高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成
July 7th, 2020
Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体 であるアシネトバクターバウマンニーに焦点を当てていますが、このプロトコルは広範囲のグラム陰性生物に適しています。
この方法は、感染時の生体適合性に重要な必須遺伝子、抗生物質耐性遺伝子および遺伝子を同定するために多様な細菌種に使用できるため、重要である。この技術の主な利点は、高価な制限酵素、アダプター放射およびゲル精製の必要性を排除するゲノムDNAおよびPoly-CTL版の機械的共有である。この技術の影響は、感染または抗生物質耐性にとって重要であると同定された遺伝子が新しい抗微生物治療薬の標的となる可能性があるため、問題のある細菌感染の治療にも及ぶ。
この方法は、複雑な遺伝子型、グラム陰性およびグラム陽性細菌種にわたる表現型の関係に関する洞察を提供し、細菌遺伝学の現在の理解を向上させることができます。開始するには、一晩培養物を50ミリリットルの円錐管に移し、ペレットは5,000回Gで5,000回Gで7分間遠心を用いてレシピおよびドナー培養液の両方を培養した。上清を捨てます。
10ミリリットル血清ピペットを使用して、ジアミノピム酸を補充したLBの4.5ミリリットルでドナー株ペレットを再中断します。再中断ドナー株をレシピエント株管に移します。そして、すぐにLB寒天プレート上の個々の100マイクロリットルの液滴として交配懸濁液を分配し、30分間室温でプレートをインキュベートするジアミノピム酸を補う。
その後、慎重に37°Cのインキュベーターでプレートを転送し、文化が1時間交尾できるようにします。インキュベーションの後、各プレートに1.5ミリリットルのLBを加え、50ミリリットルの円錐管に細菌を収穫します。ペレットは、5,000回Gで7分間遠心分離を用いて細胞を合分させた。
次いで、上清を捨てて10ミリリットルのLBで細胞を再懸濁し、細胞をペレに残存ジアミノピム酸ペレットを取り除き、LBで洗浄を繰り返した。10ミリリットル血清ピペットを使用して、LBの10ミリリットルにペレットを再懸濁し、25%グリセロールを補った。原稿の方向に従って、細胞を皿に広げます。その後、一晩、摂氏37度でプレートをインキュベートします。
残りの細菌の1ミリリットルのアリコートを作成し、マイナス80度で保存します。氷の上に凍結交配のアリコートを注ぎます。次いで、滅菌ガラスビーズを使用して希釈液の150マイクロリットルを広げ、それぞれ30〜150ミリメートルのルリア・ベルタニ寒天プレートに、カナマイシンを加えた。
過剰な交配を含む使用済みチューブを処分し、14時間摂氏37度でプレートをインキュベートする。インキュベーションの後、各プレート上のコロニー形成単位をカウントし、トランスポゾンライブラリーにおける総変異体を推定する。プレートのグループ全体のコロニー数の推定値を決定するために、少なくとも3つのプレートの20%を数えます。
推定コロニー収量を計算した後、各プレートにLBの3〜5ミリリットルを追加し、滅菌スクレーピングツールを使用して細菌を掻き取ります。すべてのプレートから細菌の懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに引き出し、5,000倍Gで遠心分離して7分間懸濁液をペレット化する。上清を捨て、LBの5ミリリットルでペレットを再懸濁し、30%グリセロールを補う。
その後、クリオビアルでトランスポゾンライブラリの1ミリリットルのアリコートを作り、マイナス80度で保存します。TEバッファーでgDNAをマイクロリットル当たり250ナノグラムの濃度に希釈し、合計容量200マイクロリットルで、水浴超音波処理器に入れます。DNAを超音波処理し、約300ヌクレオチドの断片を生成します。
1%豚のローストゲルで、10マイクロリットルの未シャレDNAと10マイクロリットルのシアドDNAを実行してDNAがシア付きであることを確認します。必要に応じて、超音波処理を繰り返します。純粋なDNAの3つの素晴らしい端にポリーシードテールを追加するには、テキスト原稿に記載されているようにポリシー反応を設定し、37°Cで1時間反応管をインキュベートします。
ポリシー反応を精製するには、各サンプルに40マイクロリットルのサイズ選択常磁性ビーズを加え、反応管を渦液に加えます。室温でサンプルを5分間インキュベートします。次に、チューブの底部の液体を集めるためにそれらを簡単に遠心分離する。
チューブを磁気ラックに移し、室温で2分間、または溶液が透明になるまでインキュベートします。慎重に上清を除去し、ビーズを邪魔することなく、作りたての80%エタノールの200マイクロリットルを追加します。溶液が透明になるまでサンプルをインキュベートします。
その後、上清を除去し、エタノール洗浄を繰り返します。チューブを簡単に遠心分離し、磁気ラックに戻して残りの液体を取り除きます。サンプルを室温で2~5分間インキュベートし、乾燥させます。
そして、各チューブに25マイクロリットルの水を加えます。約5秒間、またはピペットを上下にボルテックスします。次いで、チューブを遠心分離し、底部に液体を集める。
チューブを磁気ラックに移し、溶液がはっきりするまで約2分間座らせます。その後、上清をビーズを邪魔することなく新しいチューブに移します。このプロトコルは、プラスミドpJNW684を複製するE-coli MFD DAPオーソトロフを使用した細菌結合を介して、Aバウマンニ株ATCC 17978で高密度トランスポゾンライブラリを生成するために使用された。
プルドAバウマンイトランスポゾン変異ライブラリーは、抗微生物の低阻害濃度下でのコリスチン耐性にとって重要なフィットネス因子を同定するために使用された。コリスチン耐性に寄与する遺伝子の変異ライブラリーを枯渇させた後、残りのライブラリープルの総gDNAを制御および実験培養から分離した。gDNAは機械的剪断で断片化され、シーケンシングに備えてDNA断片にポリシーテールが追加された。
DNA濃度を計算し、サンプルをチップベースの毛細血管電気泳動を用いて分析し、ライブラリ構築の成功を確認した。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、特定の標的株のCFUカウントに基づいて、高分解能の変異体ライブラリーを生成する交配体積を調整することです。さらに、レシピエント株は、突然変異誘発前のトランスポゾンを用いて、抗生物質耐性マーカーに感受性でなければならない。
この手順に従って、遺伝子欠失または音言い方方法を行い、シーケンシング結果から得た個々の頭部をノックアウトし、チャレンジ条件下で目的の遺伝子を検証することができる。
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概要
この研究は、グラム陰性細菌、特にアシネトバクター・バウマニイにおいて、飽和トランスポゾン変異体ライブラリを生成する方法を提示します。この技術は、抗生物質耐性因子の本質的な遺伝子の同定を容易にし、細菌感染に対する治療戦略の改善を目指しています。
主要な研究構成要素
研究分野
- トランスポゾン変異誘発
- 抗生物質耐性研究
- 微生物学
背景
- 感染時の生体適合性に関連する遺伝子を同定することの重要性
- 抗生物質耐性病原体がもたらす課題
- 細菌遺伝学を理解するための高スループットシーケンシングの応用
使用された方法
- ゲノムDNAの機械的共有とPoly-CTL編集
- アシネトバクター・バウマニイ株ATCC 17978
- 細菌接合による高密度トランスポゾンライブラリの生成
主要な結果
- トランスポゾン変異体ライブラリの成功的な作成
- 抗生物質ストレス下での適合性に重要な遺伝子の同定
- 複雑な遺伝子型-現象型関係への洞察
結論
- この研究は、感染に関連する本質的な細菌遺伝子を調査する新しいアプローチを実証しています
- この発見は、新しい抗菌治療薬の開発に影響を与える
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-density transposon insertion libraries in Gram-negative bacteria enable systematic identification of genetic determinants underlying antimicrobial resistance and bacterial fitness. This capability is critical for de-risking target selection and advancing predictive confidence in early-stage anti-infective discovery. The streamlined protocol supports portfolio-wide interrogation of resistance mechanisms in clinically relevant pathogens, directly impacting translational research and therapeutic innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide identification of essential genes and resistance determinants in Gram-negative bacteria.
- Supports functional target validation by linking genotype to phenotype under antibiotic challenge.
- Facilitates mechanistic de-risking for anti-infective target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Generates validated mutant libraries for robust, reproducible high-throughput screening workflows.
- Provides quantitative outputs for comparative fitness analysis across genetic backgrounds.
- Standardizes library construction, improving scalability and cross-study comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic findings with disease-relevant resistance phenotypes in ESKAPE pathogens.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of antimicrobial targets.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting validated resistance mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a reusable platform for hypothesis-driven genetic interrogation in Gram-negative pathogens.
- Discovery Biology: Systematically tests gene function and resistance pathways under selective pressure.
- Screening: Delivers high-density mutant pools for scalable, quantitative fitness assays.
- Analytics: Enables statistical comparison of mutant abundance and gene essentiality across conditions.
- Translational Research: Bridges genotype-phenotype mapping to preclinical model validation for resistance targets.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to multiple Gram-negative species, supporting broad anti-infective R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and resistance mechanism elucidation.
- Operational Value: Streamlines library generation, reducing cost and technical barriers to high-throughput genetic screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for anti-infective portfolios by clarifying mechanistic risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for therapeutic development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, high-throughput sequencing, and data analysis.
- Needs access to mechanical DNA shearing, capillary electrophoresis, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for library construction and fitness assays.
- Adaptable to diverse Gram-negative pathogens but may require optimization for specific strains.
- Dependent on accurate CFU quantification and antibiotic marker sensitivity for library quality.
