Name: 自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学ぶ自由浮遊組織切片を用いた免疫組織化学染色法。マウス脳組織など様々な組織で低発現タンパク質の検出や長期保存が可能で、蛍光顕微鏡によるGFAP発現解析など大規模研究に応用できます。

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国立老化研究所(K99 / R00 AG055683からJMR)、ジョージアンドアンライアン神経科学研究所(EP、GC、JMR)、ロードアイランド大学薬学部(EP、GC、JMR)、およびKonung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse(JMR)に感謝します。博士課程の学生であるレベッカ・センフトは、ハーバード大学医学部遺伝学部のスーザン・ダイメッキ教授と一緒にトレーニングを行い、フリーフローティング法を紹介してくれたことに感謝します。図1で使用されている一部の画像は、「商業的にも自由に使用、共有、または変更できる」ソースから取得されました:マウスとマイクロ遠心チューブ(Pixabay)、マウスの脳(Jonas Töle、ウィキメディアコモンズ)、クライオスタットとマウスの脳のセクション(ウィキメディアコモンズのライフサイエンスのためのデータベースセンター)、ガラス容器(OpenClipart、FreeSvg.org)、および顕微鏡(Theresa Knott、Open Clip Art Library)。

1.凍結切片のための組織調製
<ol><li>固定組織を適切な埋め込み型(材料表を参照)に埋め込み、適切な試験片マトリックス(材料表を参照)を使用して試験片ブロックを作成し、ドライアイス上で凍結します。切断の準備ができるまで、試料ブロックを-80°Cで保管します。 注:固定組織は通常、成人(生後約2.5〜30か月)の雄または雌のげっ歯類(マウスまたはラット)34を、利用可能な倫理的許可に従って、適切な固定剤(10%ホルマリンなど)で灌流し、続いて同じ固定液で4°Cで12時間固定後固定し、1x PBSで組織を3回洗浄することによって調製されます。 組織を15%、次に30%スクロースを1x PBSに一晩または組織が沈むまで配置します35。研究者は、この一般的なプロトコルをさまざまな開発段階に適応させようとするかもしれません。</li>
</ol>2.凍結切片
<ol><li>切片の準備ができたら、組織の粉砕を防ぐために、切片化の前に少なくとも1〜2時間クライオスタットでサンプルを順応させます。</li>
	<li>クライオスタットを使用して、組織を切片(20〜50 μm)に切断し、1x PBS溶液で満たされた6または12ウェルインサート( 材料の表を参照)に収集します。 注:セクションの厚さ、収集する組織の量、および使用するウェルインサートの数に応じて、各ウェルには、ウェル用に約10〜40スライスにまたがる可変数のセクションが含まれます。たとえば、脳全体を40μmで切片化する場合、12ウェルインサートを使用して各ウェルに約18〜24の切片が収集されます。また、20 μmの切片は取り扱いがやや難しい場合があるため、バルク染色には40 μmをお勧めします(「説明」を参照)。</li>
</ol>3. セクションの保存
<ol><li>採取したら、作りたての1x PBSで切片を5分間洗浄します。3回繰り返します。</li>
	<li>切片を1〜1.5 mLの保存溶液で満たされた2 mLの微量遠心チューブに移します(250 mLの場合、70 gのスクロース、75 mLのエチレングリコールを混合し、0.1 Mリン酸バッファーで容量にします)。</li>
	<li>染色の準備ができるまで-80°Cで保存してください。</li>
</ol>4.染色I日目
<ol><li>冷凍庫からサンプルを取り出し、室温(RT)で10〜20分間平衡化します。</li>
	<li>セクションを6ウェルプレートのウェルインサートに注ぎ、保存液をセクションから分離します。</li>
	<li>ウェルインサートを、約6 mLの1x TBSを含む別のウェルに移動します。 RTで低速で低速を使用して、オービタルシェーカーで1x TBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。</li>
	<li>切片を洗浄している間に、0.3%Triton X-100を含む1x TBSと3%正常血清(例:.、正常ウマ血清)からなるブロッキング透過液7 mL(サンプルあたり)を調製します。低速を使用して、オービタルシェーカーのRTで30分間セクションをブロックします。 注:血清によるブロッキングは、組織または非特異的Fc受容体への抗体の非特異的結合を防ぎます–二次抗体の種と一致する血清が推奨されますが、利用できない場合は、一次抗体宿主動物とは異なる種からの任意の正常血清を使用できます。界面活性剤Triton X-100は、組織を透過させることにより、抗体の浸透を改善します。</li>
	<li>選択した一次抗体(適切に希釈)からなる一次抗体溶液のサンプルあたり1 mLを、0.3%Triton X-100および1%正常血清を含む1x TBSで調製します(ステップ4.4注を参照)。ウェルインサートから一次抗体溶液を含む2 mLマイクロ遠心チューブに切片を移し、目的の抗原に結合させます。 注:複数の一次抗体を使用できます(異なる宿主種で生成)。</li>
	<li>切片付きの2 mLマイクロ遠心チューブを低速(速度7 rpmなど)を使用して回転ミキサーに置き、4°Cで12〜16時間一晩インキュベートします。</li>
</ol>5.染色2日目
<ol><li>翌日、切片を6ウェルプレートのウェルインサートに注ぎ、一次抗体溶液から切片を分離します。 注:抗体溶液は収集して再利用できます。微生物の増殖を抑制するために0.02%(w / v)アジ化ナトリウムを追加します。</li>
	<li>RTで1x TBSでセクションを3回洗浄します(最初の2回の洗浄で30秒、最後の洗浄で10分)。</li>
	<li>0.3%Triton X-100および1%正常血清(光からの遮蔽液)を含む1x TBS中の適切な二次抗体(それに応じて希釈)からなる二次抗体溶液をサンプルあたり1 mL調製します。 注:結合二次抗体による間接標識は、シグナルを増幅し、タンパク質標的の比色または蛍光可視化を可能にします。</li>
	<li>二次抗体溶液を入れた2 mLの微量遠心チューブに切片を移します。低速(光からの遮蔽溶液)を使用して、オービタルシェーカーのRTで2時間インキュベートします。</li>
	<li>切片を6ウェルプレートのウェルインサートに注ぎ、二次抗体溶液から切片を分離します。</li>
	<li>サンプルを光から遮蔽し続け、RTで2x TBSで30秒間30回洗浄します。次に、1x TBSで15分間洗浄し、必要に応じてDAPI(1〜0.1 μg / ml)を追加します。</li>
</ol>6. 取り付け
<ol><li>1x TBSで4分の3を満たしたガラス製の長方形の組織学的チャンバーに切片を注ぎます。</li>
	<li>スライドガラスを1x TBSに沈め、細かい絵筆を使用してセクションをスライドに向かって同軸にします。</li>
	<li>セクションをスライドにそっとタップし、しわや折り目がないことを確認します。</li>
	<li>すべてのセクションがスライドに取り付けられるまで繰り返します。 注:たとえば、脳全体を40 μmで切片化し、18〜24の切片を含む1つのアリコートを含む12ウェルインサートに収集します。スライスは通常1〜2枚のスライドに取り付けられますが、研究者の好みに応じて、スライドごとにマウントできるセクションの数を減らすこともできます。</li>
</ol>7.カバースリップ
<ol><li>セクションをスライド上で乾燥させた後、RTで約10〜15分、またはセクションが不透明になるまで(スライドを光から保護することを忘れないでください)、適切な水性封入剤(硬化または非硬化)を塗布します。退色防止は、蛍光標識二次抗体を用いる場合が好ましい。 注意: 硬化剤を使用すると蛍光品質が低下する場合がありますが、スライドは長持ちします。</li>
	<li>ピンセットを使用して、メディアの上にカバーガラスを置きます。ろ紙で覆い、しっかりと押し下げて余分な封入剤を取り除きます。 注意: 非硬化マウントを使用する場合は、カバースリップスライドの端を透明なマニキュアでペイントしてシールします。</li>
	<li>適当な顕微鏡を用いた切片の画像。4°Cの暗いスライドボックスに保管してください。 注:切片は、レーザー走査型共焦点および倒立または直立広視野蛍光などのさまざまな顕微鏡を使用して、研究者のニーズに基づいて倍率(10倍、20倍、40倍など)で画像化できます。</li>
</ol>

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</ol>

開示するものはありません

免疫組織化学(IHC)は、組織切片内のタンパク質発現と局在を特定する上で重要になっている汎用性の高い技術です。このアッセイは、正常な機能の段階から病状までの組織の特徴をさらに理解するために、科学界全体で使用されています。IHCは、がんなどの疾患の臨床診断から前臨床研究における最初の発見まで、さまざまな分野で採用されています10,36。
IHCを実行するために最も一般的に使用される技術は、切片がスライスされた後すぐにスライドに接着されるスライドマウント法です。この技術を使用するいくつかの利点は、研究者がタンパク質共局在研究に必要な非常に薄い切片を処理でき、スライドごとに切片を染色するための溶液をほとんど使用しないことです。抗体はしばしば高価です。したがって、このアプローチは、処理するセクションが少ない場合に経済的なオプションになる可能性があります。これは、組織の取り扱いが最小限であり、組織の構造的完全性が保護されるため、新鮮凍結標本を使用する研究者にも最適な方法です。...

免疫染色は、130年前の1890年にフォンベーリング1によって血清抗体が発見されたことから始まった人気のある研究慣行です。20世紀初頭、反応を定量および視覚化する方法として色素が抗原に結合し、後に抗体に付着し1、1941年にアルバートクーンズは最初の蛍光抗体標識を開発し、光学顕微鏡法に革命をもたらした発見2,3。「免疫染色」という用語は、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、免疫細胞化学、および免疫組織化学を含む、この原理を用いて開発された多くの技術を包含する3,4。ウェスタンブロットは、組織または細胞抽出物から特定のタンパク質の存在を検出します5.タンパク質は、ゲル電気泳動を使用してサイズ別に分離され、メンブレンに転写され、抗体を使用してプローブされます。この手法は、タンパク質の存在とタンパク質が存在する量を示します。しかしながら、それは細胞または組織内のタンパク質の局在に関する情報を明らかにしない。別の方法である免疫細胞化学(ICC)は、細胞内のタンパク質、典型的にはインビトロで培養された細胞を標識する。ICCは、細胞コンパートメント内のタンパク質発現と局在の両方を示します6。特定のタンパク質を組織レベルで検出および視覚化するために、免疫組織化学(IHC)が利用されます。
IHCは、免疫系の化学的性質を利用して、組織内の特定の抗原を標的とするために研究者が使用する方法です7,8。酵素または蛍光色素のいずれかに結合した特異的な一次抗体および二次抗体を生成することにより、目的の抗原を標識し、ほとんどの組織で明らかにすることができます(Mepham and Brittenでレビューされています)9。「免疫組織化学」という用語自体は、目的の抗原を明らかにするために使用される標識方法を指定しません。したがって、この用語は、標識方法を明確に描写するために検出技術と組み合わせることがよくあります:二次抗体がペルオキシダーゼなどの酵素に結合していることを示す発色免疫組織化学(CIH)。または蛍光IHCは、二次抗体がフルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはテトラメチルローダミン(TRITC)などのフルオロフォアに結合している場合を示します。IHCの選択性により、臨床医や研究者は、さまざまな健康状態や疾患状態にわたる組織全体のタンパク質の発現と分布を視覚化できます10。臨床分野では、IHCは一般的に癌の診断やさまざまな種類の癌の違いを判断するために使用されます。IHCは、B型肝炎やC11型肝炎など、体内のさまざまな種類の微生物感染を確認するためにも使用されています。生物医学研究では、IHCは組織内のタンパク質発現をマッピングするためによく使用され、病状に見られる異常なタンパク質を特定するのに重要です。例えば、神経変性は、アルツハイマー病におけるΑβプラークや神経原線維変化などの異常なタンパク質の脳内の蓄積を伴うことが多い。動物モデルは、これらの病理学的状態を模倣するために開発されることが多く、IHCは、研究者が目的のタンパク質を見つけて定量するために使用する1つの方法です10、12、13。次に、これらの病気の原因とそれらに伴って発生する合併症についてもっと学ぶことができます。
IHCの実行には多くのステップがあります。まず、目的の組織を回収し、染色の準備をします。おそらくほとんどの研究者は固定組織サンプルを準備し、循環器系を介した固定液の灌流は形態を保存するため最適です14,15。組織サンプルの事後固定も使用され得るが、理想的よりも低い結果をもたらす可能性がある16。ホルムアルデヒドなどの架橋固定剤は、組織17内のタンパク質間に化学結合を作り出すことによって作用する。次に、固定された組織はミクロトームを使用して非常に薄い層または切片にスライスされ、多くの研究者はクライオスタットを使用して凍結切片を収集することを好みます。そこから組織を採取し、顕微鏡スライドに直接取り付けるか(スライドマウント法)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの溶液に懸濁します(フリーフローティング法)18。使用される収集方法は、研究者のニーズに基づいて事前に決定されており、これら2つの方法のそれぞれが独自の長所と短所を示しています。
スライドマウント法は群を抜いて最も一般的に使用されており、非常に薄い切片(10〜14μm)を調製できることが重要な利点であり、これは例えばタンパク質間相互作用を調べるために重要です。標本の取り扱いも最小限であり、これは組織19の構造的完全性に対する潜在的な損傷を減少させる。研究者は、固定組織と比較して非常にデリケートであり、サンプルの解凍を防ぐために多くの注意を払う必要がある新鮮な凍結組織(ドライアイス、イソペンタンなどを使用してすぐに凍結される組織)でこの技術を使用することがよくあります。スライドマウント切片を使用するもう一つの利点は、染色のための大量の溶液が通常必要とされないことです4。したがって、研究者は少量の高価な抗体または他の化学物質を使用して染色を完成させることができます。さらに、複数の異なる実験グループのセクションを同じスライドにマウントすることが可能であり、特に画像取得時に有利です。一方、スライドマウント切片を使用することにはいくつかの欠点があり、最も顕著なのは、組織切片がスライドに接着されているため、抗体の浸透が切片の片側に制限され、切片の厚さと組織の3D表現が制限されることです。また、洗浄中に、組織の端とセクション全体がスライドから剥がれ、実験全体が役に立たなくなることもあります。さらに、IHCは通常、抗原エピトープ20,21の分解を回避するためにスライドマウントアプローチを使用する場合、比較的迅速に実行する必要があり、未処理のスライドは通常-20または-80°Cで保存され、多くの場合、カバースリップして水平またはスライドボックスに保存され、比較的大きな保存フットプリントになります。最後に、研究者が多数の組織切片を処理するために多数のスライドを処理する必要がある場合、スライドマウント技術は時間がかかる可能性もあります。
スライドマウント方式を使用したこれらの課題のいくつかのために、フリーフローティング方式と呼ばれる修正が一般的な代替手段になりました。この技術は1960-70年代に文献に登場しました22,23,24、1980年代に人気を博しました25,26,27,28,29、そして現在では、スライドに付着するのではなく、懸濁液で収集された切片に染色を行うことを含む確立された方法です12,30,31.フリーフローティング法は、組織切片が20μm未満の場合は推奨されません。しかし、私たちの経験では、より厚い(40〜50μm)切片を染色する場合に最適なアプローチです。明確な利点の1つは、抗体があらゆる角度から浮遊切片に浸透し、より効果的な洗浄によりバックグラウンド染色が少なくなり、イメージング時のシグナル伝達が向上することです。さらに、切片は処理後にスライドに取り付けられるため、組織が剥離する可能性を排除し、クライオスタットを占有する時間を短縮します。フリーフローティング法はまた、特に大規模な生物医学研究のために、はるかに労働集約的ではない可能性があります。例えば、同じサンプルの多くの(18〜40)切片を同じウェルで一緒に染色することが可能であり、洗浄ステップと抗体インキュベーションステップの両方を実行する時間を節約できます。さらに、このアプローチを使用すると、スライドごとにより多くの(12〜16)セクションをマウントできるため、研究者がセクションを表示して画像化する方が便利で迅速であることがよくあります。特に、スライドへの組織スライスの取り付け中に、所望の配向が得られるまで切片を着脱することができる。研究者はまた、フリーフローティング法を使用してわずかに低濃度の抗体を使用することが多く、インキュベーションはマイクロ遠心チューブで行われるため、抗体を簡単に収集してアジ化ナトリウムで保存して再利用できます(ステップ5.1を参照)。別の利点は、凍結保護剤溶液32と共に切片を小型の微小遠心管に-80°Cで直接保存することができ、それによって貯蔵スペースを最小限に抑え、サンプル33の寿命を最大化することである。この手法を使用することの欠点は、セクションが頻繁に処理されるため、損傷を受けやすいことです。ただし、これは、低い振とう速度と回転速度を使用し、サンプルを移してセクションをスライドに取り付ける方法を研究者に適切にトレーニングすることで軽減できます。
IHCは、臨床研究分野と生物医学研究分野の両方でタンパク質発現を視覚化および局在化するための確立された不可欠なツールです。フリーフローティングIHCは、特に大規模な組織学的研究を行う場合、効率的で柔軟性があり、経済的な方法です。ここでは、発色性IHCやヘマトキシリンやエオジン、クレシルバイオレット染色などの他の染色に適応できる、科学界向けの信頼性の高い浮遊蛍光IHCプロトコルを紹介します。

<table><tbody><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>クリアマニキュア</td><td>ユーザー好み</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型</td><td>Thermo Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>ユーザー好み</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>馬血清、熱不活化</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドボックス</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>71370</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ユーザーの好み</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>ユーザーの好み</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>長方形カバースリップ</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>長方形染色皿</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>70312</td><td></td></tr><tr><td>ラウンドアーティストペイントブラシ #2</td><td>プリンストンセレクトシリーズ</td><td>3750R</td><td>ブランドは重要ではありません</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>ユーザーの好み</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCTを埋め込むための標本マトリックス</td><td>Tissue-Tek, Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>ステイントレイ&ndash;スライド染色システム</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>71396-B</td><td>暗い蓋を使用</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ユーザー設定</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラスマイクロスライド</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>ユーザー設定</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド 退色防止 取り付け媒体</td><td>ベクトルラボラトリ</td>ーズ <td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート用非硬化ウェルインサート</td><td>コーニング ネットウェル</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート用ウェルインサート</td><td>コーニング ネットウェル</td><td>3479</td><td></td></tr><tr><td>ワットマンフィルターペーパー</td><td>ミラポアシグマ</td><td>WHA1440042</td><td></td></tr></tbody></table>

自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

免疫組織化学は、特定の組織構造、ならびにタンパク質の発現および局在を視覚化するために広く使用されている技術です。染色手順中に組織切片を処理するために2つの代替アプローチが広く使用されており、1つのアプローチは切片をスライドガラスに直接取り付けることで構成され、2番目のアプローチであるフリーフローティングは、溶液に懸濁しながら固定切片を維持および染色することができます。スライドマウント法とフリーフローティング法でも同様の結果が得られる可能性がありますが、フリーフローティング法は抗体の浸透性が向上するため、組織の3D再構築に厚い切片を使用する場合、たとえば実験の焦点が脳領域の樹状突起および軸索投影に関する情報を得ることである場合に選択する方法です。さらに、切片は溶液中に保たれるため、1つのアリコートで30〜40の切片を容易に収容でき、特に大規模な生物医学研究では取り扱いの手間がかかりません。ここでは、蛍光免疫組織化学染色へのフリーフローティング法の適用方法を、脳切片を中心に説明します。また、組織サンプルがパラホルムアルデヒドまたはホルマリンで適切に固定されている限り、研究者の個々のニーズに合わせてフリーフローティング技術を簡単に変更し、他の組織やヘマトキシリン、エオシン、クレジルバイオレットなどの他の組織化学ベースの染色に適応させる方法についても説明します。

蛍光免疫組織化学的アッセイを実行するためにフリーフローティング法を用いることの全体スキームを図1に例示する。グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)発現を調べるマウス脳におけるフリーフローティング法を用いた蛍光IHCの代表例を、染色の全体的な品質を説明するために、低倍率および高倍率の両方で図2に示す。このアプローチは、低発現タンパク質を明らかにするのにも適しており、GFP低発現トランスジェニックマウス脳からの例を図3に示します。フリーフローティング法は、図4に示すように、プロトコルのステップ1から4.3に従い、ステップ6に示すように切片を取り付けることにより、クレジルバイオレットなどの他の組織化学的染色プロトコルでも使用できます。その後、切片は、スライドマウント切片を必要とする任意の染色を用いて処理することができる。発色IHCにこのプロトコルを使用する場合は、ステップ1から5.6までのプロトコルに従い(...

フリーフローティング技術により、研究者は固定組織切片で免疫組織化学を含む組織学的ベースの染色を行い、生物学的構造、細胞タイプ、タンパク質の発現と局在を視覚化できます。これは効率的で信頼性の高い組織化学的手法であり、脳、心臓、肝臓などの多数の組織の調査に役立ちます。

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

このフリーフローティング法は、マウスの脳組織サンプルの免疫組織化学の軽減に使用できます。フリーフローティング技術にはいくつかの利点があります。より厚い組織切片の取得、アリコートあたり30〜40スライスを使用した大規模研究の実施、およびサンプルの長期保存。この手法を初めて試す場合は、実験に重要でない切片の取り付けを練習して、この手法の経験を積むことをお勧めします。切片作製する少なくとも1〜2時間前に、目的のサンプルをクライオスタットに適切な組織切断温度で順応させます。ティッシュの準備ができたら。クライオスタットを使用して、厚さ20〜50ミクロンの切片を取得し、6ウェルまたは12ウェルプレートのPBS充填ウェルの個々のインサートに切片を配置します。すべての切片を取得したら、サンプルを1回の洗浄あたり約6ミリリットルで3回の5分間の洗浄で覆い、その後、各ウェルの切片を2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。これには、チューブあたり1〜1.5ミリリットルの保存溶液が含まれています。その後、サンプルをマイナス80°Cで染色するまで保管します。組織切片の染色では、サンプルを室温で10〜20分間平衡化してから、切片を新しい6ウェルプレートのインサートにデカントします。すべての貯蔵溶液が排出されたら、インサートを新しいウェルに移し、ウェルあたり約6ミリリットルのTBSを3回の洗浄で5分間、1回の洗浄につき新鮮なTBSをオービタルシェーカーで室温で低速で行います。最後の洗浄後、新たに調製したブロッキング透過化溶液7ミリリットルを各ウェルに加え、室温でシェーカー上で30分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、目的の一次抗体溶液1ミリリットルをインサート1本につき2ミリリットルのマイクロ遠心チューブ1本に加え、各インサートのすべての切片を適切な2ミリリットルチューブに移します。次に、チューブを回転ミキサーに置きます。毎分約7回転を加えて、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、各チューブの切片を新しい6ウェルプレートの個々のウェルインサートにデカントし、切片を1回の洗浄で30秒間2回、1回の洗浄で1回、1回の洗浄につき10分間新鮮なTBSで洗浄します。最後の洗浄後、切片のグループを、チューブあたり1ミリリットルの適切な二次抗体溶液を含む個々の2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、サンプルを室温で2時間、光から保護された低速のオービタルシェーカーでインキュベートします。インキュベーションの終わりに、切片を新しい6ウェルプレートのインサートにデカントし、サンプルを30秒間2回、1回1回15分間新鮮なTBSで洗浄し、光から保護します。最後の洗浄後、切片をガラス製の長方形の組織学的チャンバーにデカントし、TBSで4分の3を満たし、スライドガラスをTBSに浸します。細い絵筆と必要に応じて拡大鏡を使用して、切片をスライドに向かって慎重に同軸に寄せ、しわや折り目がないことを確認しながら、切片をスライドに軽くたたきます。すべての切片をスライドに捕捉したら、切片が不透明になるまで、光を避けて室温で約10〜15分間スライドを乾燥させ、切片に適切な水性封入剤を塗布します。ピンセットを使用してカバースリップをメディウムに置き、濾紙を使用してカバースリップをしっかりと押し下げて余分なメディウムを取り除きます。その後、切片は適切な顕微鏡を使用して画像化するか、摂氏4度に設定された暗いスライドボックスに保存できます。これらの代表的な画像から観察されるように、マウスの脳組織切片に対してフリーフローティング法を用いた蛍光免疫組織化学分析を行い、グリア線維酸性タンパク質の発現を調べることができます。このアプローチは、低発現トランスジェニックマウス脳サンプルやクレシルバイオレットなどの非蛍光組織化学染色プロトコルで、GFPなどの低発現タンパク質を明らかにするのにも適しています。他の末梢組織も、これらの低レベルのGFP発現肝臓組織サンプルで観察されるような修正を必要とせずに、この技術の使用に適しています。フリーフローティング技術で覚えておくべき最も重要なことは、特に移乗中やサンプルがシェーカーやローテーター上にあるときは、切片を優しく扱うことです。免疫蛍光染色に加えて、この方法は、ヘマトキシリン、エオシン、クレシルバイオレットなどの他の組織化学染色、または発色性免疫組織化学のために簡単に変更できます。

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自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色

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