Name: マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学ぶマウス腹腔内白色脂肪組織から脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団をFACSまたは免疫磁気ビーズ分離法で単離する方法。代謝疾患研究に有用な再現性の高い技術です。

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著者は、優れた技術支援を提供してくれたLisa HansenとKirsten Vestergaard、そして原稿の批判的な読み方をしてくれたP. Scherer、N. Joffin、C. Creweに感謝しています。著者らは、ここで説明するプロトコルの開発における優れたガイダンスと支援を提供してくれたUTSW Flow Cytometry Coreに感謝します。R.K.G. は、NIH NIDDK R01 DK104789、NIDDK RC2 DK118620、および NIDDK R01 DK119163 でサポートされています。J.P.は、Innovation Fund Denmarkから博士課程前賞を受賞しています。

すべての動物のプロトコルと手順は、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの施設用動物使用およびケア委員会によって承認されています。
1. 性腺白脂肪組織からの間質血管画分(SVF)の単離
<ol><li>6〜8週齢のマウスの性腺白脂肪組織を解剖し、脂肪パッドを1x PBS溶液に入れます。</li>
	<li>最大4つの脂肪デポ(1〜2匹のマウスから2〜4のデポを推奨)を組み合わせ、200 μLの消化バッファー(1x HBSS、1.5% BSAおよび1 mg/mLコラゲナーゼD)を含む10 mLビーカーで組織をミンチにします。</li>
	<li>ミンチ組織を10 mL消化バッファーが入った50 mLの遠心チューブに移します。</li>
	<li>混合物を37°Cの水浴中で1時間、振とうしながらインキュベートします。</li>
	<li>100 μmのセルストレーナーで消化した組織をろ過し、未消化の組織を除去します。</li>
	<li>ろ過したサンプルを 2% FBS を含む PBS で 30 mL に希釈し、600 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 成熟脂肪細胞を含む上清を吸引します。</li>
	<li>すぐに優先細胞単離法に進んでください。</li>
</ol>2. FACSを用いたAPCとFIPの分離
<ol><li>チューブを穏やかに振って、ペレットを1x RBC溶解バッファー1 mLに溶解します。</li>
	<li>室温で1〜2分間インキュベートします。</li>
	<li>2% FBS/PBSを10 mL加え、40 μmのセルストレーナーを清浄な50 mLの遠心チューブに通します。</li>
	<li>600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>培地を吸引し、ペレットを400〜800μLの2%FBS/PBS含有Fcブロック(1:200)に再懸濁します。</li>
	<li>4°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>1mLあたり6細胞を≤10個含有する細胞懸濁液400μL〜800μLを1.5mLチューブに移し、抗体を添加します。抗体濃度は、材料表のセクションに記載されています。<ol><li>1)未染色細胞、2)単色コントロール、3)FMO(蛍光マイナス1)コントロール用に別々のコントロールチューブを調製します。</li>
		<li>PDGFRβ、CD45、CD31、CD9、LY6C抗体でサンプルを染色します。</li>
	</ol></li>
	<li>4°Cで15分間インキュベートし、光から保護します。</li>
	<li>600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>培地を吸引し、細胞を400 μLの2% FBS/PBSに再懸濁します。</li>
	<li>600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>培地を吸引し、細胞を400-800 μLの2% FBS/PBSに再懸濁します。次に、40 μmのフィルターキャップを5 mLポリスチレン丸底チューブに入れ、FACS用に入れます。</li>
	<li>ゲートについては、次の手順に従います。<ol><li>補正には、汚れていない単色コントロールを使用します。</li>
		<li>FMOコントロールを使用して実験ゲートを設定します。</li>
		<li>図 1 に示すゲーティング戦略を使用して、APC と FIPS を取得します。ゲートAPCはCD45-CD31-PDGFRβ+ LY6C-CD9-、FIPはCD45-CD31-PDGFRβ+ LY6C+細胞です。</li>
	</ol></li>
	<li>選別した細胞を500 μLの100%血清が入ったチューブに集め、細胞を氷上に保持します。</li>
	<li>細胞を600 x g で5分間、4°Cで遠心分離します。 2% FBS/PBSを添加し、再度600 x g で4°C、5分間遠心分離して細胞を洗浄します。 上清を捨て、ペレット化した細胞を使用します。</li>
	<li>ペレット化した細胞を、適切な量の性腺APC培養培地(細胞培養用)またはその後の分析のために適切な緩衝液に再懸濁します。</li>
</ol>3. 脂肪形成画分と非脂肪形成画分の免疫磁気分離
<ol><li>ステップ1.1-1.7に従って、性腺白脂肪組織からSVFを単離します。</li>
	<li>上清を吸引し、SVFペレットを1x 1x 市販のMS Bufferに10 mL再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液を40μmの細胞ストレーナーでろ過します。</li>
	<li>600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、ペレット化した細胞を1x MS Bufferの100 μLに再懸濁します。</li>
	<li>以下で説明するように、CD31+ およびCD45+ 細胞の枯渇を行います(図2A、 ステップ1)。これは、内皮細胞と造血系統細胞を除去するために行われます。<ol><li>セルカウンターを使用して細胞をカウントし、濃度を 1 x 108 細胞/mL ≤に調整します。</li>
		<li>ビオチン標識CD31抗体とCD45抗体を細胞懸濁液にそれぞれ10個6個あたり ≤0.25μgの濃度で加え、氷上で15分間インキュベートします。</li>
		<li>1x MS Bufferを4 mL添加して細胞を洗浄します。</li>
		<li>600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、ペレットを1x MSバッファー100 μLで再懸濁します。</li>
		<li>ストレプトアビジンナノビーズ10μLを添加し、細胞を氷上で15分間インキュベートします。</li>
		<li>1x MSバッファー4 mLを加えて細胞を洗浄します。</li>
		<li>600 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。</li>
		<li>細胞を2.5 mLの1x MSバッファーに再懸濁し、5 mLのポリプロピレンチューブに移します。</li>
		<li>チューブをマグネットラックに5分間置きます。</li>
		<li>細胞懸濁液を清潔な15 mL遠心チューブに注ぎ、非標識細胞を回収します。 注:ぶら下がっている液滴を振ったり吸い取ったりすると、不要な細胞分画による汚染につながるため、避けてください。</li>
		<li>チューブを磁石から取り外し、手順3.6.9を繰り返します。を 3.6.11.さらに2回、合計3回の洗浄。</li>
	</ol></li>
	<li>脂肪形成画分と非脂肪形成画分の分離(図2A、 ステップ2)<ol><li>ラベルのない画分(つまり、CD45-CD31-画分)で作業を続けます。</li>
		<li>非標識細胞を含む15 mLチューブを600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、ペレットを1x MSバッファー100 μLに再懸濁します。</li>
		<li>ビオチン標識LY6C抗体とCD9抗体をそれぞれ≤ 0.25 μg/106 細胞あたり添加し、氷上で15分間インキュベートします。</li>
		<li>手順 3.6.3 に従います。を 3.6.12.をクリックして、2 回目の分離を完了します。</li>
		<li>バインドされていない分数を収集します。非標識細胞(LY6C-CD9-)は、APCを含む脂肪形成画分を表します(図2A、ステップ3)。</li>
		<li>チューブを磁石から取り出し、結合細胞を再懸濁して1x MSバッファーで溶出します。溶出液または標識画分(LY6C+ CD9+)は、FIPを含む非脂肪形成画分を表します(図2A、 ステップ3)。</li>
		<li>標識フラクションおよび非標識フラクションを600 x g で5分間遠心分離し、細胞を4°Cでペレット化します。</li>
	</ol></li>
	<li>直ちに細胞培養に進むか(ステップ6)、または優先分析のために未分化前駆体を使用します(ステップ4および/またはステップ5)。</li>
</ol>4. 脂肪形成画分および非脂肪生成画分の純度をフローサイトメトリーで評価する
<ol><li>ビーズ単離した細胞画分を、200-400 μLの2% FBS/PBS含有Fcブロック(1:200)に再懸濁します。</li>
	<li>4°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞懸濁液を1.5mLチューブに移し、抗体を添加します。抗体濃度は 材料表に記載されています。<ol><li>1)未染色細胞、2)単色コントロール、3)FMOコントロール用に別々のコントロールチューブを調製します。</li>
		<li>サンプルにCD45、CD31、CD9、およびLY6C抗体を添加します。</li>
	</ol></li>
	<li>4°Cで15分間インキュベートし、光から保護します。</li>
	<li>600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、細胞を400 μLの2% FBS/PBSに再懸濁します。</li>
	<li>懸濁液を600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、細胞を400-800μLの2%FBS/PBSに再懸濁します。40 μmのフィルターキャップを通して5 mLのポリスチレン丸底チューブにろ過し、フローサイトメトリーで分析します。</li>
	<li>純度を評価するためのフローサイトメトリー解析<ol><li>補正には、汚れていない単色コントロールを使用します。</li>
		<li>FMOコントロールを使用して実験ゲートを設定します。</li>
		<li>図2Bに示すように、生細胞と単一細胞にゲーティング戦略を使用します。</li>
		<li>CD45、CD31、LY6C、および CD9 について 、図 2B に示すようにゲーティングを実行します。</li>
		<li>フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、単離画分中のCD45-CD31-LY6C-CD9-細胞(APC)およびCD45-CD31-LY6C+細胞(FIP)の頻度を評価します。</li>
	</ol></li>
</ol>5. FIPおよびAPCの純度を評価するための定量PCRを用いた遺伝子発現解析
<ol><li>磁気的に単離された細胞またはFACSで単離された細胞から、市販の抽出キット( 材料表を参照)を使用して、製造元の指示に従ってmRNAを抽出します。</li>
	<li>1 μg の RNA を使用して、製造元の指示に従って cDNA 逆転写酵素キット ( 材料表を参照) を使用して cDNA を合成します。</li>
	<li>APCおよびFIP選択的遺伝子の相対的なmRNAレベル(表1)を、SYBRグリーンPCRマスターミックスを用いた定量的PCRにより測定します。<ol><li>PCR用のサンプル反応を次のように設定します:5 μLの2x SYBR緑色色素、1 μLのcDNA(~50 ng/μL)、各フォワードプライマーとリバースプライマー0.5 μL(10 μM)、および3 μLの水。</li>
		<li>定量的PCRランには、以下の標準PCR条件を使用してください: ホールドステージ:50°Cで2分間、95°Cで10分間;PCRステージ(40サイクル):95°Cで15秒、60°Cで1分間。</li>
	</ol></li>
	<li>ΔΔ-Ctを計算することにより、値をハウスキーピング遺伝子(Rps18)レベルに正規化します。</li>
	<li>統計的有意性を評価するには、対応のないスチューデントのt検定を実行します。</li>
</ol>6. 細胞培養と分化
<ol><li>磁気的に単離された細胞またはFACSで、600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>ペレットを500 μLの性腺APC培養培地に再懸濁し、48ウェル培養プレートの各画分から40K細胞/ウェルをプレート化します。</li>
	<li>メディアは1〜2日ごとに交換してください。APCは、合流点に近づくにつれて脂肪細胞への分化が始まります。同じ培地で維持されているFIPは、脂肪形成を受けることに耐性があります。</li>
</ol>

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T.A.P.は、ノボ ノルディスクA/Sの従業員であり、株主です

マウスのC57BL/6系統は、食事誘発性肥満の研究で最も使用されているマウス系統です。C57BL/6マウスは、高脂肪食(HFD)を摂取すると急速に体重が増加し、肥満に関連するメタボリックシンドロームの顕著な特徴(インスリン抵抗性や高脂血症など)を発現します。特に、高脂肪食(HFD)の摂食に関連して起こるWATの拡大は、デポ特異的な方法で起こる19,20,21,22,23。皮下鼠径部WATデポー(iWAT)の拡張は、ほぼ独占的に脂肪細胞肥大によって起こりますが、性腺WATの拡張(gWAT)は、脂肪細胞肥大と過形成の両方を通じて起こります。肥満マウスのgWATデポも、代謝性炎症の顕著な部位です。したがって、食事誘発性肥満マウスのgWATデポは、肥満に関連する脂肪組織リモデリングの複数の特徴を研究するためのモデルを表して...

白色脂肪組織(WAT)は、哺乳類のエネルギー貯蔵の主要な部位を表しています。この組織内では、脂肪細胞、または「脂肪細胞」が過剰なカロリーをトリグリセリドの形で貯蔵し、大きな単房性脂肪滴にパッケージ化されています。さらに、脂肪細胞は、エネルギー恒常性の様々な側面を調節する多数の因子を分泌する1,2,3。脂肪細胞はWATボリュームの大部分を占めています。ただし、脂肪細胞はWAT 4,5に見られる全細胞の50%未満しか占めていません。WATの非脂肪細胞コンパートメント、または間質血管画分(SVF)は、非常に不均一であり、血管内皮細胞、組織常在免疫細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞前駆細胞(APC)集団が含まれています。
WATは、エネルギー貯蔵の需要の増加に伴ってサイズを拡大するという驚くべき能力において、非常に優れています。WATでの脂質の適切な保存は、非脂肪組織への有害な異所性脂質沈着から保護するため、この組織の可塑性を維持することが不可欠です6。カロリー過剰に反応して個々のWATデポがこの拡大を経験する方法は、肥満の状況におけるインスリン感受性の重要な決定要因です7。メタボリックシンドロームの肥満患者に観察される病理学的WAT拡張は、代謝的に好ましい皮下脂肪組織を犠牲にして、内臓WATデポの優先的な拡大によって特徴付けられます。さらに、肥満におけるインスリン抵抗性は、WATの病理学的リモデリングに関連しています。これは、既存の脂肪細胞の肥大成長(サイズの増加)、不十分な血管新生、慢性代謝炎症、細胞外マトリックス成分の蓄積(線維化)、および組織の低酸素症によって特徴付けられます8,9。これらの肥満のWAT表現型は、脂肪異栄養症(機能的WATの欠如)の状態で観察されるものと同様に、脂肪肝およびインスリン抵抗性と関連しています。対照的に、健康なWATの拡大は代謝的に健康な肥満集団で観察され、脂肪細胞過形成10を介した保護皮下WATおよびデポー拡大の優先的な拡大によって特徴付けられます。新しい脂肪細胞の動員は、脂肪細胞前駆細胞(APC)からのde novo脂肪細胞の分化(「脂肪形成」と呼ばれる)によって媒介されます。脂肪細胞の過形成は、比較的低い程度のWAT線維症および代謝性炎症と一致します6,11。WAT微小環境内の多数の細胞型は、肥満におけるWATの健康と拡張性に直接影響します12。そのため、WATに存在するさまざまな細胞タイプの機能を定義することは、この分野にとって依然として高い優先事項です。
過去10年間で、ヒトおよびマウスのWAT SVF13から天然APCを定義し、単離するためにいくつかの戦略が採用されてきました。このような戦略では、抗体ベースの細胞分離技術を用いて、一般的な間葉系幹細胞/前駆細胞マーカーの細胞表面発現に基づいてAPCを単離します。これらのアプローチには、蛍光標識抗体を用いた蛍光活性化細胞選別(FACS)や、免疫磁気ビーズ分離(すなわち、化学的に修飾された抗体)が含まれます。APCの単離を標的とする細胞表面タンパク質には、PDGFRα、PDGFRβ、CD34、およびSCA-1が含まれます。これらのアプローチは、APCの充実に役立っています。しかし、これらのマーカーに基づいて単離された細胞集団は、かなり不均一です。ごく最近のシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)研究では、マウスWAT 14,15,16,17の単離された間質血管画分(SVF)内の間質細胞の分子的および機能的不均一性が浮き彫りになっています。私たち自身のscRNA-seqおよび機能解析から、成体マウスの腹腔内WATの間質コンパートメントにおける機能的に異なる免疫調節および脂肪形成PDGFRβ+血管周囲細胞亜集団を同定し、特徴付けました15。線維炎症性前駆体(FIP)は、PDGFRβ+細胞の顕著な亜集団であり、LY6C発現(LY6C+ PDGFRβ+細胞)に基づいて単離することができる15。FIPは脂肪形成能力を欠き、さまざまな刺激に対して強い炎症誘発性反応を発揮し、コラーゲンを生成し、抗脂肪生成因子を分泌します15。これらの細胞の炎症誘発性および線維形成活性は、マウスの肥満に関連して増加し、これらの細胞がWATリモデリングの調節因子として関与しています。LY6C- CD9- PDGFRβ+亜集団は、脂肪細胞前駆細胞(APC)を表します。これらのAPCは、Ppargおよび他の脂肪形成促進遺伝子の発現に富んでおり、in vitroおよびin vivoで成熟脂肪細胞に容易に分化します15。ここでは、FACSを使用して成体マウスの腹腔内WATデポからこれらの異なる細胞集団を単離し、ビオチン化抗体を使用して免疫磁気ビーズを分離するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、成体雄および雌マウスの複数の腹腔内WATデポから機能的に異なる脂肪前駆細胞亜集団を単離するために使用することができる15。これらの機能的に異なる細胞集団を単独で研究することは、健康と疾患における脂肪形成と腹腔内脂肪組織のリモデリングを調節する分子メカニズムの現在の理解に大きく貢献する可能性があります。
以下のプロトコルは、マウス精巣上体WATからの脂肪前駆細胞の単離を詳述しています。しかし、同じ手順を使用して、雄および雌マウス15の両方の腸間膜および後腹膜WATデポから対応する細胞を単離することができる。マウスでこれらのデポを同定し、単離する方法に関する詳細なプロトコルは、Bagchi et al.18に記載されています。このプロトコルは、6〜8週齢のマウスの使用に最適化されています。APCの頻度と分化能力は、加齢に伴って低下する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>機械的組織調製およびSVF分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40および100 &micro;m セルストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>5ml ポリプロピレンチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Buffer (for 10mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg コラゲナーゼ D (1 mg/ml 最終 cc.)</td><td>ロシュ</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0.15 g BSA(1.5 % final cc.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APCs and non-APCsの免疫磁気分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X MojoSortバッファー(MSバッファー)</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml MojoSortマグネット(MSマグネット)</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;L MojoSort ストレプトアビジンナノビーズ</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purity Check and FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Fc block (Mouse CD16/CD32)</td><td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビオチン CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>濃度: &le; 0.25 & μ;10^6細胞あたりのg 種:マウスクローン:30-F11</td></tr>ビ<tr><td>オチンCD31</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>102503</td><td>濃度:&le; 0.25 &micro;10^6細胞あたりのg 種:マウスクローン:MEC13.3</td></tr>ビ<tr><td>オチンCD9</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>124803</td><td>濃度:&le; 0.25 &micro;g 10^6細胞あたり 種:マウス クローン:MZ3</td></tr><tr><td>ビオチン LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128003</td><td>濃度: &le; 0.25 &micro;10 ^ 6細胞あたりのg 種:マウス、 クローン:HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP / Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>102419</td><td>、濃度:希釈、1:400 、種:マウス クローン:390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP / Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>、濃度:希釈、1:400 種:マウス クローン:30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>濃度:希釈1:50 種:マウス クローン:APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>濃度:希釈1:400 種:マウス クローン:HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend</td><td>124808</td><td>濃度:希釈 1:400 種:マウス クローン:MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養およびDifferentiation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gonadal APC 培養培地 (500mL用)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL DMEM with 1 g/L glucose</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201 Σ</td><td></td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Σ Fetal Bovine Serum (FBS)** lot#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 100% ITS premix</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 10 mM L-アスコルビン酸-2-2リン酸</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 & micro;L 100 g/ml FGF-ベーシック</td><td>R&D systems</td><td>3139-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ペン/溶連菌</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 &micro;L Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>**注:一次APCの脂肪形成能力は、商用FBSのロットごとに異なる場合があります。FBSの複数のロット/ソースをテストする必要があります。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

白色脂肪組織(WAT)の間質血管画分(SVF)は、非常に不均一であり、成人期のWATの拡張とリモデリングに機能的に寄与する多数の細胞タイプで構成されています。この細胞の不均一性の影響を研究する上での大きな障壁は、in vitroおよびin vivo分析のためにWAT SVFから機能的に異なる細胞亜集団を容易に分離できないことです。シングルセルシーケンシング技術は最近、成体マウスの腹腔内WATデポにおいて、機能的に異なる線維炎症性および脂肪形成性PDGFRβ+血管周囲細胞亜集団を同定しました。線維炎症性前駆細胞(「FIP」と呼ばれる)は、炎症誘発性の表現型を発揮できる非脂肪原性コラーゲン産生細胞です。PDGFRβ+脂肪細胞前駆細胞(APC)は、細胞移植時にin vitroおよびin vivoの両方で高い脂肪形成を示します。ここでは、マウスの腹腔内WATデポからこれらの間質細胞亜集団を単離するための複数の方法について説明します。FIPおよびAPCは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)またはビオチン化抗体ベースの免疫磁気ビーズ技術を利用することにより、単離できます。単離された細胞は、分子解析や機能解析に利用することができます。間質細胞亜集団の機能特性を単独で研究することで、細胞レベルでの生理学的または病理学的条件下での脂肪組織リモデリングに関する現在の知識が広がります。

このプロトコルは、成体マウスの腹腔内WATデポから異なる間質細胞集団の単離を可能にする2つの戦略を説明しています。APCおよびFIPは、FACS(図1)またはビオチン化抗体による免疫磁気ビーズ分離(図2)によって単離できます。どちらのアプローチも、すべて市販の試薬と抗体を利用します。免疫磁気ビーズの分離は、gWAT SVFからの脂肪形成細胞と非脂肪形成細胞の分離につながります。フローサイトメトリー解析では、脂肪形成画分内の細胞の75%がLY6C-CD9-APCsを表していることが示されました。非脂肪生成画分の&gt;75%がFIP(LY6C+細胞)を表していました。
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このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気ビーズ分離により、マウス腹腔内白色脂肪組織(WAT)デポから脂肪形成および線維炎症性間質細胞亜集団を単離するための技術的アプローチを説明しています。

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

このプロトコルにより、研究者は、関心のあるマウスモデルから、機能的および分子的に異なる部分集団を分離することができます ペリゴナダル白色脂肪組織間質細胞。この技術の利点は、すべてのツールと試薬が広く利用可能であることです。この手順を実演するのは、ラナ・グプタ博士の研究室のシニアラボリサーチアナリストであるラヴァーニャ・ヴィシュヴァナートです。性腺白色脂肪組織(WAT)から間質血管細胞を単離した後、細胞ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解バッファーに再懸濁し、室温で1〜2分間インキュベートします。10ミリリットルの2%FBSおよびPBSで溶解を停止し、40ミクロンの細胞ストレーナーを介して細胞をろ過し、新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを400〜800マイクロリットルのFBSおよびPBSに再懸濁し、FCブロックを補充します。摂氏4度で10分間インキュベートした後、400〜800マイクロリットルの細胞を蛍光標識抗体染色用の適切な数のチューブに移し、光から保護された摂氏4度で15分間、目的のコントロール抗体と実験用抗体で細胞を標識します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞をペレット化し、チューブあたり400マイクロリットルの新鮮なFBSおよびPBSで細胞を洗浄します。洗浄後、ペレットをチューブあたり400〜800マイクロリットルの新鮮なFBSおよびPBSに再懸濁し、40ミクロンのフィルターキャップを介して細胞をFACS用の5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブにろ過します。コンペンセーションゲートと実験ゲートを設定して、抗原提示細胞と線維炎症性前駆細胞を取得します。細胞選別後、遠心分離により細胞を回収して洗浄し、ペレットを分画あたり500マイクロリットルの性腺抗原提示細胞培養培地に再懸濁します。脂肪形成細胞画分と非脂肪細胞画分の免疫磁気ビーズ分離には、間質血管ペレットを10ミリリットルのMS緩衝液に再懸濁し、40ミクロンのストレーナーで細胞をろ過します。カウント後、遠心分離により細胞を回収し、MS緩衝液濃度1ミリリットルあたり10〜8細胞の1倍以下で細胞を再懸濁します。次に、6つの細胞に1×10あたり0.25g以下の抗CD31抗体および抗CD45ビオチン標識抗体を添加し、氷上で15分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、細胞を4ミリリットルのMS緩衝液で遠心分離して洗浄し、ペレットを100マイクロリットルの新鮮なMS緩衝液に再懸濁します。10マイクロリットルのストレプトアビジンナノビーズを細胞に加え、氷上で15分間インキュベートした後、さらに4ミリリットルのMSバッファーで洗浄します。ペレットを2.5ミリリットルの新鮮なMS緩衝液に再懸濁し、細胞を5ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。チューブを磁石に5分間置いてから、標識されていない細胞を新しい15ミリリットルの遠心分離チューブにデカントします。示されているように、洗浄をさらに2回繰り返し、各洗浄後に非標識細胞を引っ張り、遠心分離により内皮および造血系統が枯渇した細胞を回収します。ペレットを100マイクロリットルのMSバッファーに再懸濁し、氷上で15分間、6番目の細胞の10倍あたり0.25マイクログラム以下のLy6CおよびCD-9抗体で細胞を標識します。インキュベーションの終了時に、Ly6C陽性の非脂肪生成細胞を回収する前に、ちょうど示したように、未結合のLy6C陰性CD-9陰性脂肪形成細胞を回収する。次に、遠心分離により両方の細胞集団を採取し、分画あたり500マイクロリットルの性腺抗原提示細胞培養培地に細胞を再懸濁します。分化のための細胞培養をセットアップするには、48ウェル培養プレートの個々のウェルで、ウェルあたり4番目の細胞の10倍で各フラクションをプレートし、プレートを細胞培養インキュベーターに7〜10日間置く。脂肪細胞前駆細胞は、コンフルエントに近づくにつれて脂肪細胞への分化を開始し、一方、フィフィブロイン炎症性前駆細胞は脂肪形成を受けることに対して抵抗性を示します。このプロトコルを使用して、FACSまたは免疫磁気ビーズ分離によって成体マウスの腹腔内WATデポから異なる間質細胞集団を単離することができます。免疫磁気ビーズ分離法により、脂肪形成細胞と非脂肪形成細胞を性腺WAT間質血管画分から単離できます。フローサイトメトリーで観察されるように、脂肪形成画分内の細胞の75%はLy6C陰性CD-9陰性脂肪細胞前駆細胞であり、非脂肪形成画分の75%以上はLy6C陽性線維炎症前駆細胞である。いずれの方法でも単離された脂肪細胞前駆細胞は、プレーティング後7〜10日以内に脂質含有脂肪細胞に高純度で分化します。対照的に、非脂肪原性前駆体は線維芽細胞様のままであり、同じ培養条件下では脂肪細胞にはなりません。このプロトコルは、性腺周囲白色脂肪組織からの脂肪原性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離に作用します。同様の細胞集団は、マウスの他の脂肪貯蔵庫にも見られます。ただし、それらの選択は、さまざまな抗体の使用に依存します。FACSおよび磁気分離によって単離された細胞集団は、細胞分化のin vitroアッセイに使用したり、遺伝子発現解析によってさらに特性評価したりできます。

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マウスの鼠径部(皮下)および性腺周囲(内臓)脂肪組織デポから間質血管画分(SVF)を分離し、それらの遺伝子発現とコラーゲン分解活性を評価するために必要な技術を紹介します。この方法には、免疫磁気細胞分離を用いたSca1高脂肪由来幹細胞(ASC)の濃縮が含まれます。...

脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。...

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウン ストリーム...

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

蛍光活性化細胞選別を用いて、マウス上体脂肪パッドから生存性の高い脂肪前駆細胞を単離する簡単な方法を提示する。...

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。...

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。...

スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

このプロトコルは、マウス脂肪組織から間質血管画分(SVF)を半自動分離して、脂肪前駆細胞を取得し、 in...

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。...

マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞の単離・培養・脂肪誘発

成熟した脂肪細胞のサイズと脆弱性は、その研究と分離に利用できる技術とツールを制限しています。ここでは、成熟したマウス脂肪細胞の単離のためのプロトコルが記載されており、これは異なる脂肪貯蔵庫およびマウスの食事療法に容易に適応することができる。...

赤身および肥満マウスからの初代マウス脂肪細胞の単離と培養

ここでは、処理時間&gt;90%短縮、高い細胞生存率、広範な適合性を特徴とする、脂肪由来幹細胞および脂肪細胞を効率的に単離する標準的な方法を提示します。...

豚脂肪組織から脂肪由来幹細胞および脂肪細胞の効率的な単離

学ぶマウス腹腔内白色脂肪組織から脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団をFACSまたは免疫磁気ビーズ分離法で単離する方法。代謝疾患研究に有用な再現性の高い技術です。

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

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