大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

このプロトコールは、一次サンプルのハイスループットChIP-Seq解析を可能にし、シス調節メカニズムとその疾患への影響をより深く理解できるという点で重要です。この方法の主な利点は、データの再現性と、ハンズオンラボの時間を大幅に短縮できることです。クロマチン剪断の場合は、グリシン固定、急速凍結融解した目的の細胞ペレットに70マイクロリットルの新鮮な室温完全溶解バッファーを加え、室温で1分間インキュベートした後、気泡なしで1分間再懸濁します。

サンプルを室温でさらに1分間インキュベートしてから、細胞を氷上に置きます。再懸濁したペレットを氷上の0.65ミリリットルの低結合チューブに移してから、チューブを超音波発生器のチューブホルダーにロードします。70マイクロリットルの水を含むバランスチューブで隙間を埋め、超音波処理を開始する前に、細胞を水浴中で約1分間安定させます。

3サイクル後、サンプルをソニケーターから取り出して穏やかなボルテックスを行い、チューブをパルススピンさせてからホルダーに戻します。ヒストン修飾には、2つのチップ8チューブストリップの各チューブに100マイクロリットルの完全なtC1バッファーを追加し、16のクロマチン共有サンプルのそれぞれ20マイクロリットルをチップ8チューブストリップの個々のチューブに移します。クロマチンチューブを80マイクロリットルの完全tC1バッファーで洗浄し、チップ8チューブストリップの適切なチューブに洗浄液をプールして、チューブあたり200マイクロリットルの溶液の最終容量にします。

500 μLのTBW1バッファーに適切な量の抗体を添加し、迅速にボルテックスし、パルススピンします。次に、70マイクロリットルのtBW1と30マイクロリットルの抗体溶液を新しいチップ8チューブストリップの各チューブに加えます。次に、プロテインAビーズ溶液の容器を十分にボルテックスし、抗体0.5マイクログラムあたり5マイクロリットルのビーズを新しいチューブストリップに加えます。

ビーズのストリップをパルス回転させ、チップリキッドハンドラーの最後の列にラベル付きの空のチップ8チューブストリップを充填します。次に、チップ16-I pure 200 Dプログラムの仕様に従って残りのストリップを配置し、バッファを正しい位置にロードします。シーケンシング後、ビーズを8チューブストリップマグネットで捕捉し、25マイクロリットルのタグメンテーションバッファーを各チューブに移します。

チューブを磁石から取り外した状態で、ビーズ溶液が均一になるまで穏やかに混合してから、再キャップしたチューブを予熱したサーモミキサーに3分間入れます。インキュベーションの最後に、チップリキッドハンドラーの最後の列にあるチップ8チューブストリップを取り外し、各サンプルに2マイクロリットルのRnase Aを追加します。次に、再キャップされたチューブをパルス回転させ、ビーズ溶液が均一になるまで穏やかに混合します。

タグ付きDNA断片を精製するには、D架橋DNAサンプル100マイクロリットルを個々の1.5ミリリットルチューブに移し、チューブごとに100マイクロリットルのDNA結合バッファーでチューブを洗浄します。適切なチューブで洗浄をパルスし、サンプルをカラムにロードします。カラムを新しい 1.5 ミリリットルのコレクションチューブに入れ、9 マイクロリットルの 55 °C Tris-EDTA バッファーをカラムマトリックスに直接追加します。

1 分後、カラムを遠心分離し、各カラムから 9 マイクロリットルの溶出液を氷上の新しい 8 チューブストリップに移します。示されているように、8マイクロリットルのTris-EDTAバッファーでDNAフラグメントを再度溶出し、以前に採取したDNAフラグメント溶液で溶出液をプールします。精製したDNA断片サンプルを増幅するには、マルチチャンネルピペットでサンプルを混合し、適切なサイクル数で増幅プログラムを実行します。

増幅後、プレート磁石を使用してビーズを捕捉し、上清を捨てます。ビーズペレットを乱さずに、洗浄ごとに200マイクロリットルの新鮮な80%エタノールでビーズを3回洗浄します。最後の洗浄後、20マイクロリットルのピペットチップを使用して余分なエタノールを取り除き、ビーズを10分間、またはビーズペレットに亀裂が現れるまで乾燥させます。

各乾燥サンプルに40マイクロリットルの予熱水を加え、プレートを密封してから完全にボルテックスし、短時間パルス紡糸します。次に、蛍光定量アッセイを使用して、標準的なプロトコルに従ってDNAを定量します。せん断クロマチンフラグメントサイズの測定では、サンプルの70%以上が100〜500塩基対で14サイクル観察され、高い再現性が示されています。

図示されているように、タグ付きサンプルの強度が平均最大値の半分になるサイクルは、サイクルの決定に最適です。最良のシーケンシングデータは、DNA断片の85%以上が200〜1000塩基対の範囲である場合に得られます。これらの代表的な4つの遺伝子座の濃縮トラックでは、各サンプルの個々のトラックが高いマッピング品質とS/N比を示しています。

最初の2つの遺伝子座は、これらの細胞タイプで十分に発現した遺伝子を保有していますが、最後の2つの遺伝子座の遺伝子は発現しておらず、バックグラウンドコントロールとして機能します。ペアワイズ比較の大部分で、ピアソン相関指数は90%以上の相関を示しており、生物学的複製間の一貫性が高いことを示唆しています。細胞型特異的な遺伝子座は、適切な細胞で高い濃縮度を示しますが、ハウスキーピング遺伝子は非常に一貫したヒストン修飾を示します。

100, 000細胞未満のサンプルから実施されたChIP-Seqデータセット間の相関解析は、依然として高い再現性と10, 000細胞までの相関を示しています。ただし、セル数が減少するとバックグラウンドが増加し、相関係数も減少します。細胞の適切な溶解は、不完全な細胞溶解がプロトコルの残りの部分に影響を与えることがわかっているため、高品質のデータを生成するために不可欠です。

この方法を使用すると、多くの異なるヒストン修飾と転写因子を目的のさまざまな細胞タイプでテストでき、シス調節要素の理解を深めることができます。