Name: グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぼう、バイオルミネセンスE. coliを用いたマウス新生児敗血症モデルの構築とリアルタイムイメージング手法。細菌動態と炎症応答の相関解析により、治療戦略開発への応用が可能です。

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この仕事は、C.M.Rへの機関資金によって支えられた。

<ol><li>Qazi, S. A., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+a+major+global+public+health+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: a major global public health challenge.</a> Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).</li>
<li>Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-onset+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Early-onset neonatal sepsis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).</li>
<li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+compromise+protective+immunity+in+a+mouse+model+of+Gram-negative+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis.</a> Infections and Immunity. , (2019).</li>
<li>Schrag, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Early-Onset+Neonatal+Sepsis%2C+2005+to+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014.</a> Pediatrics. 138 (6), 20162013(2016).</li>
<li>Stoll, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+onset+neonatal+sepsis%3A+the+burden+of+group+B+Streptococcal+and+E.+coli+disease+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues.</a> Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).</li>
<li>Weston, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+invasive+early-onset+neonatal+sepsis+in+the+United+States%2C+2005-2008%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+and+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008.</a> Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).</li>
<li>Hornik, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+late+onset+sepsis+in+very-low-birth-weight+infants+from+a+large+group+of+neonatal+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Human+Development%22%5BJournal%5D)">Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units.</a> Early Human Development. , Suppl 2 69(2012).</li>
<li>Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+an+international+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%3A+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: an international perspective.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).</li>
<li>Kraft, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+macrophages+express+elevated+levels+of+interleukin-27+that+oppose+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses.</a> Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).</li>
<li>Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune responses in neonates.</a> Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).</li>
<li>Gleave Parson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+myeloid-derived+suppressor+cells+are+a+source+of+elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+and+compromise+control+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection.</a> Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).</li>
<li>Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+adaptive+immunity+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neonatal adaptive immunity comes of age.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).</li>
<li>Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+L-selectin+and+CD11b+on+neutrophils+of+adults+and+neonates+during+the+first+month+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life.</a> Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).</li>
<li>Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+antigen-presenting+cell+function+in+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective antigen-presenting cell function in human neonates.</a> Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).</li>
<li>Le Garff-Tavernier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NK+cells+display+major+phenotypic+and+functional+changes+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span.</a> Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).</li>
<li>Weinberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+reduced+responsiveness+of+neonatal+neutrophils+to+distinct+chemoattractants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants.</a> Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewss+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).</li>
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<li>Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+of+Tumor+Cell+Motility+in+the+Tumor+Microenvironment+Context%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context.</a> Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).</li>
<li>Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+new+insights+into+metastasis+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).</li>
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<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-alpha+inhibitor+protein+administration+improves+survival+from+neonatal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice.</a> Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).</li>
<li>Pluschke, G., Pelkonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+factors+in+the+resistance+of+newborn+mice+to+K1+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Patho%22%5BJournal%5D)">Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection.</a> Microb. Patho. , 93-102 (1988).</li>
<li>Mancuso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interleukin+12+in+experimental+neonatal+sepsis+caused+by+group+B+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci.</a> Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).</li>
<li>Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A-neutralizing+monoclonal+antibody+protects+neonatal+mice+against+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus.</a> Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).</li>
<li>Andrade, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2-induced+IL-10+production+impairs+neutrophil+recruitment+to+infected+tissues+during+neonatal+bacterial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis.</a> Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示する利益相反を持っていません。

新生児マウスで細菌敗血症を誘導する当社の肩甲膜感染モデルは、細菌病原体の縦方向の広がりをリアルタイムで研究する新しい方法です。インビタルイメージングは、新生児における細菌の播体拡散をリアルタイムで探索する機会を提供します。これは、細菌の普及の運動学を理解し、病気の適切な段階で宿主の応答および損傷をさらに研究するために重要である。マウスの子犬は、細菌の接種の皮下、肩甲骨下注射を投与される。この注射技術は、注射部位内の精度が低く、尾静脈や腹腔内感染などの他の一般的に使用される代替手段よりも簡単です。これは、子犬の小さなサイズを考えると重要です。生体内イメージングにより、動物を犠牲にすることなく、末梢組織や中枢神経系への細菌増殖と普及の縦断評価が可能になります。同様のイメージング手法と技術が癌生物学と転移の研究のために使用されている20,21.さらに、新生児ラット22における大腸菌感染時の生物発光イメージングの使用を挙げている別の研究では、ここでは新生児マウスに...

細菌敗血症は、感染からの十分な保護を提供しない生後の最初の日にユニークな免疫プロファイルを示す新生児にとって重要な懸念事項である1。新生児敗血症は、米国だけで毎年75,000例以上を占める米国の重大な医療問題であり続けています2.これらの感染症を深く研究するためには、ヒト疾患の側面を再現する新しい動物モデルが必要である。我々は、Eシェリヒア大腸菌、O1:K1:H73を用いて新生児マウス感染モデルを確立した。大腸菌は、米国における新生児敗血症の第2の主要な原因であるが、敗血症関連死亡率4、5の大部分を占める。しかし、それは、前期および非常に低い出生体重(VLBW)の赤ちゃんが独立して5と考えられる主な原因である。K1血清型は、新生児6,7における侵襲性血流感染および髄膜炎に最も頻繁に関連している。現在、抗生物質や支援ケア以外の治療法はありません。一方、多くの病原性細菌に対する抗生物質耐性の割合は上昇し続け、治療8で一般的に使用される多数の抗生物質に耐性のある大腸菌の株もある。したがって、新生児における敗血症のメカニズムと宿主応答を研究する方法を作り続けることが不可欠です。これらの結果は、現在の治療と感染結果を改善するのに役立ちます.
新生児の免疫状態は、成人と比較して、触語と機能的な違いの両方によって特徴付けられる。例えば、インターロイキン(IL)-10およびIL-27のような抗炎症および調節性サイトカインの上昇レベルは、臍帯血由来のマクロファージによって産生され、マウス新生児9、10、11の血清中でより大きなレベルで存在することが示されている。これは、成人の対応物10と比較して新生児細胞から頻繁に報告されるIFN-α、IFN-ɣ、IL-12、およびTNF-αの低レベルと一致する。さらに、新生児免疫系は、成人12と比較してTh2および調節性T細胞応答に向かって歪んでいる。好中球、T細胞、B細胞、NK細胞、および単球の増加数も新生児に存在するが、著しい機能的障害を有する。これには、細胞表面マーカーの発現における欠陥および非成熟性13、14、15を示唆する抗原提示が含まれる。さらに、新生児好中球は、化学戦術因子16に移行する能力が著しく欠損している。骨髄由来のサプレッサー細胞(MDSC)は、新生児の上昇レベルでも見られ、最近IL-2711の供給源であることが示されている。MDSC は T 細胞17に対して非常に抑制性が高い。総称して、これらのデータは、感染に対する感受性の増加に役立つ新生児免疫の限界を示している。
新生児敗血症時の細菌の負担の進行と保護宿主免疫応答の解剖を研究するために、我々は新しい感染モデルを開発した。新生児マウスは、3〜4日目の生命において、腹腔内腔または尾静脈に注入することが困難である。我々のモデルでは、3日目または4日目の子犬は、細菌の接種またはPBSを皮下領域に投与する。全身感染が発症し、発光性大腸菌O1:K1:H7を用いて、個々の新生児マウスを縦断的に画像化し、末梢組織における播種された細菌負担に従うことができる。これは、マウス新生児3における敗血症時の細菌の普及の動態を理解するために、生体内画像化を利用する最初の報告されたモデルである。
ここでは、新生児マウス3における敗血症性大腸菌感染症を誘導するプロトコルについて説明する。注射用の細菌接種を調製する方法、病理評価のための組織の採取方法、遺伝子発現解析による炎症マーカーの測定、細菌負担の列挙方法について説明する。また、新生児免疫細胞による細菌殺死の活性化および細菌の定量化に対する発光性大腸菌の使用についても説明する。これらのプロトコルはまた、新生児における他の重要な細菌感染を研究するために適応され得る。ここに示すデータは、翻訳可能な新生児敗血症モデルにおける感染ダイナミクスを理解するための全体的な新しいアプローチを表しています。

<table><tbody><tr><td>1 mL インスリン シリンジ</td><td>Coviden</td><td>1188128012</td><td>接種または PBS 注射</td></tr><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td>組織病理学</td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>Gibco</td><td>LSA1049201</td><td>細菌クリアランスアッセイ</td></tr><tr><td>動物 タトゥー インク ペースト</td><td>ケッチャム</td><td>KI1482039</td><td>動物識別</td></tr><tr><td>動物 タトゥー インク グリーン ペースト</td><td>ケッチャム</td><td>KI1471039</td><td>動物同定</td></tr><tr><td>抗Ly-6B.2マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-781</td><td>細胞単離</td></tr><tr><td>大腸菌 O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7-lux (ルシフェラーゼを発現)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>WVU</td></tr><tr><td>で社内建設E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>R6812</td><td>RNA extration</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Difco Tryptic Soy Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>236950</td><td>細菌増殖</td></tr><tr><td>IL-1 ベータプライマー/プローブ (Mm00434228)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>4331182 Cytokine expression qPCR</td></tr><tr><td>IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4331182</td><td>サイトカイン発現 qPCR</td></tr><tr><td>iQ スーパーミックス</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708860</td><td>リアルタイム定量</td></tr><tr><td>PCR iScript cDNA 合成キット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708891</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>アイソレーション バッファー</td><td>ミルテニー バイオテック</td><td>N/A</td><td>バクテリアクリアランスアッセイ</td></tr><tr><td>IVIS スペクトラム CTおよびリビングイメージ 4.5 ソフトウェア</td><td>パーキン・エルマー</td><td>N/A</td><td>生体内イメージング</td></tr><tr><td>LBブロス、レノックス</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP1427-500</td><td>細菌増殖</td></tr><tr><td>EASYストレーナー(ナイロンバスケット)</td><td>グライナーバイオワン</td><td>542 040</td><td>セルストレーナー</td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>分子デバイス</td><td>N/A</td><td>プレートリーダー</td></tr><tr><td>ペレット 乳棒 モーター</td><td>グレインジャー</td><td>6HAZ6</td><td>組織均質化</td></tr><tr><td>ポリプロピレンペレットPestles</td><td>Grainger</td><td>6HAY5</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Prime Thermal Cycler</td><td>Techne</td><td>3PRIMEBASE/02</td><td>cDNA synthesis</td></tr><tr><td>TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td></td><td>4331182 サイトカイン発現 qPCR</td></tr><tr><td>TriReagent (GTCP)</td><td>Molecular Research Center</td><td>TR 118</td><td>RNA extration</td></tr></tbody></table>

グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

新生児は、生後数ヶ月で表示されるユニークな免疫プロファイルのために細菌敗血症のリスクが高くなります。私たちは、新生児の高い死亡率を担う血清型である 大腸菌 O1:K1:H7の病因を研究するためのプロトコルを確立しました。我々の方法は、感染の進行時に異なる時点で新生児の出生時の生体内画像を利用する。このイメージングは、血液中の細菌の測定、炎症プロファイリング、および組織組織組織病理学によって平行して、敗血症中の感染ダイナミクスを理解するための厳格なアプローチを意味する。現在の報告書では、細菌の負担と疾患の重症度を比較するための2つの感染性接種をモデル化する。我々は、皮下感染が感染後10時間までに感染を広めることにつながることを発見した。24時間までに、血液、肺、およびその他の末梢組織に発光 性大腸菌 の感染が豊富であった。肺の炎症性サイトカインの発現は24時間で有意であり、その後に細胞浸潤および感染性用量で増加する組織損傷の証拠が続く。インビタルイメージングには、いくつかの制限があります。これには、発光シグナル閾値と麻酔中に新生児で生じる可能性のあるいくつかの合併症が含まれます。いくつかの制限にもかかわらず、私たちの感染モデルは、これまで徹底的に調べられていない新生児マウス敗血症中の縦方向感染ダイナミクスを理解するための洞察を提供することがわかりました。このモデルは、初期の間に他の重要な細菌感染を研究するためにも適応できると期待しています。

このプロトコルは新生児マウスで細菌敗血症を誘発し、縦方向のインビタルイメージング、血液中の細菌の列挙、病理の組織学的評価、炎症性サイトカイン発現プロファイルを使用して疾患の経過を研究した。病態の徴候は、低い(2 x 106 CFU)および高い(7 x 106 CFU)の両方に感染した新生児の子犬で、時間の経過とともに大腸菌の接種を観察した。より大きな接種を受けた子犬は、移動性の低下、姿勢の矯正ができないこと、感染後24時間(hpi)までに直立した位置を維持する能力の障害を含む、より顕著な苦痛の兆候を示した。しかし、一部の子犬は他の子犬よりも悪く見えたので、罹患率の範囲がありました。感染直後、1匹の低用量動物が、ベースラインを確立するためにイメージングセッション中にイオブルラン暴露のために死亡した。24 hpiによって、6匹の高用量動物のうち2匹が全身感染に屈した(死亡率は33.3%)。高用量または低用量の接種接種を受けた感染した子犬は、24 hpiでコントロールリッターメイトよりも有意に少ない重量を量った(図1<st...

新生児マウスの生物発光 性大腸菌 O1:K1:H7感染は、著しい肺炎症および肺病理を伴う敗血症感染をもたらす。ここでは、全身性細菌の負担の列挙、炎症プロファイリング、肺組織病理学と並行して縦方向の生体内イメージングを用いて新生児敗血症をモデル化し、さらに研究する手順について述べた。

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

我々のプロトコルは、実験的な新生児敗血症モデルにおける細菌の播種および負担追跡をリアルタイムで可能にし、疾患の他のマーカーを病原体の負担と相関させる能力を可能にする。このプロトコルは、個々の新生児マウスの敗血症を縦断的に分析することを可能にし、感染ダイナミクスと細菌播体をリアルタイムで観察し、比較する機会を提供する。新生児敗血症の介入の前臨床検査は、細菌の宿主制御の効果の監視を可能にする、この方法で行うことができる。まず、年齢に一致した子犬をバイオセーフティレベル2キャビネット内の高用量または低用量ごみグループに配置します。出生後3日または4日目に、接種前にすべての子犬の体重を記録する。バイオセーフティキャビネットにPBSまたは高用量または低用量の大腸菌lux inoculumでインスリン注射器をロードし、氷の上にロードされた注射器を置きます。バイオセーフティキャビネット内の清潔な表面に注射される新生児を置き、子犬をこするかのように首のうなじで皮膚を上げます。皮膚と筋肉の間に作成された空間の皮膚のすぐ下に針のベベルを挿入します。針が皮膚の下に感じられる場合は、50マイクロリットルの接種剤を注入し、同時に皮膚のつままれた部分を放出して逆流を防ぎ、針をゆっくりと注意して取り除きます。すべての子犬が同じ方法で注入されたら、子犬をダムに戻します。注射直後に、そしてその後の適切な実験時点で、大腸菌lux感染新生児マウスとダムを用いたケージをバイオセーフティレベル2層流フードに入れ、マイクロCTコンピュータでソフトウェアを開きます。システムを初期化し、ステージ温度が摂氏37度でロックし、CCD温度がマイナス90°Cでロックされるのを待った後、最大4匹の麻酔付き子犬を撮影室のイメージングボックスに置きます。イメージングチャンバのドアを閉め、発光イメージングオプションを選択します。開いたフィルタを選択し、次に、ブロックする励起フィルタと開くエミッションフィルタを設定します。500、520、560、580、600、および620ナノメートルを選択します。その後、麻酔回復まで監視してダムに戻す前に、子犬を画像化します。適切な実験エンドポイントで、バイオセーフティキャビネットで、70%エタノールで安楽死させた新生児を使用して汚染を防ぎ、動物を右側に置きます。鉗子を使用して腹部と後部左足の間の皮膚をつかみ、細かい先端の外科用はさみを使用して皮膚切開を行います。その後、脾臓全体が露出するまで動物の背中に向かって切開を続ける。鉗子とはさみを使用して腹部から脾臓を取り除き、下流の塗布に適した溶液に入れる。肺を得るために、胸部の皮膚を完全に剥がし、胸骨の基部に垂直に保持されたはさみで入り込み、リブケージが分割されるまで上向きに切断する。鉗子を使用して右肺と左肺を個別に把握し、胸腔から肺を取り除く。はさみで肺組織から心臓を取り除きます。次に、下流のアプリケーションに適した溶液に肺を配置します。インビトロ細菌殺死アッセイを行うために、感染していない脾臓を40マイクロメートルのナイロンストレーナーに入れ、10%胎児ウシ血清を補った5ミリリットルのPBSを含む無菌60ミリメートルのペトリ皿に入れ、無菌3ミリリットルシリンジプランジャーを使用して組織を単一細胞懸濁液に分解します。細胞を15ミリリットルの遠心分離管に移し、遠心分離によって回収する。3~4個の脾臓あたり1ミリリットルの赤血球ライシスバッファーでペレットを再懸濁します。室温で5分後、PBSで脾臓を洗浄し、250マイクロリットルのPBSでペレットを再懸濁し、ウシ血清アルブミンと2ミリモルEDTAを加えてカウントする。次に、メーカーのプロトコルに従って適切な免疫磁気ビーズでLy6 B2陽性細胞を分離し、濃縮されたLy6 B2陽性細胞を10倍の5細胞に、黒または白の96ウェルプレートの完全な培地あたり5個の細胞に1回播種します。細菌接種を1ウェルあたり100マイクロリットルの最終体積で所望の感染多重度で調製し、各ウェルに100マイクロリットルの細菌接種または培地を加えて、細胞培養インキュベーターで1時間のインキュベーションを行う。インキュベーションの終わりに、培地を200マイクロリットルの新鮮な完全な培地に交換し、ジェンタマイシンの1ミリリットル当たり100マイクログラムを添加して、残りの細胞外細菌を除去し、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに2時間戻します。インキュベーションの終わりおよび以降の各実験時点で、プレートリーダーを用いて、次の読み取りまでプレートを細胞培養インキュベーターに戻す前に、蓋付き培養プレートの各ウェルにおける発光を測定する。ほとんどの動物は感染後24時間で血液中に高レベルの細菌を示すが、一部の子犬は血液中の細菌が低いか検出不可能であり、この時点までに感染のクリアランスを示唆している。さらに、生物発光大腸菌に感染した新生児Ly6 B2陽性脾臓細胞は、細胞外細菌の除去とその後のゲンタマイシン治療の前に1時間にわたり、細菌クリアランスを示す時間の経過とともに減少する高レベルの発光を発現した。発光細菌の生きた動物イメージングは、感染後10時間および24時間の経時に新生児の子犬における細菌の播種および増殖の増加をさらに確認する。マイクロCTと組み合わせた生体内イメージングは、脳内の感染病巣の同定を容易にします, 肺, および他の末梢組織.いくつかの感染性の高いマウスの肺は、細菌の発光シグナルに共局化する炎症性の統合と一致する不透明な領域を示す。これらの推定炎症性滲出物の領域は、未感染制御肺では認められない。コントロールに対する炎症性サイトカイン発現の有意な増加は、低および高の接種群の両方においても観察され、肺胞壁の顕著な肥厚と相関し、肺胞出血の増加、およびこれらの動物における炎症性浸潤と観察される。覚えておくべき最も重要なことは、注射を行うときに適切な技術を実行し、麻酔を投与する際に新生児に厳しい注意を払うことである。この技術を用いて、新生児敗血症をリアルタイムで可視化し、免疫応答の改善を目的とした介入を研究し、指向療法をホストすることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: セマン、B. G.、 et.al。グラム陰性細菌敗血症の新生児イメージングモデル。 J. Vis. Exp.

新生マウス脾臓食細胞による細菌死のin vitro評価

出典:セマン、B. G.ら グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル。J. Vis.

新生マウスの感染を被覆した発光細菌を用いたモデル化

ここでは、手順は、 大腸菌 K1の培養新生児ラットにおける全身性感染の確立のために記載されている。この非侵襲的手順は、脈絡叢での胃腸管のコロニー形成、全身循環への病原体の転座、および中枢神経系への侵入を可能にする。...

神経病原の非侵襲的モデルエシェリヒア·コリ新生ラットにおける感染

周産期の窒息後の低酸素性虚血性脳症は、動物モデルを使用して研究することができます。新生児低酸素性虚血性脳症の子豚モデルを確立するために必要な手順を示します。...

新生児低酸素性虚血性脳症の子豚モデル

未熟児の脳症は、早産による損傷に関連する中枢神経系の異常を包含します。...

ラットにおける羊膜内リポ多糖で出生前低酸素性虚血を使用した未熟児のモデル化脳症

このプロトコルは、必要な手順を確立し、7...

新生児モデル敗血症マウスの制御モデル

生きた生物の合併症を伴わない胎児の母体炎症(FEMI)をシミュレートする絨毛膜炎のモデルを開発し、子孫の腸管の発達に及ぼすFEMIの影響を調べた。これは、絨毛膜炎後の腸の損傷の発症のための機械化原因の研究を可能にする。...

新生児腸管の発達に及ぼす急性絨毛膜炎の影響を研究する母体炎症への胎児暴露のマウスモデル

このプロトコルは病気の病因に機構の調査に使用することができる壊死性腸炎(NEC)の 生体外の モデルを記述する。ヒト新生児の腸、内皮細胞、および重度のNECの新生児の腸内細菌叢に由来する腸内エンテロイドをシードしたマイクロ流体チップを特徴としています。...

ヒト新生児腸管内腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込んだ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル

マウスにおける上行性膣感染症、早産、および新生児罹患率のモデル化

このプロトコルは、壊死性腸炎(NEC)の新生児マウスモデルと、その後の新生児マウス小腸からの固有層免疫細胞の単離の概要を説明します。...

壊死性小腸炎の新生児マウスモデルと免疫細胞プロファイリングのためのLamina Propria分離

学ぼう、バイオルミネセンスE. coliを用いたマウス新生児敗血症モデルの構築とリアルタイムイメージング手法。細菌動態と炎症応答の相関解析により、治療戦略開発への応用が可能です。

グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル

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