Name: 非トランスジェニック無脊椎動物における単一ニューロン分解能を用いたネットワークダイナミクスを記録するためのフォトダイオードベースの光学イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶフォトダイオードアレイと電位感受性色素を用いた非トランスジェニック無脊椎動物の単一ニューロン分解能ネットワークダイナミクス記録法。Aplysia californicaを用いた神経活動可視化プロトコル。

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この作業は、NSF 1257923とNIH 1U01NS10837によってサポートされました。著者らは、研究室でのジャン・ワンの支援を認めたい。

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著者らは開示するものは何もない。

大規模なVSDイメージングアプローチを実装する上で最も重要な点の1つは、振動を最小限に抑え、ダイオード全体でコントラストエッジの動きを生じさせ、大きなアーティフィファクト信号を生成することです。吸光度VSDは、作用電位を有する光強度の非常に小さな割合の変化を生じるので、振動アーティファクトは、妨げられなければ、関心のある神経信号をあいまいにすることができる。振動の発生を最小限に抑える方法はいくつかあります。まず、当社のイメージングルームは、1階に位置し、空気処理装置や他の多くのソースの構築に関連する振動から準備を隔離しています。第二に、バネベースの分離テーブルが使用され、他のPDAユーザーは、より一般的な空気テーブル16よりも優れた振動減衰を提供することを確認した。第三に、水浸漬目的が使用され、表面の波紋から生じる画像の変動を排除しました。第4に、画像化された調製物を、シリコーンプラグまたは石油ゼリーによって所定の位置に保持されている上から押し下げたチャンバーカバースリップ底部とカバースリップ片との間に軽く押し付け、さらに調製を安定化させる。これはまた、画像化されている神経節または神経節の凸面を平らにし、その結果、目的の焦点面でより多くのニューロンが得られ、記録されたニューロンの数が増加する。
アクションポテンシャルに起因するVSD光吸光度の変化の非常に小さい変化に対する信号対雑音比を最大化するには、PDAへの調製を通してほぼ飽和光を達成すると同時に、色素の光の漂白を最小限に抑えるために不可欠です。この作業を行うために、1x位置のPDAコントロールパネルゲインスイッチで測定した3~4Vの静止光強度(PDAの464アンプは10Vの光で飽和します)で動作します。データ取得中に、このゲイン係数は100倍に変更されます。PDAで測定された3-4Vに達するのに十分な光を得ることは、いくつかの方法で達成することができる。まず、使用する吸光度染料の吸収特性に適した波長を供給する超明るいLED光源を使用する。したがって、735nm LEDコリメートランプを使用し、RH155およびRH482の最適な吸収波長と重なった。第二に、必要に応じて、LED光源からの光をより小さな領域に集中させるフリップトップサブステージコンデンサーを使用します。第三に、高い、明るさおよび最大のイメージの質を保障するケーラーの照明を達成するために凝縮器の高さを調節する。第4に、LEDランプの735nm波長を減衰させる光経路にヒートフィルターがないことを確認してください。第五に、ディフューザーを除去し、より多くの光が必要な場合は、光学経路から除去する。第六に、高い空間分解能を提供する高NA目標を使用し、低いランプ強度でPDAに到達するのに十分なレベルの光を可能にする。これにより、すべてのファイルで同じ光強度を使用し、信号振幅の大幅な損失や再染色の必要性をなくして、準備ごとに10〜20分の複数の取得ファイルを取得できる範囲で、光の漂白を最小限に抑えることができ、私たちは可能にしました。重要なことに、実験者がこれらの長いファイル全体のニューロンを追跡したい場合は、焦点面が変化せず、準備が動かないことを確認してください。最後に、PDAに十分な光をルーティングする追加の方法は、より薄く、したがって不透明な神経節を少なくする若い動物を使用することです。
光信号の信号対雑音比が劣化したり、モータのリズムが最適でない(遅い、異常など)ことが時々分かります。これが一貫して起こり始めると、VSDの新鮮なソリューションをミックスします。VSDのアリコートは、通常、-20°Cの冷凍庫で約6ヶ月間生存可能なままである。関連して、 ベルガにとって、これまで最良の結果は、吸光度VSD RH482で得られていることは注目に値する。RH482はRH155よりも親油性であるため、 ベルヒアの比較的小さいニューロンを染色する方が良いか、この熱帯種に使用されるより高い記録生理食塩水温度でより効果的に神経膜に残る可能性があります。
神経活動のPDAベースのイメージングの1つの制限は、100xプリアンプ化ステップの前にハードウェア内の電圧信号のACカップリングに関連する:これは、この技術で必要とされる高い静休み光レベルによって生成される大きなDCオフセットを除去するために必要な機能を表しているが、PDAに固有のAC結合は膜電位の遅い変化の測定を妨げる、 シナプス入力に関連するものなど。低速または定常状態の可能性の変化を記録することが望ましい場合は、DC結合CMOSカメライメージングシステムを使用してサブスレッショルドアクティビティをキャプチャできます。Byrneたちは最近、RH155でこのようなセットアップを使用して、Aplysia17, 18の頬神経節におけるニューロンの活動を画像化した。我々は、両方のシステムを使用し、検出器(128 x 128)の密度が非常に高いため、CMOSカメラが同じイメージング時間7で50倍大きなデータファイルを生成することを発見しました。PDAの小さなファイルは、処理と分析の高速化を促進します。また、拡張シングルトライアル記録(図4)と学習の研究が可能になり、複数の試行のデータをスパイクソートの前に1つの大きなファイルに連結し、学習が発展する19としてネットワーク組織を追跡することができます。
他のカメラベースの調査では、クリスタンと同僚が蛍光VSDを使用して、リーチのセグメント性神経節のネットワーク機能を調べている。ある有力な研究では、これは泳ぐか、またはクロールする動物の決定に関与するニューロンの同定につながった 20 .別の研究では、Kristanらはリーチの水泳とクロールの行動が多機能対専用回路21によってどの程度駆動されているかを調べた。最近では、Wagenaarたちは、リーチセグメント神経節22のほぼすべてのニューロンから記録することを可能にする電圧イメージングに両面顕微鏡を使用した。多くのカメラベースのイメージング方法とは対照的に、PDAベースのイメージング法の利点は、結果処理のための神経境界に関する決定を伴さない盲目のソース分離の一形態であるICAによる迅速かつ公平なスパイクソーティングです。
VSDの選択に関して、吸光度染料RH155およびRH482の1つの利点は、それらに関連するほとんどない光毒性23、24であり、蛍光VSDの典型的なよりも長い記録時間を可能にする。さらに、我々が使用する高速吸光度VSDは、通常振幅80 mVである胃ポッド調製におけるオーバーシューティング体細胞作用電位を記録するのに適しています。図3Gに示すように、私たちの光学的手法は、アクションポテンシャルのアンダーシュートを記録することができます(私たちの録音のどれもトレース平均ではありません):これは、私たちが使用するVSDがある程度減衰し、したがって、彼らがソーマに達するまでにオーバーシュートされていない他のモデルシステムのアクションポテンシャルを識別することができるべきであることを示唆しています。それにもかかわらず、我々の光学的アプローチは、相馬に記録された場合に高度に減衰する作用電位を示すことが知られている種にとって理想的ではないかもしれない。
ニューラルネットワークに関する現在の研究の多くは、少数のデザイナートランスジェニック種に焦点を当てています。しかし、神経科学は、多種多様な系統学的に異なる種の研究の恩恵を受けます。多くの異なる種を研究することは、回路がどのように進化するかについての洞察を提供します25,26, phyla全体で一般的である可能性のあるネットワーク機能の原理を照らします1,2,3,4,27.これまでに、我々のイメージング法を、Aplysiaカリフォルニカ8、11、12、13、14、28、トリトニア・ディオメデア8、9、11、14、19、28、トリトニアイバ28、及び胃ポッド種の数に適用してきました。 Pleurobranchaeaカリフォルニカ(未発表データ)、そして最近ベルヒアステファニー (図5)。このアプローチの魅力は、トランスジェニック動物を必要としない多くの種に容易に適用できることである。我々は、高速吸光度染料とPDAを用いたVSDイメージングの使用が、ナバナックス29とAplysia30の準備を行う半無傷でこれを達成した先駆的な作業の足跡をたどることを認めたい。我々のアプローチの迅速性に重点を置くことは、神経科学31に広範な関心を持つ科学的な問題を探求する前に、長年の研究が基本的なネットワーク組織を特徴付けるために何年も必要であるという懸念のために、多くの研究者が新種のネットワーク研究を開始することにますます消極的になるかもしれないという懸念に対する答えの一部である。したがって、ここでの目標は、単一の準備からネットワーク組織に関する重要な即日の洞察を得ることができるという点まで、プロセスを大幅にスピードアップする手法を実証することです。

ショウジョウバエやC.エレガンスなどの無脊椎動物のトランスジェニックラインの開発は、行動の神経塩基が光学的に尋問され、操作することができる強力なシステムを提供してきました。しかし、これらの特殊な製剤は、特に神経科学研究への新種の導入に関して、非トランスジェニック種の神経回路研究に対する熱意を低下させるという欠点を有し得る。比較研究は、そのような原理が発見される不可欠な経路を表すため、1つまたは2つのモデルシステムのみに焦点を当てることは、ネットワーク機能の一般的な原則の探索に有害である1、2、3、4。ここでの目的は、ニューラルネットワーク機能の比較研究を促進するために、胃ポッドニューラルネットワークの機能構造に関する迅速な洞察を得るための大規模なイメージングアプローチを実証することです。
Aplysia、Lymnaea、トリトニア、プリユーロブランチアなどの胃ポッド軟体動物は、神経管の表面に位置する大規模でしばしば識別可能なニューロンによってそれらの行動が媒介されているため、神経ネットワーク機能の原理を調査するために長い間使用されてきました。 1970年代には、プラズマ膜に溶け込むことができる電圧感受性色素(VSD)が開発され、すぐに複数のニューロン6によって生成された作用電位の最初の無電極記録が可能になった。ここでは、神経科学の新しい1種、ベルヒア・ステファニーエを含む、いくつかの種の胃ポッドにおけるネットワーク活動を調べるためにVSDを使用することを実証します。撮像装置は、1,600フレーム/秒でサンプリングする市販の464要素フォトダイオードアレイ(PDA)(図1)であり、これは、高速吸光度VSDで使用すると、記録されたすべてのニューロン7の作用電位を明らかにする。全てのダイオードによって記録された信号は、PDA取得ソフトウェアの中でガングリオンの画像に重ね合わせた直後に表示され、同じ準備8,9で鋭い電極を用いて目的のニューロンを調査することを可能にする。
生のPDAデータでは、多くのダイオードはより大きなニューロンを冗長に記録し、多くは複数のニューロンからの混合信号も含まれています。転機は、独立した成分分析を用いた自動スパイクソート法の開発で、各生の464チャネルPDAデータセットを新しいトレースセットに迅速に処理し、記録されたすべてのニューロンがその作用電位10,11のみを含む別のトレースに現れる。
この記事では、フォトダイオードアレイと高速吸光度VSDを備えた胃ポッド神経系からの大規模なアクションポテンシャル記録の取得に関する重要なステップを概説します。 さらに、光学的に記録されたニューロンを機能アンサンブルに対してクラスタリングおよびマッピングするために使用できる分析方法と、発射痕12,13の簡易検査を通じてしばしば明らかでない集団レベルの特徴を特徴付けるために用いることができる方法を示す。

<table><tbody><tr><td>アクロマート 0.9 NA スイングコンデンサー</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>バイポーラ温度コントローラー</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>CL-100 SC-20</td><td>灌流生理食塩水温度を制御</td></tr><tr><td>チャンバー温度計</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12 IT-18 マイクロプローブ</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>オプトロニクス</td><td>S97808</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子</td><td>デュモン</td><td>#5</td><td></td></tr>は<tr><td>さみを解剖</td>する<td>American Diagnostic Corp.</td><td>ADC-3410Q</td><td></td></tr><tr><td>イメージング顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51WIF</td><td></td></tr><tr><td>イメージング灌流チャンバー</td><td>シスキユー</td><td>PC-H</td><td></td></tr><tr><td>インスタントオーシャン</td><td>インスタントオーシャン</td><td>SS6-25</td><td>一度に25ガロンを製造</td></tr><tr><td>マスター-8パルス刺激装置</td><td>A.M.P.I.</td><td>マスター8</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>ディスペンサー</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>3-000-752</td><td>圧力染色用染料アプリケーター</td></tr><tr><td>マイクロダイセクションハサミ</td><td>モリア</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>微細ピン (0.1 mm)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td>NC9677548 CNS位置決めと安定化用</td></tr><tr><td>電動顕微鏡プラットフォーム</td><td>Thorlabs</td><td>GHB-BX</td><td>ジブラルタルプラットフォーム</td></tr><tr><td>NeuroPlexイメージングソフトウェア</td><td>RedShirtImaging</td><td>NeuroPlex</td><td>WuTechフォトダイオードアレイに対応</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>XLPLN10XSVMP、XLUMPLFLN20XW、LUMPLFLN40XW、UAPON40XW340</td><td></td></tr><tr><td>PE-100ポリエチレンチューブ</td><td>VWR</td><td>63018-726</td><td>吸引電極を作るためのチューブ</td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>インステック</td><td>P720 DBS062SDBSUチューブセット</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>Equate</td><td>NDC 49035-038-54</td><td></td></tr><tr><td>コントロールパネル付きフォトダイオードアレイ</td><td>WuTech Instruments</td><td>469-IV フォトダイオードアレイ</td><td>注文情報の連絡先 jianwu2nd@gmail.com</td></tr><tr><td>RH155</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-499432</td><td>電圧感受性色素</td></tr><tr><td>RH482</td><td>コネチカット大学ヘルスセンター</td><td>JPW-1132</td><td>電圧感受性色素;レスリー・レオウからの特別注文</td></tr><tr>シリコン<td>耳栓</td><td>マックの</td><td>モデル7</td><td>プレパレーションの圧縮</td></tr>染色に使用する <tr><td>PEチューブ</td><td>VWR</td><td>63018-xxx</td><td>フィット感に応じて異なるサイズ</td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニングシル</td><td>ガード184シリコーンエラストマーキット</td><td></td></tr><tr><td>Thorlabs LEDとドライバー</td><td>Thorlabs</td><td>M735L2-C1、DC2100</td><td>LEDランプおよびドライバー</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-171-xxx</td><td></td></tr><tr><td>振動遮断テーブル</td><td>キネティックシステム</td><td>MK26</td><td>スプリングベース</td></tr></tbody></table>

非トランスジェニック無脊椎動物における単一ニューロン分解能を用いたネットワークダイナミクスを記録するためのフォトダイオードベースの光学イメージング

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

特定可能なニューロンセットの活性を光で記録し、操作することができるトランスジェニック無脊椎動物製剤の開発は、行動の神経基盤の研究のための革命的な進歩を表しています。しかし、この開発の欠点は、研究者が非常に少数の「デザイナー」生物(例えば 、C.エレガンス および ショウジョウバエ)に焦点を当てる傾向にあり、ネットワーク機能の一般原理を特定するために必要な多くの種にわたる比較研究の追求に悪影響を及ぼす可能性がある。本稿は、非トランスジェニック胃ポッド種の脳における電圧感受性色素による光記録が、単一細胞分解能を有するニューラルネットワークの機能的組織の特徴を迅速に(すなわち、単一の実験の時間内に)いかにして明らかにすることができるかを示している。我々は、神経科学に新しい1つを含む複数の胃ポッド種のCNSにおける行動関連の運動プログラム中に数十〜150ニューロンから行動電位痕を得るために我々の研究室で使用される解剖、染色、および記録方法を詳細に概説する - nudibranch Berghia stephanieaee.イメージングは、吸光度の電圧感受性色素と、記録されたニューロンによって生成されたすべてのアクション電位をキャプチャするのに十分な速さで、1,600フレーム/秒でサンプリングする464要素フォトダイオードアレイで行われます。複数の数分間の記録は、シグナルの漂白や光毒性をほとんどまたは全くなく、調製ごとに得ることができます。記載された方法を通して収集された生の光学データは、さまざまな例示された方法を通して分析することができる。私たちの光学記録アプローチは、様々な非トランスジェニック種のネットワーク活動を容易にプローブするために使用することができ、脳がどのように行動を生み出すのかの比較研究に適しています。

トリトニア そのシースター捕食者との皮膚接触は、トリトニア・ディオメデアの脱出泳ぎを引き起こし、それを安全に推進する全身屈曲のリズミカルなシリーズからなる(図3A)。単離脳の準備では、ペダル神経3(PdN3)への短い刺激は、ペダル神経節からの光学記録で容易に認識可能であるこの行動のためのリズミカルな水泳運動プログラム(SMP)を引き出す。図3Bは、PDAが位置した左トリトニアペダル神経節の後面におけるニューロンの発火活性を記録するように設計されたVSDイメージング実験のレイアウトを、反側(右)PdN3がSMPを引き出す刺激として描いている。PdN3の刺激前、刺激中および後の20ダイオード記録活動からの生データおよびフィルタリングされたデータ(バンドパスバターワースフィルタ、5および100 Hzカットオフ)は、それぞれ図3C、Dに示されている。神経刺激は2分ファイルに20 sを送達した。取得直後に、記録アレイの464ダイオードの全てで測定された信号を、撮像ソフトウェアの準備の画像上に地形的に表示することができる(図3E)。この時点で、多くのトレースには同じニューロンから冗長的に記録されたスパイクが含まれ、いくつかのトレースには複数のニューロンからのスパイクが含まれています。フィルターされたダイオードトレースをICAでスパイクソートすると、53個のユニークなニューロントレースが生成され、そのうちの30個が図3Fに示されています。個々のスパイクの動態は、図3F(赤いボックス)からの4つの痕跡の抜粋を拡大する図3Gで理解することができます。ICAスパイク選別アルゴリズムの精度は、以前に同時に鋭い電極記録を使用して検証され、ソートされたトレース内のすべてのスパイクが個々のニューロン11、14からの細胞内に記録されたスパイクに対応することを示した。
時立 Aplysiaカリフォルニカへの強く回避的な尾の刺激は、ステレオタイプ化された2部のリズミカルエスケープ応答15を引き出す。応答の第1段階は、動物を素早く前進させる頭部肺および尾引きのいくつかのサイクルのギャロップである。これは通常、数分間遅い速度で動物を前方に動かす頭から尾への筋収縮の繰り返し波を伴うクロールの期間が続きます(図4A)。光学記録でこれらのエスケープモータープログラムをキャプチャするために、PDAは孤立した脳の準備で右ペダル神経節の後側表面に焦点を当て、吸引電極を対側(左)ペダル神経9(PdN9)に置いた。図4B)。連続的な20分の光学記録(図4C)に1分間、PdN9はギャロップ・クロール・モータ・プログラム・シーケンスを惹起するように刺激された。記録されたすべての81個のニューロンからの信号の確率的ガウス空間分布は、神経節にマッピングされた(図4D)。完全な記録に適用された次元減少は、エスケーププログラムのギャロップ(シアン)およびクロール(ダークブルー)フェーズが異なる領域を占め、それぞれ異なる軌道、スパイラル状およびループ状、主成分空間で形成されたことを明らかにした(図4E)。
図 4に示すAplysiaの記録に基づく 3 つのビデオは、このようなデータセットで実行できるさらなる種類の分析を示しています。ビデオ 1は、記録の全期間にわたって記録されたすべてのニューロンの発射をアニメーション化します。脱出運動プログラムの最初の刺激後の期間はギャロップによって特徴づけられ、ガングリオンの活動は異なる機能クラスタの交互破裂によってマークされた(Video 2)。ギャロップはその後、クロールに移行し、ニューロンクラスター全体の活動は広くフェージックなままであったが、神経節の反時計回りの回転軌道を仮定した(ビデオ3)。後者の2つのビデオにはコンセンサスクラスタリングも組み込まれており、エスケープ応答のギャロップとクロールフェーズの異なる機能的アンサンブルの発射と位置を別々に明らかにします。ギャロップとクロールの両方の段階で同じクラスターに割り当てられた多くのニューロンは、ガングリオン内で互いに物理的に近接し、以前の知見12と一致していることに注意してください。
ベルヒア aeolid nudibranch ベルヒアステファニー (図5A)は、神経科学のための新しいモデルシステムを表しています。典型的な ベルグア 実験のイメージング設定を 図5Bに示します。広範囲の神経活動を惹起するために、最も顕著な左ペダル神経に吸引電極を置き、神経刺激を30sで2分の記録に送達した。ICA処理された痕跡は、55ニューロンにおける自発的および刺激誘発活性の両方を明らかにした(図5C)。コンセンサス クラスタリングによるコミュニティ検出では、図 5D に示されている 10 個の異なる機能アンサンブルを識別し、 図 5Eでは、クラスタリングの割り当てに基づいて 図 5C に示すトレースを再編成しています。すべての記録されたニューロンからの信号のガウス分布は、全55の記録されたニューロンの位置を示すために 図5F の準備の画像に重ね合わされる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig1.jpg"> 図1:光イメージングリグとフォトダイオードアレイ(PDA)の眺め。(A)PDA、デジタルカメラ、顕微鏡、およびステージを搭載した光学イメージングリグ。(B) 光ファイバーが464フォトダイオードに画像絞りを接続するPDAの内部設計。アンプの列は、フォトダイオードの上にあります。(C)撮像アパーチャーの六角形の面を、画像化される領域が焦点を合わせたもの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig2.jpg"> 図2:光記録を得る上で不可欠なワークフローを示すフローチャート。 VSDイメージングプロトコルの重要なステップは、解剖と染色からイメージングの詳細まで、このフローチャートに示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig3.jpg"> 図3:トリトニア・ジオメデアの結果、生、フィルター、スパイクソートされたデータを示す。(A)トリトニアは、体の背側と腹側の屈曲を交互に構成する泳ぎを通して捕食海の星ピクノポディア・ヘリアントイドから脱出する。(B)イメージング設定の概略図。脳神経節のCe=脳神経節の葉;Pl =脳胸骨神経節の胸葉;Pd = ペダルガングリオン。(C)20枚のフォトダイオードからの生データは、逆側PdN3の刺激(矢印で示される刺激)に左ペダル神経節の活動を表示する。(D) Cと同じダイオードからのフィルタリングされたデータ (5 および 100 Hz バンドパス バターワース フィルター)。(E) 464ダイオードで収集された圧縮トレースが準備の画像に重畳されるイメージングソフトウェア出力。トレースがCとDで示されている 20 個のダイオードの位置は、赤で強調表示されます。(F) ICAを介したスパイクソートによって生成された30個の単一ニューロントレースを選択した。(G) Fの赤いボックスに対応する 4 つの単一ニューロン トレースの拡大図は、より高い時間分解能でそれらの作用電位を表示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig4.jpg"> 図4: Aplysia カリフォルニカの結果、 長時間記録、シグナルマッピング、および次元の縮小を示す。(A) Aplysiaの逐次脱出モータープログラムの2つの段階、ギャロップとクロール。(B)イメージング設定の概略図。Ce = 脳神経節;Pl = 胸膜神経節;Pd = ペダルガングリオン。(C)右ペダルガンギオンの81個のニューロンの20分の記録が、逆方向PdN9(矢印で示される)への刺激に反応する。トレースの下にある緑、シアン、濃い青色のバーは、それぞれ、刺激前の期間、ギャロップ、およびエスケープモータープログラムのクロール段階を示します。(D) ICAによって同定された全81の神経信号源の位置のマッピングされた確率的ガウス分布を用いた準備の画像。緑色のアウトラインは、ガングリオンに対するPDAの六角形の面の位置を表します。各ガウスの数字は、Cのトレース番号に対応しています。(E) 主成分分析を用いた寸法縮小は、20分のファイルの間に最初の3つの主要成分を互いにプロットする。刺激前のベースライン、ギャロップ、およびクロールエポックは、それぞれ緑、シアン、濃い青色で示されています。この記録に対応する神経発火のアニメーションについては、ビデオ1-3を参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig5.jpg"> 図5:ベルガ・ステファニーエ、神経科学の新種、ネットワークグラフ化、機能クラスタリング、および両側シグナルマッピングの結果。(A)ベルガアの標本。(B)イメージング設定の概略図。Ce = 脳神経節の脳葉;Pl =脳胸骨神経節の胸葉;Pd = ペダルガングリオン;Rh = 鼻泳子ガングリオン。(C) 脳神経節における55の両側ニューロンの自発的および刺激誘発活性を示す痕跡(刺激の送達は矢印によって示される)。(D) コンセンサス クラスタリングによって識別される、それぞれ固有の色を割り当てた 10 個の機能アンサンブルを表示するネットワーク グラフ。このプロットのノードはニューロンを表し、ネットワーク空間の距離はアンサンブル内およびアンサンブル間の発火相関の程度を表します。(E) Cのトレースは、(Dの配色に従って) 機能アンサンブルに並べ替え、色分けされます。(F) 記録されたすべてのニューロンからの信号のマップ位置と、それらが対応するCおよびEのトレース番号を示す準備の画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ1:完全な、20分のアプリジアエスケープ運動プログラムのアニメーション。右のペダル神経節の81個のニューロン(左パネル)に位置する白い形状の不透明度は、対応するニューロンの痕跡(右パネル)によって駆動され、平均スパイクレート(記録中のリアルタイムの0.61秒ごとにビン分割)の関数として直線的に変化した。各ニューロンについて、完全な不透明度を記録期間中の最大焼成率に正規化した。ビデオの経過時間の 1 秒は、12.2 秒のリアルタイムを表します。スケール バーはリアルタイムに対応し、トレースの下にある緑、シアン、濃い青色の線が、それぞれエスケープ ロコモーター プログラムのプリ刺激ベースライン、ギャロップ、およびクロール の各フェーズを示します。ギャロップフェーズの周囲の黄色のボックスとクロールフェーズの一部は、ビデオ 2と3のアニメーションを生成するために使用される記録の抜粋を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video1(Full)_reduced.mp4" target="_blank">このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。</a>
ビデオ 2:Aplysia エスケープ運動プログラムのギャロップフェーズのアニメーション。 コンセンサスクラスタリングは、運動プログラムのギャロップ段階で記録されたすべての81個のニューロンに対して行われ、機能的アンサンブルを導出し、ref.12で説明されたアプローチとソフトウェアを使用して行われた。脱出プログラムのこの段階の間に主に強壮性または不規則な発火パターンを示すニューロンアンサンブルは、このビデオから省略された。黒とオリーブグリーンのアンサンブルに属するニューロンのアクションポテンシャルは、ビデオのオーディオトラックで聞こえ、対応するニューロンとトレースが強調表示されます。平均スパイクレートは 、ビデオ1 と同等の時間ビニングと同様に正規化されました。ビデオの経過時間の1 sは、リアルタイムの6.1 sに対応しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video2(Gallop).mp4" target="_blank">このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。</a>
ビデオ 3:Aplysia エスケープ運動プログラムのクロール段階のアニメーション。 コンセンサスクラスタリングは、機能的アンサンブルを導出するために、モータプログラムのクロール段階だけで81個の記録されたニューロンすべてに対して行われた。モータープログラムのこの段階で主に強壮性または不規則な発火パターンを示すアンサンブルは、このビデオから省略されました。平均スパイクレートは 、ビデオ1 と 2 のように正規化され、同等の時間ビニングで正規化されました。ビデオの経過時間の 1 s は、リアルタイムの約 12.2 s に対応します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video3(Crawl)_reduced.mp4" target="_blank">このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。</a>

このプロトコルは、吸光度の電圧依存性色素とフォトダイオードアレイを用いた非トランスジェニック無脊椎動物種における単細胞分解能を用いたニューロン集団活性をイメージングする方法を提示する。このアプローチにより、迅速なワークフローが可能になり、イメージングと解析を1日にわたって追求できます。

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

この記事では、フォトダイオードアレイと電位感受性色素を使用して、多数のニューロンからの活動電位を同時に記録する方法について詳しく説明します。神経活動のカルシウムイメージングが間接的であるのに対し、私たちが使用する電位感受性色素は、シャープな電極記録と直接同様の活動電位を記録しますが、同時に多くのニューロンにまたがって記録します。当社の光学イメージングワークフローは、さまざまな非トランスジェニック無脊椎動物系や脊椎動物系において、単一ニューロンと単一活動電位分解能でネットワーク活動を迅速に可視化するように適応させることができます。さらに、私たちのプロトコルの手順をデモンストレーションするのは、私の研究室のEvan Hillです。まず、40グラムのAplysia californica動物に麻酔をかけ、ワックスで裏打ちされた解剖皿に腹側を上にして固定します。解剖ハサミを使用して、足の最も前方の範囲に沿って2〜3センチメートルの正中線切開を行い、切開の両側にある足のフラップをピンで留めて、中枢神経系と頬側腫瘤の一部を明らかにします。鉗子と解剖ハサミを使用して、頬側腫瘤を慎重に解剖し、大脳神経節を明らかにし、動物の体を支配する神経を切断して中枢神経系を切除し、刺激する神経を長く残します。生理食塩水で満たされたエラストマーで裏打ちされた皿に中枢神経系を配置するために微細なピンを使用し、ペルチェ冷却装置を通過した生理食塩水で皿を灌流して、調製温度を摂氏15〜16度に保ちます。鉗子とマイクロダイセクションハサミを使用して、神経から余分な結合組織を取り除き、イメージングする神経節または神経節の鞘の表層部分を解剖します。次に、洗浄した中枢神経系を生理食塩水の0.5%グルタルアルデヒドの溶液に20秒間浸してから、中枢神経系を生理食塩水で灌流したエラストマーで裏打ちされた皿に戻して、余分なグルタルアルデヒドを洗い流します。電位感受性色素の作業溶液を調製するには、RH 155の固体アリコートに500マイクロリットルの生理食塩水を加えて、0.3ミリグラム/ミリリットルの最終色素濃度を達成します。また、ハンドヘルドマイクロディスペンサーを使用して、染色する神経節と同様の直径のポリエチレンチューブに200マイクロリットルの溶液を充填します。マイクロマニピュレーターを使用して、チューブの端をターゲット神経節の上に慎重に置き、神経節にぴったりとシールを形成するまでチューブを下げます。マイクロディスペンサーのアプリケーターノブを5分ごとに1時間回して、神経節にさらに色素を強制し、30分後にサンプルをチェックして適切な染色が行われていることを確認します。染色後、照明を暗くしたまま、生理食塩水含有イメージングチャンバー内の製剤を配置する場所の左右に適切な緩衝材を置き、中枢神経系をチャンバーに浸します。適切なサイズのカバースリップを組織に押し付け、カバースリップをしっかりと押して、ニューロンを損傷することなく組織を平らにします。次に、イメージングチャンバーを解剖顕微鏡下に置きます。神経を刺激して架空の運動プログラムを誘発する場合は、PE100ポリエチレンチューブのセグメントを炎で慎重に溶かし、チューブセグメントの両端を静かに引っ張りながら、結果として生じるテーパを目的のポイントで切断します。次に、ポリエチレン吸引電極の後端に厚肉のフレキシブルポリマーチューブを取り付けます。次に、口の部分を使用して負圧を作り出し、吸引電極の先細りの端から少量の生理食塩水を引き出します。刺激する神経の端を顕微鏡下で電極に引き込み、電極内の生理食塩水に電気伝導を妨げる可能性のある気泡がないことを確認します。神経節のイメージングには、チャンバーをイメージングリグに移動し、記録チャンバーを通じて生理食塩水灌流を開始します。調製物の近くに温度プローブを置き、イメージングする種に適した温度を設定します。1本の塩化物銀線を吸引電極の下に置き、電極の生理食塩水に接触することを確認し、銀線を吸引電極近くの浴食塩水に配置します。水浸レンズを生理食塩水に下げ、ベースダイヤフラムを閉じます。サブステージコンデンサーを上下させ、絞りの端がシャープにピントが合うまでフォーカスを調整し、コーラー照明を作成します。イメージングする調製物の領域に焦点を当て、同焦点デジタルカメラで目的の神経節の画像を取得します。コントロールパネルのゲインスイッチを1Xに設定し、静止光強度ボタンをクリックして、ダイオードの平均静止光強度を確認します。電圧を調整しますtag刺激装置からLEDランプ電源に送られるレベルは、目的の範囲に入るまで平均静止光強度レベルをチェックし続けます。次に、記録のためにコントロールパネルのゲインスイッチを100Xに設定し、スプリングまたはエアテーブルが浮いていることを再確認します。ライトが暗くなったまま、イメージングソフトウェアでファイルの長さ、経路、および名前を設定し、[データの取得]をクリックして、コンピューターの使用可能なRAMの容量までファイルを取得します。小さな振動が光記録データに大きなアーティファクトをもたらす可能性があるため、記録中は静止しているように注意してください。取得後すぐにデータを表示するには、重ね合わせ機能を使用して、すべての464個のダイオードで収集したデータを神経節画像に重ね合わせ、ソフトウェアで表されるダイオードのいずれかをクリックして、記録データを別のトレース画面に展開します。調製物に対するダイオードの正確な位置合わせを実現するには、ピンホールテストによって決定されたX、Y、および倍率を入力します。活動電位の可視性を最大化し、その後のスパイクソーティングのニューロン収量を向上させるには、5 ヘルツと 100 ヘルツのカットオフを持つバンドパス バターワース フィルターを適用して、低周波ノイズと高周波ノイズの両方を除去します。フィルタリングされた光学データをテキストファイルとして保存し、後で分析するには、ページ画面でTPフィルターボックスを選択します。そして、出力タブで、ページをASCIIとして保存を選択します。次に、表示されるダイアログボックスに適切なファイル名を入力します。ウミヒトデの捕食者との皮膚接触は、トリトニア・ディオメディアの脱出スイムの引き金となり、全身のリズミカルな一連の屈曲で構成され、安全な場所へと押し出されます。この図では、ペダル神経3の刺激前、刺激中、および刺激後の活動を記録する20個のダイオードからの生データとフィルタリングされたデータが示されています。取得直後は、記録アレイの464個のダイオードすべてで測定された信号を、イメージングソフトウェアの調製物の画像にトポグラフィーで表示できます。この解析では、フィルタリングされたダイオードトレースを独立成分分析(ICA)でスパイクソーティングした結果、53個の固有のニューロントレースが得られ、そのうち30個がここに示されています。Aplysia californicaに対する強い嫌悪感を抱く尾の刺激は、動物を素早く前進させる数サイクルのヘッドランジとテールプルのギャロップ期間と、その後のクロール期間からなる2つの部分からなるリズミカルな逃避反応の繰り返しの波を誘発します。この代表的な解析では、20分間の連続光記録の1分間で、ペダル神経9が刺激され、ギャロップクロール運動プログラムシーケンスが誘発されました。記録された81個のニューロンすべてからの信号の確率的ガウス空間分布が神経節にマッピングされました。フルレコーディングに適用された次元削減により、エスケーププログラムのギャロップフェーズとクロールフェーズが異なる領域を占め、主成分空間で異なる軌道を形成していることが明らかになりました。このプロトコールを試行する際には、染色の最適化、振動の最小化、色素の光退色を最小限に抑えながら調製物を通じてPDAに十分な光をルーティングすることなど、重要な考慮事項があります。集団レベルのネットワーク洞察を明らかにした取得後分析の例としては、教師なし学習アルゴリズムのコンセンサスクラスタリングによる機能的アンサンブル検出や、主成分分析を使用した次元削減などがあります。当社のフォトダイオードアレイベースのイメージングシステムと吸収性電位感受性色素の使用を組み合わせることで、長期間にわたる動的ネットワーク進化のモニタリングが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

新皮質のマイクロ回路のネットワークのダイナミクスを理解するために、それは同時に、神経細胞の多数のアクティビティを記録することが不可欠です。のin...

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

電位感受性色素は、その単一細胞から複数の神経節の回路への範囲は調整可能な解像度と、そのようなモルモット腸神経系の神経叢としてそのままニューラルネットワークからの電気活動の光学的記録を有効にする方法このプロトコルは示しています。...

電位感受性色素を用いてモルモット腸ネットワークにおける電気活動の光学的記録

ここでは、カニ口と胃の神経節の神経細胞の詳細なアクティビティの高速かつ高分解能蛍光膜電位感受性色素イメージングのための方法論を提示する。...

電位感受性色素を持つカニ口と胃の神経節における神経細胞の光学的イメージング

皮質機能は、多数のニューロン集団のレベルで発生するので、脊椎動物の中枢神経系の機能を理解することは、多くのニューロンからの記録が必要になります。ここでは、単一セルと単スパイク解像度、ディザリングされたランダムアクセスのスキャンと閾値上の神経活動を記録する光学的方法を説明します。この方法は、高時間分解能で、最大100からニューロンに蛍光体のカルシウムシグナルを記録します。最尤アルゴリズムは、体蛍光カルシウムシグナルから基礎閾値上神経活動をdeconvolves。この方法は、確実に高い検出効率と誤検知率の低さとスパイクを検出し、神経集団を研究するために使用することができます...

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。...

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

このビデオは、電位感受性色素で染色された脳スライスのニューロン活動の変化を観察する手順を示しています。この色素は、ニューロンの蛍光強度を変化させることにより、ニューロンの膜電位の変化を反映しています。このプロセスでは、電気刺激と高度なイメージング技術を応用することで、VSD蛍光に基づく神経膜電位のリアルタイムな変化を視覚的に追跡することができます。...

電位感受性色素で染色された脳切片における神経活動の光学的記録

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線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

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生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

このプロトコルでは、マルチファイバーフォトメトリー記録の実装と実行方法、カルシウムに依存しないアーティファクトの修正方法、およびデュアルカラーフォトメトリイメージングに関する重要な考慮事項について詳しく説明します。...

自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。...

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

学ぶフォトダイオードアレイと電位感受性色素を用いた非トランスジェニック無脊椎動物の単一ニューロン分解能ネットワークダイナミクス記録法。Aplysia californicaを用いた神経活動可視化プロトコル。

非トランスジェニック無脊椎動物における単一ニューロン分解能を用いたネットワークダイナミクスを記録するためのフォトダイオードベースの光学イメージング

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