自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色
2020年8月25日
フリーフローティング技術により、研究者は固定組織切片で免疫組織化学を含む組織学的ベースの染色を行い、生物学的構造、細胞タイプ、タンパク質の発現と局在を視覚化できます。これは効率的で信頼性の高い組織化学的手法であり、脳、心臓、肝臓などの多数の組織の調査に役立ちます。
このフリーフローティング法は、マウスの脳組織サンプルの免疫組織化学の軽減に使用できます。フリーフローティング技術にはいくつかの利点があります。より厚い組織切片の取得、アリコートあたり30〜40スライスを使用した大規模研究の実施、およびサンプルの長期保存。
この手法を初めて試す場合は、実験に重要でない切片の取り付けを練習して、この手法の経験を積むことをお勧めします。切片作製する少なくとも1〜2時間前に、目的のサンプルをクライオスタットに適切な組織切断温度で順応させます。ティッシュの準備ができたら。
クライオスタットを使用して、厚さ20〜50ミクロンの切片を取得し、6ウェルまたは12ウェルプレートのPBS充填ウェルの個々のインサートに切片を配置します。すべての切片を取得したら、サンプルを1回の洗浄あたり約6ミリリットルで3回の5分間の洗浄で覆い、その後、各ウェルの切片を2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。これには、チューブあたり1〜1.5ミリリットルの保存溶液が含まれています。その後、サンプルをマイナス80°Cで染色するまで保管します。
組織切片の染色では、サンプルを室温で10〜20分間平衡化してから、切片を新しい6ウェルプレートのインサートにデカントします。すべての貯蔵溶液が排出されたら、インサートを新しいウェルに移し、ウェルあたり約6ミリリットルのTBSを3回の洗浄で5分間、1回の洗浄につき新鮮なTBSをオービタルシェーカーで室温で低速で行います。最後の洗浄後、新たに調製したブロッキング透過化溶液7ミリリットルを各ウェルに加え、室温でシェーカー上で30分間インキュベートします。
インキュベーションの終了時に、目的の一次抗体溶液1ミリリットルをインサート1本につき2ミリリットルのマイクロ遠心チューブ1本に加え、各インサートのすべての切片を適切な2ミリリットルチューブに移します。次に、チューブを回転ミキサーに置きます。毎分約7回転を加えて、摂氏4度で一晩インキュベーションします。
翌朝、各チューブの切片を新しい6ウェルプレートの個々のウェルインサートにデカントし、切片を1回の洗浄で30秒間2回、1回の洗浄で1回、1回の洗浄につき10分間新鮮なTBSで洗浄します。最後の洗浄後、切片のグループを、チューブあたり1ミリリットルの適切な二次抗体溶液を含む個々の2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、サンプルを室温で2時間、光から保護された低速のオービタルシェーカーでインキュベートします。インキュベーションの終わりに、切片を新しい6ウェルプレートのインサートにデカントし、サンプルを30秒間2回、1回1回15分間新鮮なTBSで洗浄し、光から保護します。
最後の洗浄後、切片をガラス製の長方形の組織学的チャンバーにデカントし、TBSで4分の3を満たし、スライドガラスをTBSに浸します。細い絵筆と必要に応じて拡大鏡を使用して、切片をスライドに向かって慎重に同軸に寄せ、しわや折り目がないことを確認しながら、切片をスライドに軽くたたきます。すべての切片をスライドに捕捉したら、切片が不透明になるまで、光を避けて室温で約10〜15分間スライドを乾燥させ、切片に適切な水性封入剤を塗布します。
ピンセットを使用してカバースリップをメディウムに置き、濾紙を使用してカバースリップをしっかりと押し下げて余分なメディウムを取り除きます。その後、切片は適切な顕微鏡を使用して画像化するか、摂氏4度に設定された暗いスライドボックスに保存できます。これらの代表的な画像から観察されるように、マウスの脳組織切片に対してフリーフローティング法を用いた蛍光免疫組織化学分析を行い、グリア線維酸性タンパク質の発現を調べることができます。
このアプローチは、低発現トランスジェニックマウス脳サンプルやクレシルバイオレットなどの非蛍光組織化学染色プロトコルで、GFPなどの低発現タンパク質を明らかにするのにも適しています。他の末梢組織も、これらの低レベルのGFP発現肝臓組織サンプルで観察されるような修正を必要とせずに、この技術の使用に適しています。フリーフローティング技術で覚えておくべき最も重要なことは、特に移乗中やサンプルがシェーカーやローテーター上にあるときは、切片を優しく扱うことです。
免疫蛍光染色に加えて、この方法は、ヘマトキシリン、エオシン、クレシルバイオレットなどの他の組織化学染色、または発色性免疫組織化学のために簡単に変更できます。
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概要
フリーフローティング法は、固定された組織切片の免疫組織化学染色に用いられ、生物学的構造、細胞型、およびタンパク質発現の可視化を可能にします。この手法は、脳、心臓、肝臓などのさまざまな組織の調査に特に有効であり、組織切片を厚くできる点や、大規模な研究に適しているという利点があります。
研究の主要構成要素
研究分野
- 組織学
- 免疫組織化学
- 組織解析
背景
- 遊離浮遊法の利点には、ハンドリングの容易さと、試料の長期保存が可能であることが挙げられます。
- この手法は、修正を加えることなく、さまざまな生物学的組織に適用可能です。
- また、さまざまな試料タイプにおいて、低発現タンパク質の検出能を向上させます。
使用した手法
- 免疫組織化学染色
- マウス脳組織サンプル
- 蛍光顕微鏡法
主な結果
- この手法により、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）の発現を同定することが可能です。
- GFPトランスジェニックマウスのサンプルなど、タンパク質発現レベルが低い状況においても有効であることが示されています。
- 本手法を用いて、ヘマトキシリン・エオジン染色などの他の染色法を適用することも可能です。
結論
- 本研究は、組織の染色および分析におけるフリーフローティング法の汎用性を強調しています。
- 実験中の完全性を維持するため、研究者がサンプルを慎重に取り扱うことが不可欠です。
よくある質問
産業界への実用的意義
フリーフローティング免疫組織化学染色の手法を用いることで、厚切りの組織切片を効率的に処理でき、神経科学や末梢組織研究におけるターゲットの検証およびメカニズムのデリスキングを伴う大規模な研究が可能になります。抗体の浸透性を向上させ、1回のアリコートにつき30〜40枚の切片をバッチ処理できるため、創薬ワークフローにおける再現性とスループットが向上します。このアプローチは、脳のような複雑な組織におけるタンパク質発現パターンの解析に特に有用であり、神経投射の3D再構築を行うことで、ターゲットへの信頼性向上やポートフォリオの優先順位付けに寄与します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：厚い組織切片におけるタンパク質の発現と局在の可視化を可能にし、機能的ターゲットの検証および経路の解明を支援する。
- 運用上の価値：1アリコートあたり多数の切片の処理を容易にし、大規模なバイオマーカー・スクリーニング・キャンペーンにおける労力を軽減する。
- 予測的価値：スライド貼付法と比較して抗体の浸透性を向上させ、トランスジェニックモデルにおけるGFPなどの低発現ターゲットの検出信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：ヘマトキシリン・エオジン染色、クレシルバイオレット染色、およびクロモゲン免疫組織化学染色を含む複数の組織化学的染色と互換性があり、柔軟なアッセイ開発が可能である。
- 運用上の価値：染色中に切片が溶液中に懸濁した状態に保たれるため、試薬に均一に曝露され、繰り返し試行間でのばらつきを最小限に抑えることができる。
- 拡張性：-80°Cでの長期保存に対応しており、ディスカバリーパイプラインにおけるバッチ処理や遡及的解析が可能である。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな継続性：プロトコルの変更なしに中枢神経系と末梢組織（例：肝臓、心臓）の両方に適用可能であり、クロスターゲットの検証をサポートします。
- メカニズムによるリスク低減：軸索および樹状突起投射の3D再構築を可能にし、ターゲットエンゲージメントおよびパスウェイ解析のための構造的コンテキストを提供します。
- リスク調整後の前進：定量的な空間分解タンパク質発現データを生成し、前臨床段階のターゲット選定におけるゴー/ノーゴー判断に役立てます。
パイプラインおよびワークフローの統合
フリーフローティング法は、初期のターゲット仮説の検証からリード化合物の同定、さらには前臨床バリデーションに至るまでのディスカバリー・コンティニュアム（創薬研究の連続的なプロセス）に適合しており、特に神経科学や全身性毒性評価の分野で有用です。
- 探索生物学： 固定組織におけるタンパク質発現パターンの仮説駆動型解析をサポートし、標的生物学に関するメカニズム的な知見を得ることが可能です。
- スクリーニング： 自動イメージングおよび画像ベースのスクリーニングプラットフォームに適した、再現性のある定量的な蛍光または発色リードアウトを生成します。
- アナリティクス： 空間的に分解された発現データを生成し、これを定量化して実験条件間で比較することで、標的の調節状態を評価できます。
- トランスレーショナルリサーチ： 種や組織タイプをまたいで同一の染色プロトコルを適用することで、探索段階と前臨床モデルとの間の整合性を確保します。
- 企業内での再利用： 複数のプロジェクトや治療領域に展開可能な、組織学的解析のための標準化され適応性の高いプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：免疫組織化学における検出感度と特異性を向上させ、ターゲット検証研究における偽陰性を減少させる。
- 運用的価値：組織処理および染色手順を標準化し、ラボ間の再現性を向上させ、技術的ばらつきを低減する。
- 戦略的価値：組織学に基づいたスクリーニングのスループットを向上させ、サンプルあたりのコストを削減し、ターゲットのデリスキングサイクルを加速させる。
- ポートフォリオへの影響：生物学的妥当性と安全域を裏付ける、信頼性の高いマルチパラメータの組織リードアウトを提供することで、データ駆動型のターゲット優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- 組織学、組織切片作成、および免疫蛍光法または発色検出法の専門知識が必要です。
- クライオスタット、ミクロトーム、オービタルシェーカー、回転ミキサー、および蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡の使用環境に依存します。
- 非特異的結合を最小限に抑え、染色の整合性を確保するために、標準化されたブロッキング、透過化、および洗浄バッファーが必要です。
- 各ターゲットおよび組織タイプ、特に低存在量のタンパク質に対して、抗体濃度とインキュベーション時間を最適化する必要があります。
- 転送およびインキュベーション工程における機械的な損傷を防ぐため、遊離切片を慎重かつ穏やかに取り扱う必要があります。
