自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色
August 25th, 2020
フリーフローティング技術により、研究者は固定組織切片で免疫組織化学を含む組織学的ベースの染色を行い、生物学的構造、細胞タイプ、タンパク質の発現と局在を視覚化できます。これは効率的で信頼性の高い組織化学的手法であり、脳、心臓、肝臓などの多数の組織の調査に役立ちます。
このフリーフローティング法は、マウスの脳組織サンプルの免疫組織化学の軽減に使用できます。フリーフローティング技術にはいくつかの利点があります。より厚い組織切片の取得、アリコートあたり30〜40スライスを使用した大規模研究の実施、およびサンプルの長期保存。
この手法を初めて試す場合は、実験に重要でない切片の取り付けを練習して、この手法の経験を積むことをお勧めします。切片作製する少なくとも1〜2時間前に、目的のサンプルをクライオスタットに適切な組織切断温度で順応させます。ティッシュの準備ができたら。
クライオスタットを使用して、厚さ20〜50ミクロンの切片を取得し、6ウェルまたは12ウェルプレートのPBS充填ウェルの個々のインサートに切片を配置します。すべての切片を取得したら、サンプルを1回の洗浄あたり約6ミリリットルで3回の5分間の洗浄で覆い、その後、各ウェルの切片を2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。これには、チューブあたり1〜1.5ミリリットルの保存溶液が含まれています。その後、サンプルをマイナス80°Cで染色するまで保管します。
組織切片の染色では、サンプルを室温で10〜20分間平衡化してから、切片を新しい6ウェルプレートのインサートにデカントします。すべての貯蔵溶液が排出されたら、インサートを新しいウェルに移し、ウェルあたり約6ミリリットルのTBSを3回の洗浄で5分間、1回の洗浄につき新鮮なTBSをオービタルシェーカーで室温で低速で行います。最後の洗浄後、新たに調製したブロッキング透過化溶液7ミリリットルを各ウェルに加え、室温でシェーカー上で30分間インキュベートします。
インキュベーションの終了時に、目的の一次抗体溶液1ミリリットルをインサート1本につき2ミリリットルのマイクロ遠心チューブ1本に加え、各インサートのすべての切片を適切な2ミリリットルチューブに移します。次に、チューブを回転ミキサーに置きます。毎分約7回転を加えて、摂氏4度で一晩インキュベーションします。
翌朝、各チューブの切片を新しい6ウェルプレートの個々のウェルインサートにデカントし、切片を1回の洗浄で30秒間2回、1回の洗浄で1回、1回の洗浄につき10分間新鮮なTBSで洗浄します。最後の洗浄後、切片のグループを、チューブあたり1ミリリットルの適切な二次抗体溶液を含む個々の2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、サンプルを室温で2時間、光から保護された低速のオービタルシェーカーでインキュベートします。インキュベーションの終わりに、切片を新しい6ウェルプレートのインサートにデカントし、サンプルを30秒間2回、1回1回15分間新鮮なTBSで洗浄し、光から保護します。
最後の洗浄後、切片をガラス製の長方形の組織学的チャンバーにデカントし、TBSで4分の3を満たし、スライドガラスをTBSに浸します。細い絵筆と必要に応じて拡大鏡を使用して、切片をスライドに向かって慎重に同軸に寄せ、しわや折り目がないことを確認しながら、切片をスライドに軽くたたきます。すべての切片をスライドに捕捉したら、切片が不透明になるまで、光を避けて室温で約10〜15分間スライドを乾燥させ、切片に適切な水性封入剤を塗布します。
ピンセットを使用してカバースリップをメディウムに置き、濾紙を使用してカバースリップをしっかりと押し下げて余分なメディウムを取り除きます。その後、切片は適切な顕微鏡を使用して画像化するか、摂氏4度に設定された暗いスライドボックスに保存できます。これらの代表的な画像から観察されるように、マウスの脳組織切片に対してフリーフローティング法を用いた蛍光免疫組織化学分析を行い、グリア線維酸性タンパク質の発現を調べることができます。
このアプローチは、低発現トランスジェニックマウス脳サンプルやクレシルバイオレットなどの非蛍光組織化学染色プロトコルで、GFPなどの低発現タンパク質を明らかにするのにも適しています。他の末梢組織も、これらの低レベルのGFP発現肝臓組織サンプルで観察されるような修正を必要とせずに、この技術の使用に適しています。フリーフローティング技術で覚えておくべき最も重要なことは、特に移乗中やサンプルがシェーカーやローテーター上にあるときは、切片を優しく扱うことです。
免疫蛍光染色に加えて、この方法は、ヘマトキシリン、エオシン、クレシルバイオレットなどの他の組織化学染色、または発色性免疫組織化学のために簡単に変更できます。
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概要
フリーフローティング技術は、固定組織切片上で免疫組織化学を行い、生物学的構造、細胞種、およびタンパク質発現を可視化するために利用されます。この方法は脳、心臓、肝臓などの様々な組織を調査するのに特に効果的で、より厚い組織切片や大規模な研究に適しているという利点があります。
主要な研究構成要素
研究領域
- 組織学
- 免疫組織化学
- 組織分析
背景
- フリーフローティング技術の利点には、取り扱いの容易さや長期的なサンプル保存の可能性が含まれます。
- この方法は修正なしで複数の生物学的組織に適用可能です。
- 様々なサンプルタイプにおける低発現タンパク質の検出を向上させます。
使用された方法
- 免疫組織化学的染色
- マウス脳組織サンプル
- 蛍光顕微鏡観察
主な結果
- この技術により、グリア線維酸性タンパク質発現の同定が可能になります。
- GFPトランスジェニックマウスサンプルのような低タンパク質発現の状況でも効果を示します。
- ヘマトキシリン・エオジンなどの他の染色方法もこの技術を用いて適用できます。
結論
- この研究は組織染色と分析のためのフリーフローティング技術の多様性を強調しています。
- 実験中のサンプルの完全性を維持するために、研究者がサンプルを優しく扱うことが重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The free-floating immunohistochemistry technique enables efficient processing of thick tissue sections for large-scale studies, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and peripheral tissue research. By improving antibody penetration and allowing batch handling of 30-40 sections per aliquot, it enhances reproducibility and throughput in discovery workflows. This approach is particularly valuable for studying protein expression patterns in complex tissues such as brain, where 3D reconstruction of neural projections informs target confidence and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visualization of protein expression and localization in thick tissue sections, supporting functional target validation and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates handling of large numbers of sections per aliquot, reducing labor in large-scale biomarker screening campaigns.
- Predictive Value: Improves antibody penetration compared to slide-mounted methods, increasing confidence in detection of low-abundance targets such as GFP in transgenic models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with multiple histochemical stains including hematoxylin and eosin, cresyl violet, and chromogen immunohistochemistry, enabling flexible assay development.
- Operational Value: Sections remain suspended in solution during staining, ensuring uniform reagent exposure and minimizing variability across replicates.
- Scalability: Supports long-term storage at -80°C, allowing batch processing and retrospective analysis in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Applicable to both central nervous system and peripheral tissues (e.g., liver, heart) without protocol modifications, supporting cross-target validation.
- Mechanistic De-risking: Enables 3D reconstruction of axonal and dendritic projections, providing structural context for target engagement and pathway analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates quantitative, spatially resolved protein expression data that inform go/no-go decisions in preclinical target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The free-floating method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in neuroscience and systemic toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein expression patterns in fixed tissues, enabling mechanistic insight into target biology.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence or chromogenic readouts suitable for automated imaging and image-based screening platforms.
- Analytics: Produces spatially resolved expression data that can be quantified and compared across experimental conditions to assess target modulation.
- Translational Research: Enables consistency between discovery and preclinical models by applying identical staining protocols across species and tissue types.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable platform for histological analysis that can be deployed across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances detection sensitivity and specificity in immunohistochemistry, reducing false negatives in target validation studies.
- Operational Value: Standardizes tissue handling and staining procedures, improving inter-lab reproducibility and reducing technical variability.
- Strategic Value: Increases throughput in histology-based screening, lowering cost per sample and accelerating target de-risking cycles.
- Portfolio Impact: Supports data-driven target prioritization by providing reliable, multi-parameter tissue readouts that inform biological plausibility and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, tissue sectioning, and immunofluorescence or chromogenic detection methods.
- Dependent on access to cryostat, microtome, orbital shakers, rotating mixers, and fluorescence or brightfield microscopes.
- Necessitates standardized blocking, permeabilizing, and washing buffers to minimize non-specific binding and ensure staining consistency.
- Requires optimization of antibody concentrations and incubation times for each target and tissue type, particularly for low-abundance proteins.
- Demands careful, gentle handling of free-floating sections to prevent mechanical damage during transfers and incubation steps.
