Name: ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶヒトiPSC由来脳微小血管内皮細胞の誘導・凍結保存プロトコル。血脳関障壁機能をTEER測定と輸送体アッセイで評価し、疾患特異的モデル構築に応用する方法です。

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この研究は、国立精神衛生研究所の新しい科学者のためのバイオビヘイビア研究賞(BRAINS)賞R01MH113858(R.K.へ)、国立衛生研究所賞KL2 TR002542(PL)によってサポートされました。国立精神衛生研究所臨床科学者開発賞K08MH086846(R.K.へ)、シドニーRベアJr財団グラント(P.L.)ドリスデューク慈善財団臨床科学者開発賞(R.K.)、ライアン・リヒト・サン・バイポーラ財団(R.K.)、フィリス&amp; ジェローム・ライル・ラッパポート財団(R.K.)、ハーバード幹細胞研究所(R.K.へ)、スティーブ・ウィリスとエリッサ・フロイト(R.K.へ)。私たちは、彼女の批判的な読書と原稿に関するフィードバックのためにアニー・カトゥリア博士に感謝します。

ヒトiPSCは、マサチューセッツ総合病院およびマクリーン病院の機関審査委員会によって承認されたプロトコルを使用して健康なドナーの線維芽細胞から再プログラムされ、以前の研究44、45、46に記載されているように特徴付けられる。
注:簡単に言えば、線維芽細胞は、mRNAベースの遺伝的リプログラミング47を介してiPSCに再プログラムされた。iPSCは幹細胞培地(SCM)(材料リストを参照)で維持され、SCMの1mLで〜1.2 x 102 細胞/mLの密度で保存され、Rho関連プロテインキナーゼ阻害剤(ROCKi)Y-27632、および10%(v/v)ジメチル硫化物(DMSO)を有する10%(v/v)ジメチル硫化物(DMSO)を有する10%(v/v)の凍結物でC-液体中に凍結した。 以下の手順はすべて、特に明記されていない限り、バイオセーフティキャビネットで行われます。
1. 基質膜マトリックス希釈およびプレートコーティング
<ol><li>希薄(1:50)成長因子は、フェノールレッドなしのダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)のエンゲルブレス-ホルム群発腫瘍から精製された基質膜マトリックスを減少させた。</li>
	<li>細胞培養プレートに適量の希釈基質膜マトリックス(すなわち、6ウェルプレート=1mL、12ウェルプレート=0.5mL)を塗布し、これらのプレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートする。</li>
</ol>2. iPSC メンテナンス
注:6ウェルフラットボトムプレートのウェルあたりの最大合流値は〜1.2 x 106 細胞です。
<ol><li>凍結保存されたiPSCを10 μM Y-27632でSCMに解凍し、希釈成長因子でコーティングされた6ウェルプレートにプレートを貼り付け、基部膜マトリックスを減少させます。</li>
	<li>解凍後の最初の24時間、10 μM Y-27632でIPSCをSCMに維持します。24時間後に新鮮な培地に切り替えます。</li>
	<li>細胞が合格する前に80-90%の合流度に達するまで、SCMでiPSCを維持します。<ol>
<li>分化に必要な密度(15,600セル/cm2)をウェルの表面積で乗算することにより、分化に必要なiPSCの数を計算します。6ウェルフラットボトムプレートの場合、15,600個のセル/cm2 に9.6cm2 を掛け、合計149,760個の細胞/ウェルを求めます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通過するには、ハンクスのバランス塩溶液(HBBS)で細胞を洗います。次いで、37°Cで5分間非酵素性エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)(材料リストを参照)で細胞をインキュベートする。<ol>
<li>セルスクレーパーを使用して、細胞をそっと持ち上げます。新鮮なSCMで細胞を収集します。</li>
		<li>細胞を希釈したSCMでコーティングし、ステップ2.3に記載されているように細胞を維持するか、SCMの1mL、10μM Y-27632、および10%DMSO(v/v)を-160°Cの温度で液体窒素中の凍結保存バイアルに保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. BMEC に対する iPSC の差別化
注: 非酵素 EDTA は細胞を束に分離します。酵素EDTA( 材料表を参照)は、細胞を単一細胞懸濁液に分離する。レチノイン酸(RA)は光から保護する必要があります。
<ol><li>ダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩基(DPBS)でiPSCを一度洗います。酵素EDTA(6ウェルプレート用1mL、12ウェルプレートの場合は0.5mL、24ウェルプレートでは0.25mL)を37°Cで約5分間インキュベートし、単一の細胞懸濁液を得る。</li>
	<li>細胞と遠心分離機を室温で5分間300xg(相対遠心力)で収集します。10 μM Y-27632 を含む SCM の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>トリパンブルーと自動セルカウンターまたはヘモサイトメーター装置を使用して細胞密度を決定します。SCMの15,600細胞/cm2 または149,760細胞/ウェルの密度のプレートセルは、10 μM Y-27632を24時間含むSCMの6ウェルフラットボトムプレート(表面積9.6 cm2/well)です。</li>
	<li>SCMをE6培地に変更して24時間後に分化を開始します。次の4日間、E6培地を毎日変更します。</li>
	<li>分化の4日目に、希釈(1:200)B27サプリメント、20 ng / mL bFGF、および10 μM RAを添加したhESFMでE6培地を交換してください。このメディアは、次の 48 時間変更しないでください。</li>
	<li>希釈(1:200)B27でhESFMの200 mLを調製し、hESFMの199 mLに50倍濃縮B27サプリメントの1 mLを混合します。</li>
	<li>トリスバッファー(5 mMトリス、pH 7.6、150 mM NaCl)の250 μLで50 μgのbFGFを再構成して、200 μg/mL のストック溶液を作り出し、bFGF の 20 ng/mL を調製します。200 μg/mL bFGF の 20 μL を 200 mL の hESFM と混合して 200 ng/mL bFGF を含む hESFM の 200 mL を準備します。</li>
	<li>まず、2.5 mLのDMSOを100mgのRA粉末に加えて、40mg/mLのRAストック溶液を作って10μM RAを調製します。この濃度を3 mg/mLに希釈して10 mMのストック液を作ります。10μM RAを含むhESFM 200 mLを200 mL hESFMに200 μM RAの200 μL混合して準備します。</li>
</ol>4. iPSC由来BMECの精製用コラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスのコーティング
<ol><li>2 mg/mL FNストック溶液を作るためにFNの2mgに滅菌水の2 mLを加えます。5 mg/mL COL4 ストック溶液を作るために5 mg の COL4 に無菌水の 5 mL を加えます。<ol>
<li>FNを37°Cで少なくとも30分間溶解させ、コル4を室温で溶解させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌水中のFNストック溶液を100 μg/mLの最終濃度に希釈し、コル4ストック溶液を400 μg/mLの最終濃度にします。</li>
	<li>目的のプレート(6ウェルプレート=1mLのCOL4/FN溶液、12ウェルプレート=0.5mL、24ウェルプレート=0.25mL、12トランスウェル濾過プレート=0.25mL)を400μg/mL COL4と100μg/FNLの混合物でコーティングします。</li>
	<li>プレートを37°Cで最低2時間または一晩インキュベートします。トランスウェルの濾過プレートには、最低4時間を推奨します。</li>
</ol>5. iPSC由来BMECsのサブカルチャーと精製
注:酵素EDTAによるインキュベーションは、分化の6日目の細胞の合流度に応じて15分以上かかることがあります。
<ol><li>分化の6日目に、DPBSで細胞を2回洗浄する。1 mLの酵素EDTAを1mLで、1つの細胞懸濁液が得られるまで37°Cで少なくとも15分間インキュベートする。</li>
	<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。希釈された(1:200)B27サプリメント、20 ng / mL bFGF、および10 μM RAで新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>400 μg/mL COL4 と 100 μg/mL FN の混合物でコーティングされたプレートに細胞をシード. 12 ウェルプレートの 3 ウェルに対する 6 ウェルの比率を使用して、12-トランスウェルフィルタープレートの 3 つのウェル、または 24 ウェル プレートの 6 ウェル。</li>
	<li>同じ細胞株から、TEER分析用の負のコントロールとして、12トランスウェル濾過プレートをコーティングした12トランスウェルにコーティングされたプレートに未分化のiPSCをシードします。</li>
	<li>サブ培養の24時間後、B27サプリメントのみで培地をhESFMに変更する。この手順の後に、メディアの変更は必要ありません。</li>
</ol>6. 発芽アッセイ
<ol><li>8日目のiPSC由来BMECを収集し、100,000個の細胞/ウェルで播種し、200μL/cm2 の基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルフラットボトムプレートに播種します。</li>
	<li>これらの細胞を希釈(1:200)B27および40ng/mLの血管内皮増殖因子A(VEGFA165)で治療してください。</li>
	<li>細胞を24時間ごとに観察し、2日ごとに培地を変える。</li>
</ol>7. 免疫細胞化学(ICC)
メモ:ICCは24ウェルフラットボトムプレート上で行われます。
<ol><li>48時間のサブ培養(8日目)の後、DPBSで細胞を2回洗浄する。4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を20分間固定します。</li>
	<li>DPBSで細胞を3回洗浄し、1回5分洗浄します。5%ロバ血清と0.3%トリトンX-100(v/v)を用いたDPBSの室温で1時間のプレブロック細胞。</li>
	<li>一次抗体でインキュベート:マウス抗ヒトPECAM1(1:100、ストック0.5mg/mL)、ウサギの抗ヒトTJP1(1:200、 在庫 0.53 mg/mL、マウス抗ヒトCLDN5(1:200、在庫0.5 mg/mL)、マウス抗ヒトOCLN(1:200、ストック0.5 mg/mL)、ウサギの抗ヒトSLC2A1(1:100、在庫0.2 mg/mL)、DPBSで一晩で5%のドンキーを含む<ol>
<li>DPBSで細胞を一度洗い流し、次にDPBSで1回5分間洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二次抗体を含むインキュベート細胞:ロバ抗ウサギアレクサFluor 555(1:200)とロバ抗マウス488(1:200)を含むDPBSで5%ロバ血清を1時間含む。</li>
	<li>このインキュベーションに続いて、Hoechst 33342三水塩化物三水和物をDPBSで10分間希釈(1:1000)を加えます。<ol>
<li>Hoechst 33342溶液を取り出し、DPBSで1回洗い流し、1回の洗浄につき5分間DPBSで4回洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、細胞メーカーの発現と局在を探します。</li>
</ol>8. TEERの測定および分析
注:コーニング12-トランスウェル濾過プレートは、1.12 cm2 ポリエチレンテレフタレート膜および0.4マイクロメートルの細孔からなるフィルタが装備されています。TEERの測定は技術的(ウェルあたり3)および生物学的複製(細胞株および/または条件当たり3つのウェル)で得られる。
<ol><li>サブ培養(7日目)の24時間後に、24時間ごとに箸電極とボルトメーターを使用してTEERを測定します。測定の取得に関する具体的な説明については、voltohmmmeterユーザーマニュアルを参照してください。<ol>
<li>TEERを測定するには、前の晩に電圧計計を充電します。楽器と箸の電極を70%エタノールで軽く拭き取ってから、安全フードに入れます。</li>
		<li>電源を入れ、製造元が推奨するオームメーターを調整します。</li>
		<li>70%エタノールを使用して箸の電極とリンス電極を差し込み、その後DPBSを使用します。</li>
		<li>短い端電極をトランスウェルインサート(アピカルチャンバー)に入れ、長い端をバソラハアチャンバーに入れます。</li>
		<li>まず、COL4/FNのみでコーティングされたブランクウェルを測定します。その後、他の井戸を測定します。</li>
		<li>異なる条件(すなわち異なる細胞株を測定する)を測定するとき、70%エタノールとDPBSで箸の電極を素早くすすぐ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての測定(Ω)が記録された後、70%エタノールと滅菌水で箸の電極をすすいでください。電極を軽く拭き取り、安全フード内で空気を乾燥させます。</li>
	<li>空白ウェルから TEER 値 (Ω) を 3 重に平均し、条件ごとに各未加工の TEER 値からこの平均値を差し引きます。<ol>
<li>減算された値を平均化し、1.12 cm2 (12 トランスウェル挿入物の表面積) を掛けます。</li>
		<li>ステップ 6 の変換された値を使用して、TEER 測定の各日の TEER 値と標準誤差を示すグラフを生成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 流出トランスポーターの活動と分析
注:流出トランスポーター活性アッセイは、24ウェルフラットボトムプレート上で行われます。目的の流出トランスポーターは、ABCB1およびABCC1を含む。各条件は、コントロールウェル(すなわち、それぞれの阻害剤のないブランクウェル)で三重に行われることをお勧めします。
<ol><li>48時間のサブ培養(8日目)の後、10μMバルスポダール(ABCB1阻害剤)または10μM MK571(ABCC1阻害剤)を37°Cで1時間インキュベートする。<ol>
<li>412 μLのDMSOに5mgの粉末(1214.64 g/mol)を溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mMバルスポダールストックを調製します。例えば、10 μM バルスポダールで 10 mL の hESFM を作るためには、10 mM バルスポダールの 10 μL を 10 mL の hESFM と混ぜます。</li>
		<li>5 mg粉末(537.07 g/mol)を931 μLに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mM MK571ストックを調製します。例えば、10 μM MK571で10 mLのhESFMを作るためには、10 mM MK571ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1時間後、10μMローダミン123(ABCB1基質)または10μM2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセインジアセインジアセア(H2DCFDA、ABCC1基質)を37°Cで1時間、または無用にインキュベートする細胞。<ol>
<li>10 mgの粉末(380.82 g/mol)をDMSOの875 μLに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して10 mMローダミン123を調製します。例えば、10 μMローダミン123で10mLのhESFMを作るために、10 mMローダミン123ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混合します。</li>
		<li>50 mgの粉末(487.29 g/mol)を10.26 mLのDMSOに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mM H2DCFDAを調製します。例えば、10 μMローダミン123で10mLのhESFMを作るために、10 mMローダミン123ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5%トリトンX(v/v)を含むDPBSを使用して、0.5 mLのDPBSと溶菌で細胞を2回洗浄します。</li>
	<li>マルチプレートまたはマイクロプレートリーダーを使用して、細胞の発光を測定します(材料リストを参照)。<ol>
<li>蛍光プレートリーダーの計測器を485ナノメートル励起と530ナノメートルの発光に設定し、これらの波長で蛍光を測定します。</li>
		<li>トランスポーターアッセイに使用されていないウェルの場合、細胞核定量のために4%PFAで固定する前に、DPBSで細胞を2回洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hoechst 33342三水和物を用いたインキュベート細胞は、DPBSで10分間希釈した三水塩化物(1:1000)各ウェルに複数の視野を画像化し、蛍光顕微鏡を用いて平均細胞核数を計算する。</li>
	<li>フィジーを使用して核を数え、これらのカウントに細胞ごとに蛍光値を正規化します。<ol>
<li>それぞれのブランク値から各条件の生蛍光蓄積値を差し引いて、蛍光の平均蓄積を計算する。</li>
		<li>各条件の平均減算値。</li>
		<li>ステップ 9.6.1 の平均値を平均セル数で割ります。これらの値を使用して、細胞ごとに蛍光値を正規化します。</li>
		<li>正規化された値を使用して、各インヒビター条件のグラフィカル表現を生成し、必要な統計分析を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. BMECのパッシング、拡大、凍結保存
<ol><li>希釈された(1:200)B27を補充した新鮮なhESFMで8日目のBMEC培養物を補充し、細胞がCOL4 / FNマトリックスでさらに2日間拡大できるようにします。</li>
	<li>新しい12-トランスウェルろ過プレートと24ウェルフラットボトムプレートに400 μg/mL COL4と100 μg/mL FNをコーティングし、4時間インキュベートします。</li>
	<li>10日目に、DPBSで細胞を洗浄し、1つの細胞懸濁液が得られるまで37°Cで少なくとも15分間酵素EDTAの1mLでインキュベートする。</li>
	<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。<ol>
<li>これらの細胞を凍結保存するには、30%の胎児ウシ血清(FBS)および10%DMSOで新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
		<li>iPSC由来のBMECを-80°Cで最初の24時間イソプロパノール容器に凍結保存されたバイアルに保存し、次に液体窒素に入れて-160°Cで長期保存します。</li>
		<li>これらの細胞を通過させるために、希釈された(1:200)B27を補充した新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ10.2で調製したコーティングされたプレートに細胞をシードする。6ウェルプレートの1ウェルの比を使用して、12-トランスウェル濾過プレートの3つの井戸と24ウェルプレートの6ウェルにシードセル。細胞が 24 時間成長し、拡大することを許可します。</li>
	<li>11日目に、ステップ8に記載されているステップに従ってTEERを測定します。</li>
	<li>12日目に、手順9に記載されている手順に従ってICCを実行します。</li>
	<li>凍結保存されたBMECを解凍するには、凍結保存されたバイアルを温水またはビーズバスの37oCに入れます。解凍したBMECsを希釈(1:200)B27で補ったhESFMの5 mLに移します。<ol>
<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。希釈(1:200)B27、10 μM RA、10 μM Y-27632を補ったhESFMで細胞を再懸濁します。</li>
		<li>24時間後、希釈された(1:200)B27と10 μM Y-27632を添加したhESFMに媒体をRAなしで切り替える。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

変更とトラブルシューティング
このプロトコルでは、BMECsの誘導のためにiPSC培養中に一般的に使用される細胞外マトリックスおよび細胞培養培地を使用する際にいくつかの変更を加えた(図1)。これらの変更は、Lippmann プロトコル1に記載されているように、ヒト iPSC から BMECS を導出する能力に影響を与えませんでした。異なる健康なドナーからのiPSCラインは、この変更されたプロトコルが他の行1との以前の研究に匹敵する結果を示すことを実証するために使用された。凍結保存のために、B27サプリメントは1%血小板貧血漿由来血清(PDS)40の代わりに使用されたが、これは、その後の培養におけるBMECの忠実度に影響を与えた。トラブルシューティングに関しては、TEER 値は安定化する前に急激に変動する可能性があります。この変動は、プレートを37°...

血液脳関門機能 血液脳関門(BBB)は、血液から脳への物質の移動を制限する境界を形成する。BBBは、血管系を裏打ちする単層を形成する脳内血管内皮細胞(BMEC)で構成される。BMECは、アストロサイト、ニューロン、ペリサイト、ミクログリア、および細胞外マトリックスと共に、神経血管ユニットを形成する。BMECは、BBBが高い経皮電気抵抗(TEER)を維持することを可能にする厳しく調節されたパラセルラー構造を有し、受動拡散を制限し、バリア完全性1、2の指標として機能する。BMECsはまた、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、およびトランスマイグレーションなどの細胞間移動を助けるタンパク質、ならびに免疫応答3中の白血球の飛散を助けるタンパク質を有する。BMECは、脳内の恒育的バランスを維持するために、廃棄物の栄養と除去のために流入および流出輸送器に依存しています3.例えば、溶質キャリアファミリー2メンバー1(SLC2A1)は、BBB4を横切るグルコースの移動を担う流入トランスポーターであり、ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1(ABCB1)およびATP結合カセットサブファミリーCメンバー1(ABCC1)などの流出トランスポーターは、基材を血流3、5、6、7に戻す責任を負う。ABCB1基質は、モルヒネ、ベラパミル4、オランザピンおよびリスペリドン8などの抗精神病薬を含み、一方、ABCC1トランスポーターは、硫酸コンジュゲート、ビンクリスチン、グルクロニド共役体4を含む様々な基質を有する。
精神障害におけるBBBモデルの応用 BBB機能障害は、統合失調症および双極性障害9,10を含む多くの神経学的および精神疾患に関与している。近年、iPSC由来のex vivo細胞モデルは、精神疾患の細胞および分子基盤を問い合わせるのに利用されているが、これらのモデルは現在、神経血管系11、12、13が果たす潜在的な役割を考慮していない。血液中を循環する末梢炎症性サイトカインがBBB14、15、16、17に悪影響を及ぼす可能性があると仮定されているが、細胞内18、19、20、21、22、トランスセルラー23、24、25、26、27、28、29、および細胞外マトリックス20、29、302、32に対する異常を示す証拠もある。 BBBの破壊は、血液の内容物が脳実質に入り、アストロサイトおよび/またはミクログリアを活性化して炎症性サイトカインを放出し、脳34に有害な影響を及ぼし得る炎症反応33を開始する。BMECはBBBの主要な構成要素であり、これらの細胞の構造および機能を調べることは、神経学的および精神障害におけるBBB機能不全の理解を高めることができる。
代替BMECモデル iPSC1,6,35,36からBMECを導出するための効率的なプロトコルが開発される前に、研究者はBBB機能を研究するために不死化BMEC37を採用していました。しかしながら、これらのモデルの多くは望ましいBBB型を達成することができず、このようなTEER値の生理学的範囲は38,39である。iPSCを利用することは、細胞が由来する個体の遺伝的背景を保持するという利点がある。科学者たちは、人間の脳の構造と機能を再現するiPSC由来のex vivo微小環境モデルの確立に積極的に取り組んでいます。研究者たちは、生体内で見つかったBMECsと構造的および生理的に類似したBMECを導き出す方法を開発した。iPSC由来BMECの精製集団を得るための方法は、プロトコルが過去数年間に最適化されているいくつかの異なるステップを必要とします1,6,35,36.一般に、iPSC由来BMECは、エッセンシャル6(E6)培地で4日間培養され、続いてヒト内皮無血清培地(hESFM)に塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、レチノイン酸(RA)、およびB27サプリメントを添加して2日間培養する。次に、細胞をコラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスで培養し、90%均質BMECs1を得る。
BMECの同一性は、血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM1)、SLC2A1、およびタイト接合タンパク質1(TJP1)、閉塞子タンパク質(OCLN)、およびクローディン-5(CLDN)6などの緊密な接合タンパク質を含むBMECタンパク質の共発現を示す免疫蛍光によって確認される。発芽アッセイは、iPSC由来BMECの血管新生電位を確認するために使用されてきた。6 BMECのBBB完全性は、ヒロインテエル値(〜2000Ω xcm2)37の存在とABCB1およびABCC11、6、36などの流出トランスポーターに対する測定可能な活性によって評価される。Lippmannグループによる最近の方法論的進歩は、実験変動性の低下と再現性の強化を伴うiPSC由来のBMECプロトコルに至った。しかし、彼らがサブ培養段階を超えて拡大し、通過できるかどうかは不明である。私たちの変更されたプロトコルは、8日目以降にiPSC由来のBMECを渡し、凍結保存後にBBBプロパティをさらに拡張できるかどうかを評価することによって、この問題に対処することを目指しています。iPSC由来BMECの経食について記述した研究はないが、凍結融解サイクル40を受けた後に生理学的BBB特性を保持するBMEC凍結保存のためのプロトコルが存在する。しかし、凍結保存後BMECを通過させ、BBB特性を保持できることは知られていない。
Lippmann プロトコルを使用して iPSC から派生した BMEC は、ハンチントン病などの神経疾患における BBB 破壊をモデル化するために利用されてきた7.このようなiPSC由来BMECは、それぞれ41,42の血液CSFバリア及びBBBの破壊に対するナイセリア髄膜炎又はB群連鎖球菌などの細菌感染の影響を調べるためにも用いられている。また、統合失調症患者の22q欠失症候群患者からのiPSC由来BMECを用いて、研究者は、脳43への白血球の募集および外挿を補助するBMECの主要な接着分子である細胞間接着分子-1(ICAM-1)の増加を観察した。これらの研究をまとめると、複雑な神経精神疾患におけるBBB破壊を研究するためのiPSC由来BMECの有用性を示す。

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6964-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗マウスIgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ロバ抗ウサギIgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2) マウス mAb</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3528S</td><td></td></tr><tr><td>CLDN5 (クローディン-5)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン IV ヒト胎盤由来</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533-5mg</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 2 mL めねじポリプロピレン 極低温バイアル&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>&nbsp;8670</td><td></td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;Costar フラットボトム細胞培養プレート(6ウェル)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;Falcon 平底細胞培養プレート(24ウェル)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 透過性ポリエステルメンブレンインサート付きマルチプルウェルプレート(12ウェル)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Countess slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (フェノールレッドなし)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;</td><td></td>A1413202</tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2438-50mL</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>上皮電圧/オーム (TEER) メーター (EVOM2) STX2</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>A1516401</tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F2006-2mg</td><td></td></tr><tr><td>ゲルトレックス LDEVフリー 減少成長因子 基底膜マトリックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス バランス塩溶液 カルシウムとマグネシウム&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ヒト内皮無血清培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 6000</td><td>General Electric</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp;Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MK-571</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7571-5MG</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Occludin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16%</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Envision 2103 マルチプレートリーダー</td><td>パーキン・エルマー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト VEGF 165</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト FGF-基本 (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Σ Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ローダミン 123</td><td>Σ Aldrich</td><td>83702-10MG</td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 (GLUT-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA1-21041</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Cell Signaling</td><td>81778S</td><td></td></tr><tr><td>TJP-1 (ZO-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA5-28869</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン (0.4%) Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Valspodar (Sigma) (シクロスポリン A)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0572-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Versene solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td><td>Tocris/サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

脳内血管内皮細胞(BMEC)は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から分化し、血液脳関門(BBB)機能を研究するためのex vivo細胞モデルを開発することができます。この変更されたプロトコルは、以前のプロトコルで報告されたものとは異なるドナーと試薬を使用して、ヒトのiPSCからBMECを導き出し、拡張し、凍結保存するための詳細な手順を提供します。iPSCは必須6培地で4日間処理され、続いて2日間のヒト内皮無血清培地に塩基性線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、およびB27サプリメントを添加した。6日目に、細胞をコラーゲン/フィブロネクチンマトリックス上で2日間分培養する。免疫細胞化学は、CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1、およびSLC2A1を用いたBMECマーカー分析のために8日目に行われる。ウェスタンブロッティングは、BMECマーカー発現を確認するために行われ、および、内皮マーカーであるSOX17の不存在を確認する。血管形成の可能性は、発芽アッセイで実証される。7日目から箸電極と電圧計を用いて、電気抵抗(TEER)を使用して、内皮間を越えた電気抵抗(TEER)を測定します。ATP結合カセットサブファミリーB部ファミリーB部材1及びATP結合カセットサブファミリーC部材1に対する流出トランスポーター活性は、8日目にマルチプレートリーダーを用いて測定される。BMECsの誘導に成功した、関連する細胞マーカーの存在によって確認され、SOX17の低レベル、血管新生電位、トランスポーター活性、およびTEER値〜2000 Ω xcm2。BMECは、コーティングされたばかりのコラーゲン/フィブロネクチンプレートまたは凍結保存に加える前に、10日目まで拡張されます。このプロトコルは、iPSC由来のBMECを少なくとも1回拡張して通行できることを示しています。しかしながら、凍結保存後に、低いTEER値およびBMECマーカーの局在化不良が観察された。BMECは、他の細胞タイプ(ニューロン、グリア、ペリサイト)、3次元脳モデル(オルガンチップおよびヒドロゲル)、脳オルガノイドの血管化、および神経精神疾患におけるBBB機能障害の研究に使用できます。

BMEC差別化 このプロトコルのいくつかの重要な手順は正確に実行する必要があります (図 1) 。1日目のE6培地使用は重要であり、比較的短時間でiPSCから神経外発性系統を導出するために用いられることが多いため、複数の細胞株36にわたって再現可能な結果を生み出す。もう一つの重要なステップは、E6培地が希釈された(1:200)B27、20 ng / mL bFGFおよび10 μM RAでhESFMに切り替え、iPSC由来のBMECsを拡大する4日目です。B27サプリメントの添加は、無血清細胞培養1をサポートするウシ血清の代替として使用され、bFGFは、iPSC由来BMECs6の成長を容易にするために添加され、およびRAはBBB表現型35の開発を容易にするために使用される。最後の重要なステップは、6日目のiPSC由来BMECがCOL4/FNコーティング...

本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo モデルにおける血液脳関門特性を研究するための適応法を詳述する。

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

iPS細胞から作製したBMECは、血液脳関門の機能と機能障害を研究するための新しい実験モデルを提供します。このプロトコルを使用して、BMECが膨張および凍結保存後もバリア特性を保持しているかどうかを調べました。この技術により、血液脳関門の破壊が疾患の病態生理学に関与する障害を持つ患者から、疾患特異的なBMECを生成することができます。ヒトiPS細胞からのBMEC分化を誘導するには、コンフルエントなiPS細胞培養物をDPBSで1回洗浄してから、細胞を適切な量の酵素EDTAと37°Cで約5分間インキュベートします。単一細胞懸濁液が得られたら、遠心分離により細胞を回収し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した適切な量の幹細胞培地にペレットを再懸濁してカウントします。細胞を1立方センチメートルの濃度あたり10の10倍の濃度に希釈し、2ミリリットルの細胞を6ウェルの平底の個々のウェルに播種します。細胞培養インキュベーターで24時間後、各ウェルの上清をE6培地と交換し、プレートをさらに4日間インキュベーターに戻します。iPS細胞由来BMECを精製するには、ウェルごとに調製したばかりのIV型コラーゲンとフィブロネクチン溶液を適量で培養プレートにコーティングし、プレートを摂氏37度で最低2時間インキュベートします。分化の6日目に、遠心分離によって細胞を収集し、B27、塩基性線維芽細胞成長因子、およびレチノイン酸を添加した新鮮なヒト内皮無血清培地の適切な量にペレットを再懸濁します。TEER分析では、分化した細胞をコラーゲンとフィブロネクチンでコーティングした12トランスウェルフィルタープレートの各ウェルにプレートします。排出トランスポーター活性解析のために、コラーゲンとフィブロネクチンでコーティングされた24ウェル平底プレートの各ウェルに細胞をプレート化します。継代培養の24時間後、各ウェルの上清を、B27サプリメントのみを補充した新鮮なヒト内皮無血清培地と交換します。TEERを使用してBMECの血液脳関門特性を測定するには、TEER機器を一晩充電し、機器と箸電極を70%エタノールで軽く拭いてから、安全フードに入れます。電源を入れ、メーカーの仕様に従ってオームメーターを校正します。電極を差し込み、70%エタノールで1回、DPBSで1回ですすいでください。電極の短い方の端をインサートの非定型チャンバーに入れ、長い方の端をブランクウェルの基底外側チャンバーに入れます。負の制御応答を測定した後、実証されているように電極を迅速にすすぎ、最初の実験井戸を測定します。すべての測定値が記録されたら、箸の電極を再度すすぎ、電極をやさしく拭いて、安全フードで自然乾燥させます。細胞の排出トランスポーター活性を評価するために、培養の8日目に、適切な数のウェルを10マイクロモルの排出トランスポーター阻害剤溶液で処理し、摂氏37度で1時間インキュベーターに入れます。インキュベーションの終了時に、インキュベーター内で10マイクロモルの排出トランスポーター基質溶液で細胞を1時間処理します。インキュベーションの終了時に、各ウェルをウェルあたり500マイクロリットルのDPBSで2回洗浄してから、ウェルあたり5%Triton-Xを添加した500マイクロリットルのDPBSで細胞を溶解します。5分後、マイクロプレートリーダーを使用して、485ナノメートルの励起と530ナノメートルの発光で溶解した細胞の蛍光を測定します。トランスポーターアッセイで使用しないウェルについては、細胞をDPBSで2回洗浄してから、細胞核あたり4%パラホルムアルデヒドで定量します。E6培地で1日培養すると、細胞の形態はiPS細胞と似ています。4日目までに、細胞はiPS細胞とは明らかに異なり、ウェルの大部分を覆っています。ヒト内皮無血清培地で2日間培養すると、細胞内に細長い丸石の外観が誘発されます。8日目には、個々の細胞は大部分が大きな丸石のパターンを形成します。iPS細胞由来BMECの血管新生能を実証するために、スプラウトアッセイを実施することができます。これにより、成長因子治療の3日後にチューブ状構造が発達します。このプロトコールを用いて作製したiPSC由来BMECは、脳、肺、肝臓、腎臓の内皮細胞に発現するタイトジャンクションタンパク質と、血液脳関門に発現する血管内皮マーカーを共発現させました。観察されたように、継代培養および培地変更の48時間後、iPS細胞由来BMECは、ラット初代アストロサイトと共培養したiPS細胞由来BMECについて記載された範囲内のTEER値を示しています。この段階では、排出トランスポーターの活性も観察されました。凍結保存後、TEERの測定値は、新たに得られたBMECと比較して低くなります。ウェスタンブロット解析では、オクルージンなどのタイトジャンクションマーカーのレベルが低下していることが明らかになり、免疫細胞化学ではタイトジャンクションタンパク質のそばかすや擦り切れたパターンが示されています。iPS細胞の密度が高すぎたり低すぎたりすると、分化効率に影響が及び、適切な血液脳関門特性の発現に影響を及ぼします。この方法により、個別化されたBMECを使用してバリア特性、細胞シグナル伝達、およびトランスポーター活性の調査が可能になり、血液脳関門機能の生理学および病態生理学をモデル化できます。

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

このビデオは、人工多能性幹細胞の脳内皮細胞への分化を誘導するプロトコルを示しています。...

人工多能性幹細胞からの脳内皮細胞の作製

このビデオでは、ヒトiPS細胞を脳の微小血管内皮細胞に分化するための多段階のプロセスを示しています。得られた分化細胞は、タイトジャンクションを特徴とする脳の微小血管内皮細胞に密接に類似しているため、脳疾患の研究に最適です。...

ヒト人工多能性幹細胞の脳微小血管内皮細胞への分化

このビデオでは、10〜12日以内に、胚前脳からの内皮細胞の純粋培養を調製するための簡単​​で信頼性の高い戦略を示し、脳血管新生のさまざまな側面に焦点を当てた研究のために有用であろう。...

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

血液脳関門(BBB)は、多細胞神経血管の単位は、密接に脳の恒常性を調節します。ヒトiPSCと臓器オンチップ技術を組み合わせることで、疾患モデリングやCNS薬物浸透性予測に適したパーソナライズされたBBBチップを生成しました。BBBチップの生成と動作に関する詳細なプロトコルについて説明します。...

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

ここに記述されているプロトコルは伝染のための Neisseriaの髄膜炎...

髄膜炎菌 人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染

ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。...

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

ここでは、多能性幹細胞を脳微小血管内皮細胞(BMEC)様細胞に分化させるプロトコルである拡張内皮細胞培養法(EECM)について述べる。これらの細胞は内皮細胞接着分子発現を示すため、in...

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

ここでは、内皮細胞をヒト多能性幹細胞から分化させる簡単なワークフローと、それに続く機械的刺激の詳細なプロトコルについて説明します。これにより、内皮細胞の発生メカノバイオロジーの研究が可能になります。このアプローチは、機械的刺激後に培養チップから回収された生細胞のダウンストリームアッセイに適合します。...

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

私たちは、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の造血前駆細胞(HPC)をオルガノイド開発に組み込むことにより、常在性ミクログリアを持つヒト脳オルガノイドを生成するプロトコルを提示します。...

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

学ぶヒトiPSC由来脳微小血管内皮細胞の誘導・凍結保存プロトコル。血脳関障壁機能をTEER測定と輸送体アッセイで評価し、疾患特異的モデル構築に応用する方法です。

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

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