサイズの制御、および分化上皮の再生中の生画像への直接アクセスを有する粘液性上皮の生物学を研究する際に明確な利点を提供する。

この標準化されたプロトコルは、培養14の24時間以内に初期の胃管ステージX.laevis胚から単離された多能性前駆体から粘液性上皮オルガノイドを生成する。回収された深い外皮細胞は自己集合性を持たないPCRチューブに凝集体を形成し、表面上皮化およびゴブレット細胞分化を受ける。凝集体の新上皮化表面は、内細胞(例えば、多重化および他の付属細胞)をインターカロ化するために生体内に見られる天然の上皮と同様の基質を提供し、粘膜上皮オルガノイドを形成するために発達する(図1A,B)。凝集後24時間以内に、自己組織化粘膜上皮オルガノイドは、オタマジャクシの表皮と区別できない成熟した表皮を再生する。オルガノイドは、完全に分化した上皮(ケラチン)、粘液分泌性ゴブレット細胞(ITLN)、多相培養細胞(アセチル化チューブリン)、および小分泌細胞(ピーナッツ凝集剤、PNA)を含む(図1C)。
免疫染色を用いて異なる細胞型の発達を確認することに加えて、オルガノイドの発達のダイナミクスは、ライブイメージングに続くことができる(図2A)。オルガノイド形成初期に出現する上皮化を調べるために(図1B)、蛍光タグ付きタイト接合タンパク質(ZO-1-RFP)および膜局所タンパク質(mem-GFP)を発現させることにより、胚の標識を行った。デュアルラベルを使用すると、上皮化中にZO-1陽性の密接合形成のシーケンシャルステップをマークし、定量的に分析することができる(図2)。例えば、上皮化の異なる段階(0分)における細胞(図2B、緑色)については、細胞-細胞接着の領域によっては、ZO-1のパンクタが散乱している(図2B、緑色の矢印)。これに対し、他の領域は完全に組み立てられた連続した ZO-1 式を持っています (図 2B、黄色の矢印)。時間が経つにつれて、パンクタは合体し、隣接するタイトな接合部(図2B、緑の矢印)を形成するために接続し、連続したタイトな接合は、細胞分裂中であってもその形態を維持します(図2B、黄色の矢印)。タイトな接合が成熟すると、細胞はオルガノイドの補助面に沿って表面に動的に出入りする(図2C,D)。さらに、分化オルガノイドの表面(図2B、色分けされた細胞)上で細胞を時空間的に追跡することで、個々のパンクタから連続した密接点、細胞細胞境界、オルガノイド内の細胞集団のサブセットに至るまで、多スケール分析が可能です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig01.jpg"> 図1:粘膜上皮オルガノイドの生成 (A) X.ラエビス胚から深い外胚集合体集合体を組み立てるプロトコルを示す模式図である。(B)多能な深部外外膜細胞に由来する粘膜上皮オルガノイド形成モデルの模式図(断面図)。表面配置された細胞は上皮細胞に移動し、ゴブレット細胞に分化する。毛状細胞、分泌細胞、およびヨウノサイトを分化して、表面に放射状に補間し、成熟した表皮を再生する。(C)ITLN(粘液産生ゴブレット細胞)、アセチル化チューブリン(毛状細胞)、PNA(小分泌細胞)、ケラチン(上皮細胞)の24hpa(上パネル)およびオタポポ表皮(下パネル)に対する免疫化粘液性上皮の最大z投影。スケールバー= 30 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig02.jpg"> 図2:オルガノイドの現像の生画像化 (A)生きたオルガノイド用のイメージングチャンバーの模式図(スケールしない)。(B) 2.5hpaからZO-1-RFPおよびmem-GFPを発現する深い外層細胞集合体から集められた共焦点のタイムラプスシーケンス。スケールバー= 20 μmセルは、時間の経過に従って追跡するための擬似色です。緑色のセルは、徐々に開発するZO-1陽性接着(緑色の矢印)と、時間の経過とともに連続したZO-1陽性接着(黄色の矢印)を維持する細胞接着状態が異なります。(C, D)ZO-1-RFP発現深部外界細胞凝集体のタイムラプス共焦点像は、地表(C、黄色星)に移動し、凝集体(D、青星)の内部を移動する放射状のインターカリング細胞を示す。スケールバー= 10 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ゼ ノプス・ラエビス 胚から分離された深い外胚細胞から粘膜上皮オルガノイドを開発するための簡単なプロトコルについて述べている。多能性前駆物質は上皮性ゴブレット細胞前駆体を再生し、オルガノイドの表面上の細胞転移の開始および進行のライブ追跡を可能にする。

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

粘膜上皮は、私たちの体の内臓をラインし、外国の粒子をクリアすることによって防御の第一線を提供します。このプロトコルにより、24時間で胚細胞由来粘膜上皮オルガノイドを生成することができる。我々の方法の主な利点は、オルガノイドの表面上の細胞転移の生きた進行を監視できることである。この開発オルガノイドのための再現性、スケーラブルで迅速なプロトコルは、研究者が粘膜上皮の生物学のための基本的な質問に対処することを可能にします。まず、刺激された雌のカエルから卵子を手動で採取し、体外受精を行うことによってX.Laevis胚を得る。受精胚を2%システインで穏やかな攪拌で脱ゼリーし、約5分間、3分の1のX修飾バースの生理食動物に入る。ステージ10の最初の兆候が検出されるまで好ましい温度で3分の1のXMBSで胚を培養し、例えば、植生図でのブラストオレの周りの暗い色素細胞の出現など。ステレオスコープの下でヘアツールを使用して、初期段階10に達する胚を選択して収集します。選択した胚を使い捨て可能な移写ピペットでDFAで満たされたペトリ皿に移します。次に、胚の動物側を破壊することなく、植物側から鋭い鉗子を使用して胚のビテリン膜を除去する。動物のキャップを分離するには、動物側の胚を上に置きます。切除する動物帽の程度を視覚的に推定し、ヘアナイフで縁に沿って最初の切開を行い、ナイフを外側に引っ張って切り取ります。このプロセスを繰り返して、動物のキャップを切除するための小さな切り傷のチェーンを作成します。中皮前駆体の封入を防ぐために、ヘアナイフを使用して動物キャップの厚層のエッジをトリミングします。動物キャップから深い外因性細胞を分離するには、切除された動物のキャップを、使い捨て可能な移動ピペットでカルシウムとマグネシウムフリーのDFAを充填したペトリ皿に移します。動物の帽子を上に向けて、他の外植から寛大な距離を維持するように置きます。5~10分待ってから、ステレオスコープの下で外植を監視します。緩んだ深部細胞が暗色色の表面層の端から放出されたら、明るい色の深い外層細胞から表面層を持ち上げ始める。慎重にエッジから始めて、ヘアナイフで表面的な層を取り外します。その後、できるだけ少ないカルシウムとマグネシウムフリーDFAで深い外発性細胞を収集します。回収した深い外食細胞を、200マイクロリットルのDFAを含む非粘着性PCRチューブに移し、培地を2~3回静かにピペットして移写された細胞を分散させる。チューブを閉じて、底部に自発的な凝集を誘発するために直立を保ちます。ステレオ顕微鏡で凝集プロセスを監視します。細胞は通常、1時間以内にPCRチューブの底部に集まり、サイズに応じて2〜3時間以内に球状の凝集体に組み立てられます。粘液性上皮オルガノイドの開発中にライブイメージングまたは薬物検査を行うために、拡大された先端を取り付けた200マイクロリットルピペットを使用して2時間の凝集後の凝集体を収集する。凝集体が培養中の粘膜上皮オルガノイドに発展することを可能にするために、PCRチューブから5時間の凝集後に回収し、DFAで満たされたペトリ皿に移します。凝集体を互いに離して配置して、融合を防ぎます。室温で培養した24時間以内に、因子を加えずに、分化した上皮の表面を覆う拍動繊毛による成熟粘膜上皮オルガノイドの回転が観察される。カバーガラスをシリコングリースでカスタムミルドアクリルチャンバーに接着し、チャンバーを密封して培養培地の漏れを防ぎ、イメージングチャンバーをDFAで満たして、ガラス底イメージングチャンバーを準備します。鉗子を使用して1つの六角形の透過電子顕微鏡またはTEMグリッドを拾い、グリッドの端に少量のグリースを適用します。TEM グリッドを撮像チャンバの底面に固定するために軽く押し下げます。凝集体を撮像チャンバーに移し、グリッド内に配置します。チャンバーにDFAを充填し、カバーガラスとグリースで密封します。粘膜上皮オルガノイド形成の進行に従うために、共焦点顕微鏡を用いて凝集体の時間経過zスタック画像を収集する。粘膜上皮オルガノイドは、初期の胃管ステージX.Laevis胚の多能性前駆体から生成された。オルガノイドは、完全に分化した上皮、粘液分泌性ゴブレット細胞、多分泌細胞および小さな分泌細胞を含むオタマジャクシの表皮と区別がつかない成熟した表皮を有する。オルガノイドの発達のダイナミクスは、ライブイメージングが続いた。オルガノイド形成の初期段階で出現する上皮化を調べるために、胚は蛍光タグ付きのタイトな接合タンパク質および膜局所性タンパク質で標識された。二重標識により、ZO-1正の密接合形成のシーケンシャルステップをマークし、上皮化中に定量的に分析することができます。細胞-細胞接着のいくつかの領域は、上皮化の異なる段階でZO-1の穿刺を散乱している。これに対し、他の領域では連続した ZO-1 式が完全に組み立てられています。時間が経つにつれて、パンクタは合体し、細胞分裂中でも形態を維持する連続したタイトなジャンクションを形成するために接続します。タイトな接合が成熟すると、細胞はオルガノイドの有端面に沿って表面に動的に出入りします。多スケール解析は、分化オルガノイドの表面上で細胞を時空間的に追跡することによって可能である。このプロトコルを試みるとき、分離動物の帽子の暗色顔面を上に置き、ステレオスコープの下で監視することを忘れないでください。カルシウム/マグネシウムフリーDFA培地において適切なタイミングで動物キャップの表面層を分離することが重要です。この簡単なプロトコルは、動的細胞の挙動だけでなく、粘液性上皮を調節する分子および物理的メカニズムを研究するための便利な方法を提供します。

mucociliary-epithelial-organoids-from-xenopus-embryonic-cells

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生物学

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ゼノプス胚細胞由来粘膜上皮上オルガノイド:生成、培養、高解像度ライブイメージング

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