Name: 高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリ生成法。Acinetobacter baumanniiを用いて必須遺伝子と抗生物質耐性因子を同定し、高スループットシーケンスで細菌感染症治療の新たな標的を探索する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立衛生研究所(グラントAI146829からJ.M.B.への資金提供)によって支えられ、感謝して認められています。

著者らは開示するものは何もない。

A. バウマンニは、コリス,チン,,,,10、11、12、23、24、30、31などの「ラストライン」10,11治療薬に対するAMRの急速な取得による世界的な公衆衛生に対する新たな脅威である。1223243031ここ数十年、Tn-seqは、多くの細菌種にわたって遺伝子型-表現型相互作用を解明し、細菌遺伝学34、35、42、4335,42の34理解を深める上で重要な役割<sup...

抗生物質の発見は間違いなく20世紀の最も影響を与える健康関連の出来事の一つです。抗生物質は重篤な細菌感染を迅速に解決するだけでなく、現代医学においても極めて重要な役割を果たします。新生児医学と化学療法の主要な手術、移植および進歩は患者を生命を脅かす感染症の影響を受けやすくし、これらの療法は抗生物質11、22なしでは不可能であろう。しかし、ヒト病原体間での抗生物質耐性の急速な発達と普及は、すべての臨床的に重要なクラスの抗生物質の有効性を有意に低下させた3。かつて抗生物質治療で容易にクリアされた多くの細菌感染は、もはや古典的な治療プロトコルに反応しなくなり、世界的な公衆衛生に深刻な脅威を引き起こす1.抗菌性(AMR)は、治療期間44、55に関係なく、抗生物質の致死濃度以外の場合に細菌細胞が増殖する場所である。AMRを調節する分子および生化学的要因を理解することが緊急に必要であり、代替抗菌性開発の指針となる。具体的には、ESKAPE病原体は臨床現場で問題があり、広範囲なAMRに関連している。これらには、Eンテロコッカス・フェシウム、Sタピロコッカス・アウレウス、Kレブシエラ・ニューモニエ、Aシネトバクター・バウマンニ、P・セウドモナス・エルギノサ、Eンテロバクター属が含まれる。いくつかのメカニズムはESKAPE病原体のAMRに寄与するが、後者の4つの生物はグラム陰性である。
グラム陰性菌は、有害な環境条件からそれらを保護する定義外膜を組み立てます。外膜は、抗生物質などの有毒分子の細胞への侵入を制限する透過性障壁として機能する。他の生体膜とは異なり、外膜は非対称である。外側のリーフレットは表面に露出したリポ多糖類で富化され、一方、内リーフレットはリン脂質6の混合物である。リポ多糖類分子は、脂質二重層7内に埋め込まれた保存脂質A部分によって外膜に固定される。大腸菌のカノニカル脂質Aドメインは、ほとんどのグラム陰性細菌の増殖に必要であり、グラム陰性生物66、7、87,8において最も基本的かつ保存された経路の1つである9段階の酵素経路によって合成される。
ポリミキシンは、リポ多糖の脂質Aドメインを標的とするカチオ性抗菌ペプチドであり、外膜を摂動し、細胞を分解する。ポリミキシンの正に帯電した残基と負に帯電した脂質Aリン酸基との間の静電相互作用は、最終的に細胞死につながる細菌細胞膜を破壊する9,10,,11,,12,,13.コリスチン(ポリミキシンE)は、多剤耐性グラム陰性ノソコノミアル病原体に起因する感染症を治療するために使用される最後の手段である抗菌薬であり、例えばアシネトバクターバウマンニー1414、15、16。,15,16最初に発見された 1947, ポリミキシンは、土壌細菌によって生成されます,パエニバチルスポリミキサ17,,18,,19.ポリミキシンは、有意な腎および神経毒性20,21,21の報告のために、臨床的使用が制限される前に、グラム陰性感染症を何年も治療するために処方された。
A. バウマンニは、最近数十年にわたって患者の転帰の罹患率と死亡率を劇的に増加させた院内性のグラム陰性病原体である 22.かつては低脅威病原体と見なされていたものは、AMRを獲得する能力と流行のリスクが高いため、世界中の病院で感染する重大なリスクを引き起こします。,24A. バウマンニは、米国の経経性感染症の10%以上を占めています。疾患は、肺炎、菌血症、尿路感染症、皮膚および軟部組織感染症、髄膜炎、および心内膜炎25として現れる。A.バウマンニー感染症の治療選択肢は、βラクタム、フルオロキノロン、テトラサイクリン、およびアミノグリコシド23,24,24を含むほぼすべての抗生物質クラスに対する耐性のために減少している。多剤耐性、広範囲に薬剤耐性および汎薬剤耐性A.バウマンニの分離株の有病率は、コリスチン治療の復活につながっている。しかし、A.バウマンニ分離株間のコリスチン耐性の増加は、,世界の公衆衛生10、11、12、13、27、30、31に対する脅威をさらに増幅している。10,11,12,1327,30,31
トランスポゾンシーケンシング(Tn-seq)などのハイスループットシーケンシング技術の最近の進歩は、インビトロおよびインビボでの細菌適性の理解を進めるための重要なツールを提供してきました。Tn-seqは細菌の遺伝子型-表現型相互作用を研究するために利用することができる強力な用具である。Tn-seqは細菌病原体全体に広く適用可能であり、従来のトランスポゾン突然変異誘発と大規模な平行シーケンシングを組み合わせて迅速に挿入部位をマッピングし、DNA変異を,ゲノム全体のスケール32、33、34、35で表皮変異体にリンクするために使用できる。32,3334,35トランスポゾン変異生成法は既に説明されているが、一般的なステップは33に類似している。まず、挿入ライブラリはトランスポゾン変異生成を使用して生成され、そこで集団内の各細菌細胞はゲノムDNA(gDNA)内の単一のトランスポゾン挿入に制限される。突然変異誘発の後、個々の突然変異体がプールされる。gDNAは挿入変異体プールから抽出され、トランスポゾン接合部は増幅され、ハイスループットシーケンシングを受けます。読み取りは、ゲノムにマッピングできる挿入部位を表します。適性を減らすトランスポゾン挿入は、有益な挿入が豊かにされている間、すぐに集団から落ちる。Tn-seqは、遺伝子がストレス33の細菌フィットネスにどのような影響を与えるかについての理解を進めるのに役立っています。
pJNW684でコード化されたHimar1マリナートランスポゾンシステムは、トランスポゾン変異生成の目的のために特別に構築され、最適化されました。カナマイシン耐性遺伝子に隣接するマリナー-ファミリートランスポゾンを含み、A.バウマンニにおけるトランスポゾン挿入変異体の選択に使用される。また、トランスポザーゼコード遺伝子36の発現を駆動するA.バウマンニ特異的プロモーターをコードする。このマリナー系トランスポゾンには、カナマイシン耐性遺伝子の下流に2つのトランスレーショナルターミネーターが含まれており、挿入37の下流に読み込みを防止する。pJNW684はまた、38を複製するためにドナー株によって寄与するλpir遺伝子を必要とする複製のRP4/oriT/oriR6K条件付き起源を運ぶ。λpir 遺伝子がない場合、転位機械を運ぶpJNW684ベクターは、A.バウマンニ受信者株10、36、3836,38において10複製することができない。したがって、細菌結合の間に、トランスポゾンのみが、トランスポザーゼ遺伝子を運ぶプラスミドのバックグラウンド挿入なしにレシピエントゲノムに挿入される。これは、トランスポザーゼ活性の喪失がプラスミドと共に、レシピエントゲノムに挿入されるとトランスポゾンが異なる場所に移動するのを妨げる単一の安定した転置イベントをもたらすので、重要です。
pJNW648はまた、別のグラム陰性生物、 大腸菌での活動についてテストされています。 大腸菌 株W3110における飽和Tn-seqライブラリーの組み立て成功は、腸内細菌科を含む幅広い病原体で変異誘発を行うことが可能であることを示した。さらに、トランスポザーゼ発現を駆動する A.バウマンニ 特異的プロモーターは、種特異的プロモーターと迅速に交換することができる。最後に、カナマイシン耐性遺伝子は、研究されている生物のAMR表現型に応じて、他の耐性カセットと交換することができる。
A. バウマンニのコリスチン耐性に寄与する1つの要因は、細菌が非致死レベル39で選択的圧力にさらされる不十分な用量の投与である。いくつかの報告は、抑制性抗菌濃度が、細菌集団全体の感受性を低下させるために細胞生理学を変化させる調節応答を誘導し得ることを示した11,,12,30,,31.,Tn-seqを用いて、阻害性10およびコリスチンの亜阻害濃度にさらされた後、A.バウマンニ株ATCC 17978におけるコリスチン耐性を調節する因子を発見した。この例では、マリナーベースのトランスポソン40,41,41ファミリーを使用して飽和トランスポゾン変異ライブラリの構築と濃縮を合理化するTn-seq法を詳述する。いくつかのTn-seqA. baumanniiプロトコルは、20,000 -100,000変異体3535、42、43、44、45、46を生成するが、本明細書に記載されているプロトコルは、400,000+変異体のトランスポゾンライブラリを急速に生成することができ、これはおよそ,42,43,44,45,4610塩基対毎にトランスポゾンに相当する。さらに、ライブラリのサイズは、多大な追加の努力をせずにスケールアップすることができます。この方法はまた、制限エンドヌクレアーゼ、アダプターライゲーションおよびゲル精製の要件を排除し、最終的なライブラリの多様性を減らすことができます。

<table><tbody><tr><td>10 mM ddCTP, 2',3'-Dideoxycytidine-5'-Triphosphate</td><td>Affymetrix</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dCTP 2'-Deoxycytidine-5'-Triphosphate</td><td>Invitrogen</td><td>10217-016</td><td></td></tr><tr><td>100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker</td><td>Promega</td><td>PR-G2101</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm シャーレ</td><td>コーニング</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mmシャーレ</td><td>コーニング</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>1X B&W</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>希薄 2X B&Wを半分にすると、1X B&Wが得られます。</td></tr><tr><td>2,6-ジアミノピメリン酸</td><td>アルファエーザー</td><td>B2239103</td><td>600μで使用されています。M</td></tr><tr><td>2X B&W</td><td>N/A</td><td>N/A 2</td><td>M NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA(pH 7.5)を水に加えます。ストレプトアビジンビーズと併用します。溶液は室温に保ちます。</td></tr><tr><td>50mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml 水.-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>AccuPrimeTM Pfx DNA ポリメラーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>12344</td><td></td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii ATCC 17978</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td>AmpS, KanS</sup</td></tr><tr><td>>Ampicillin (100 mg/L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>を 100 mg/L で使用</td></tr><tr><td>AMPure XP PCR 精製システム</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939B</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 高感度 DNA 分析</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド溶液ミックス (dNTP)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁気ラック</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>E.coli MFD Dap-N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td>DAP補助栄養剤は、成長するために600 mMの外因的に添加されたDAPを必要とします。プラスミド転写用のRP4機構が含まれています。JNW68用キャリア(36)。</td></tr><tr><td>エタノール</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>おねじ極低温バイアルコー</td><td>ニング</td><td>09-761-71</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>コーニング</td><td>72684</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>G33</td><td></td></tr><tr><td>接種ループフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-602</td><td>スクレイピングツール</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906</td> を <td>25 mg/L</td></tr><tr><td>LB 寒天、Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス、Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>LoTE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>3 mM Tris-HCl、0.2 mM EDTA(pH 7.5)を水に加えます。ストレプトアビジンビーズと併用します。溶液は室温に保ちます。</td></tr><tr><td>溶解バッファー</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>9.34 mL TE バッファー、10% SDS 600 ml、プロテイナーゼ K (20 mg/mL) 60 ml</td></tr> フェ<tr><td>ノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1 混合物、pH 6.7/8.0、液)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1752I</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>Diluted to 1X</td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator with refridgeratedウォーターバス</td><td>Qsonica Sonicators</td><td>Q2000FCE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic Beads</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)</td></tr><tr><td>末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (rTdt)</td><td>Promega</td><td>PR-M1875</td><td></td></tr></tbody></table>

高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

トランスポゾンシーケンシング(Tn-seq)は、トランスポゾン突然変異誘発と大規模な並列シーケンシングを組み合わせて、幅広い環境条件下で細菌の適合性に寄与する遺伝子や経路を同定する強力な方法です。Tn-seqアプリケーションは広範囲に及び、生物レベルでの遺伝子型-表現型関係の検査を可能にしているだけでなく、集団、コミュニティ、システムレベルでも可能にしています。グラム陰性細菌は抗菌性のフェノタイプと高く関連しており、抗生物質治療の失敗の発生が増加しています。抗菌性は、それ以外の場合は致死的な抗生物質の存在下で細菌の増殖として定義される。「最終線」抗菌コリスチンは、グラム陰性細菌感染を治療するために使用される。しかし、 アシネトバクターバウマンニ を含むいくつかのグラム陰性病原体は、さまざまな分子機構を介してコリスチン耐性を発症し、その一部はTn-seqを用いて特徴付けられる。さらに、コリスチン耐性を調節するシグナル伝達経路は、グラム陰性菌内で変化する。ここでは、制限酵素、アダプターライゲーション、ゲル精製の必要性を排除することにより、飽和トランスポゾン挿入ライブラリとアンプリコンライブラリ構築の生成を合理化する A.バウマンニー におけるトランスポゾン突然変異誘発の効率的な方法を提案する。本明細書に記載されている方法は、コリスチンに挑戦したときに A.バウマンニの 適合性に寄与する分子決定因子の詳細な分析を可能にする。このプロトコルは、主に薬剤耐性病院で感染した感染症に関連する他のグラム陰性ESKAPE病原体にも適用可能である。

概説された方法は、プラスミドpJNW684を複製する大腸菌MFD DAP-を用いた細菌結合を介して-A.バウマンニ株ATCC 17978における高密度トランスポゾンライブラリーの生成を記述する(図4B)。詳細なプロトコルは、大腸菌λpir+ドナー株からA.バウマンニレシピエント株へのpJNW684の転送にバイペアの細菌結合を使用する。これは、高密度トランスポゾン変異ライブラリを生成するための効率的かつ安価な方法です。細菌は最適化された比率で混合され、交配は1時間のルリア・ベルタニ寒天プレートに発見された(図1A)。交配中、トランスポゾンをドナーからレシピエント株に移し、そこでgDNAに挿入した(図1B)。交配物を採取し、約105 CFU/mLを計算し、カナマイシンを加えた150mm x 15mm寒天プレートにメッキした<stro...

Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体 であるアシネトバクターバウマンニーに焦点を当てていますが、このプロトコルは広範囲のグラム陰性生物に適しています。

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

この方法は、感染時の生体適合性に重要な必須遺伝子、抗生物質耐性遺伝子および遺伝子を同定するために多様な細菌種に使用できるため、重要である。この技術の主な利点は、高価な制限酵素、アダプター放射およびゲル精製の必要性を排除するゲノムDNAおよびPoly-CTL版の機械的共有である。この技術の影響は、感染または抗生物質耐性にとって重要であると同定された遺伝子が新しい抗微生物治療薬の標的となる可能性があるため、問題のある細菌感染の治療にも及ぶ。この方法は、複雑な遺伝子型、グラム陰性およびグラム陽性細菌種にわたる表現型の関係に関する洞察を提供し、細菌遺伝学の現在の理解を向上させることができます。開始するには、一晩培養物を50ミリリットルの円錐管に移し、ペレットは5,000回Gで5,000回Gで7分間遠心を用いてレシピおよびドナー培養液の両方を培養した。上清を捨てます。10ミリリットル血清ピペットを使用して、ジアミノピム酸を補充したLBの4.5ミリリットルでドナー株ペレットを再中断します。再中断ドナー株をレシピエント株管に移します。そして、すぐにLB寒天プレート上の個々の100マイクロリットルの液滴として交配懸濁液を分配し、30分間室温でプレートをインキュベートするジアミノピム酸を補う。その後、慎重に37°Cのインキュベーターでプレートを転送し、文化が1時間交尾できるようにします。インキュベーションの後、各プレートに1.5ミリリットルのLBを加え、50ミリリットルの円錐管に細菌を収穫します。ペレットは、5,000回Gで7分間遠心分離を用いて細胞を合分させた。次いで、上清を捨てて10ミリリットルのLBで細胞を再懸濁し、細胞をペレに残存ジアミノピム酸ペレットを取り除き、LBで洗浄を繰り返した。10ミリリットル血清ピペットを使用して、LBの10ミリリットルにペレットを再懸濁し、25%グリセロールを補った。原稿の方向に従って、細胞を皿に広げます。その後、一晩、摂氏37度でプレートをインキュベートします。残りの細菌の1ミリリットルのアリコートを作成し、マイナス80度で保存します。氷の上に凍結交配のアリコートを注ぎます。次いで、滅菌ガラスビーズを使用して希釈液の150マイクロリットルを広げ、それぞれ30〜150ミリメートルのルリア・ベルタニ寒天プレートに、カナマイシンを加えた。過剰な交配を含む使用済みチューブを処分し、14時間摂氏37度でプレートをインキュベートする。インキュベーションの後、各プレート上のコロニー形成単位をカウントし、トランスポゾンライブラリーにおける総変異体を推定する。プレートのグループ全体のコロニー数の推定値を決定するために、少なくとも3つのプレートの20%を数えます。推定コロニー収量を計算した後、各プレートにLBの3〜5ミリリットルを追加し、滅菌スクレーピングツールを使用して細菌を掻き取ります。すべてのプレートから細菌の懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに引き出し、5,000倍Gで遠心分離して7分間懸濁液をペレット化する。上清を捨て、LBの5ミリリットルでペレットを再懸濁し、30%グリセロールを補う。その後、クリオビアルでトランスポゾンライブラリの1ミリリットルのアリコートを作り、マイナス80度で保存します。TEバッファーでgDNAをマイクロリットル当たり250ナノグラムの濃度に希釈し、合計容量200マイクロリットルで、水浴超音波処理器に入れます。DNAを超音波処理し、約300ヌクレオチドの断片を生成します。1%豚のローストゲルで、10マイクロリットルの未シャレDNAと10マイクロリットルのシアドDNAを実行してDNAがシア付きであることを確認します。必要に応じて、超音波処理を繰り返します。純粋なDNAの3つの素晴らしい端にポリーシードテールを追加するには、テキスト原稿に記載されているようにポリシー反応を設定し、37°Cで1時間反応管をインキュベートします。ポリシー反応を精製するには、各サンプルに40マイクロリットルのサイズ選択常磁性ビーズを加え、反応管を渦液に加えます。室温でサンプルを5分間インキュベートします。次に、チューブの底部の液体を集めるためにそれらを簡単に遠心分離する。チューブを磁気ラックに移し、室温で2分間、または溶液が透明になるまでインキュベートします。慎重に上清を除去し、ビーズを邪魔することなく、作りたての80%エタノールの200マイクロリットルを追加します。溶液が透明になるまでサンプルをインキュベートします。その後、上清を除去し、エタノール洗浄を繰り返します。チューブを簡単に遠心分離し、磁気ラックに戻して残りの液体を取り除きます。サンプルを室温で2~5分間インキュベートし、乾燥させます。そして、各チューブに25マイクロリットルの水を加えます。約5秒間、またはピペットを上下にボルテックスします。次いで、チューブを遠心分離し、底部に液体を集める。チューブを磁気ラックに移し、溶液がはっきりするまで約2分間座らせます。その後、上清をビーズを邪魔することなく新しいチューブに移します。このプロトコルは、プラスミドpJNW684を複製するE-coli MFD DAPオーソトロフを使用した細菌結合を介して、Aバウマンニ株ATCC 17978で高密度トランスポゾンライブラリを生成するために使用された。プルドAバウマンイトランスポゾン変異ライブラリーは、抗微生物の低阻害濃度下でのコリスチン耐性にとって重要なフィットネス因子を同定するために使用された。コリスチン耐性に寄与する遺伝子の変異ライブラリーを枯渇させた後、残りのライブラリープルの総gDNAを制御および実験培養から分離した。gDNAは機械的剪断で断片化され、シーケンシングに備えてDNA断片にポリシーテールが追加された。DNA濃度を計算し、サンプルをチップベースの毛細血管電気泳動を用いて分析し、ライブラリ構築の成功を確認した。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、特定の標的株のCFUカウントに基づいて、高分解能の変異体ライブラリーを生成する交配体積を調整することです。さらに、レシピエント株は、突然変異誘発前のトランスポゾンを用いて、抗生物質耐性マーカーに感受性でなければならない。この手順に従って、遺伝子欠失または音言い方方法を行い、シーケンシング結果から得た個々の頭部をノックアウトし、チャレンジ条件下で目的の遺伝子を検証することができる。

generating-transposon-insertion-libraries-gram-negative-bacteria-for

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Kazi、MI、 他、 ハイスループットシーケンシングのためのグラム陰性菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成。 J.ビス。...

ゲノムトランスポゾン挿入によるグラム陰性菌の単離

エンテロバクター属 。 YSUは、グルコース最小塩培地中で成長する。栄養要求株は、ランダムに宿主ゲノムに自身を挿入するトランスポでそれを変換することによって生成される。突然変異体は最小培地への複合培地からレプリカプレーティングによって発見されています。中断された遺伝子は、遺伝子のレスキューおよび配列決定により同定される。...

の世代エンテロバクターエスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

この原稿は、次世代シーケンシングのためのDNA断片を精製するための自動ゲルサイズ選択アプローチについて説明しています。Ranger...

環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

ここでは、非コーディング DNA...

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

ここに提示は、大腸菌や赤痢菌細菌の活用を使用して高密度トランスポゾン挿入ライブラリを作成するための簡単な方法です。このプロトコルは、トランスポゾンのランダムなゲノム挿入による細菌のユニークな突然変異体の何千もの何百ものコレクションの作成をできます。...

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

大規模な gRNA ライブラリを生成するためのメソッドは、シンプルで効率的かつコスト効果の高いはずです。ターゲット DNA の酵素の消化力に基づく gRNA ライブラリの生産のためのプロトコルについて述べる。このメソッド CORALINA (制御のヌクレアーゼ活性を通じて包括的な gRNA ライブラリを生成) は高価なカスタム...

大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

ここで高スループット シーケンス ハムスターの挑戦後トランスポゾン...

レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列

PBIBAC GW バイナリ ベクトルを使用そのままシングル...

BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

シーケンシング(RH-seq)を介した相互異形性は、種間の形質の違いの遺伝的基礎をマッピングする強力な新しい方法である。ヘミジゴットのプールはトランスポゾン変異によって生成され、その適合性は、高いシーケンシングを使用して競争力のある成長を通じて追跡されます。得られたデータの分析は、形質の基礎となる遺伝子を特定します。...

ゲノムワイド往復半角化分析によるサッカロマイセス酵母の種間の熱耐性の遺伝学的マッピング

これは、 バークホルデリア 有益な共生者における候補昆虫コロニー形成因子を同定するための適応的方法である。このカブトムシ宿主はトランスポゾン変異生成を介して生成されたランダム変異体ライブラリーに感染し、コロニー形成後のライブラリーの複雑さは 、インビトロで増殖した対照と比較される。...

ラグリア・ビロサ・カブトムシのバークホルデリア・グラディオリ・シンビエントにおける細菌コロニー形成因子を解明するためのツールとしてのトランスポゾン挿入シーケンシング

学ぶグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリ生成法。Acinetobacter baumanniiを用いて必須遺伝子と抗生物質耐性因子を同定し、高スループットシーケンスで細菌感染症治療の新たな標的を探索する。

高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

さらに動画を探す