ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価
2020年11月19日
本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo モデルにおける血液脳関門特性を研究するための適応法を詳述する。
iPS細胞から作製したBMECは、血液脳関門の機能と機能障害を研究するための新しい実験モデルを提供します。このプロトコルを使用して、BMECが膨張および凍結保存後もバリア特性を保持しているかどうかを調べました。この技術により、血液脳関門の破壊が疾患の病態生理学に関与する障害を持つ患者から、疾患特異的なBMECを生成することができます。
ヒトiPS細胞からのBMEC分化を誘導するには、コンフルエントなiPS細胞培養物をDPBSで1回洗浄してから、細胞を適切な量の酵素EDTAと37°Cで約5分間インキュベートします。単一細胞懸濁液が得られたら、遠心分離により細胞を回収し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した適切な量の幹細胞培地にペレットを再懸濁してカウントします。細胞を1立方センチメートルの濃度あたり10の10倍の濃度に希釈し、2ミリリットルの細胞を6ウェルの平底の個々のウェルに播種します。
細胞培養インキュベーターで24時間後、各ウェルの上清をE6培地と交換し、プレートをさらに4日間インキュベーターに戻します。iPS細胞由来BMECを精製するには、ウェルごとに調製したばかりのIV型コラーゲンとフィブロネクチン溶液を適量で培養プレートにコーティングし、プレートを摂氏37度で最低2時間インキュベートします。分化の6日目に、遠心分離によって細胞を収集し、B27、塩基性線維芽細胞成長因子、およびレチノイン酸を添加した新鮮なヒト内皮無血清培地の適切な量にペレットを再懸濁します。
TEER分析では、分化した細胞をコラーゲンとフィブロネクチンでコーティングした12トランスウェルフィルタープレートの各ウェルにプレートします。排出トランスポーター活性解析のために、コラーゲンとフィブロネクチンでコーティングされた24ウェル平底プレートの各ウェルに細胞をプレート化します。継代培養の24時間後、各ウェルの上清を、B27サプリメントのみを補充した新鮮なヒト内皮無血清培地と交換します。
TEERを使用してBMECの血液脳関門特性を測定するには、TEER機器を一晩充電し、機器と箸電極を70%エタノールで軽く拭いてから、安全フードに入れます。電源を入れ、メーカーの仕様に従ってオームメーターを校正します。電極を差し込み、70%エタノールで1回、DPBSで1回ですすいでください。
電極の短い方の端をインサートの非定型チャンバーに入れ、長い方の端をブランクウェルの基底外側チャンバーに入れます。負の制御応答を測定した後、実証されているように電極を迅速にすすぎ、最初の実験井戸を測定します。すべての測定値が記録されたら、箸の電極を再度すすぎ、電極をやさしく拭いて、安全フードで自然乾燥させます。
細胞の排出トランスポーター活性を評価するために、培養の8日目に、適切な数のウェルを10マイクロモルの排出トランスポーター阻害剤溶液で処理し、摂氏37度で1時間インキュベーターに入れます。インキュベーションの終了時に、インキュベーター内で10マイクロモルの排出トランスポーター基質溶液で細胞を1時間処理します。インキュベーションの終了時に、各ウェルをウェルあたり500マイクロリットルのDPBSで2回洗浄してから、ウェルあたり5%Triton-Xを添加した500マイクロリットルのDPBSで細胞を溶解します。
5分後、マイクロプレートリーダーを使用して、485ナノメートルの励起と530ナノメートルの発光で溶解した細胞の蛍光を測定します。トランスポーターアッセイで使用しないウェルについては、細胞をDPBSで2回洗浄してから、細胞核あたり4%パラホルムアルデヒドで定量します。E6培地で1日培養すると、細胞の形態はiPS細胞と似ています。
4日目までに、細胞はiPS細胞とは明らかに異なり、ウェルの大部分を覆っています。ヒト内皮無血清培地で2日間培養すると、細胞内に細長い丸石の外観が誘発されます。8日目には、個々の細胞は大部分が大きな丸石のパターンを形成します。
iPS細胞由来BMECの血管新生能を実証するために、スプラウトアッセイを実施することができます。これにより、成長因子治療の3日後にチューブ状構造が発達します。このプロトコールを用いて作製したiPSC由来BMECは、脳、肺、肝臓、腎臓の内皮細胞に発現するタイトジャンクションタンパク質と、血液脳関門に発現する血管内皮マーカーを共発現させました。
観察されたように、継代培養および培地変更の48時間後、iPS細胞由来BMECは、ラット初代アストロサイトと共培養したiPS細胞由来BMECについて記載された範囲内のTEER値を示しています。この段階では、排出トランスポーターの活性も観察されました。凍結保存後、TEERの測定値は、新たに得られたBMECと比較して低くなります。
ウェスタンブロット解析では、オクルージンなどのタイトジャンクションマーカーのレベルが低下していることが明らかになり、免疫細胞化学ではタイトジャンクションタンパク質のそばかすや擦り切れたパターンが示されています。iPS細胞の密度が高すぎたり低すぎたりすると、分化効率に影響が及び、適切な血液脳関門特性の発現に影響を及ぼします。この方法により、個別化されたBMECを使用してバリア特性、細胞シグナル伝達、およびトランスポーター活性の調査が可能になり、血液脳関門機能の生理学および病態生理学をモデル化できます。
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概要
この研究は、ヒトの誘導多能性幹細胞（iPSC）から脳微小血管内皮細胞（BMEC）を分化、増殖、凍結保存するためのプロトコルを提示します。これは、ex vivoモデルを用いて血液脳関門の特性を調査することに焦点を当てています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- 血管生物学
背景
- BMECは血液脳関門の完全性を維持する上で重要な役割を果たします。
- 血液脳関門の破壊は様々な神経学的障害に関与しています。
- ヒトiPSCは個別化医療アプローチのモデルを提供します。
- このプロトコルは、疾患特異的なBMECの生成を可能にします。
研究目的
- iPSC由来のBMECの分化プロトコルを最適化する。
- 増殖と凍結保存が関門特性に与える影響を評価する。
- これらのBMECを用いて血液脳関門機能を研究する適用可能性を調査する。
使用された方法
- この方法は、段階的な細胞培養プロトコルを通じて、ヒトiPSCをBMECに分化させることに依存しています。
- 主要なステップには、特定の培地で培養すること、ROCK阻害剤の使用、および関門特性の評価のためのトランスウェルアッセイが含まれます。
- 機能分析には、TEER測定と排出トランスポーターアッセイが使用されます。
- 細胞形態と分化効率は8日間にわたってモニタリングされます。
主要な結果
- BME細胞は分化後もタイトジャンクションの特性を適切な形態を保っていました。
- TEER値は機能的完全性を示しましたが、凍結保存によってこれらの特性が低下しました。
- 排出トランスポーター活性が実証され、機能性が保たれていることが示唆されました。
- この方法論により、健康および疾患における血液脳関門メカニズムのモデリングが可能になります。
結論
- このプロトコルは、血液脳関門機能を研究するための患者由来のBMECの生成を可能にします。
- それは凍結保存が関門特性に与える影響についての洞察を提供します。
- この研究は、血液脳関門を標的とする治療戦略の開発に影響を与える可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Human iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (BMECs) enable the development of ex vivo blood-brain barrier (BBB) models for early-stage CNS drug discovery and mechanistic de-risking. This protocol supports the generation, expansion, and cryopreservation of BMECs, facilitating disease-relevant system modeling and functional validation of BBB properties. The approach enhances predictive confidence for BBB permeability and transporter function, directly impacting portfolio triage and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of BBB integrity and transporter activity in disease-relevant human systems.
- Supports mechanistic de-risking by modeling patient-specific BBB dysfunction.
- Facilitates functional target validation for CNS drug delivery strategies.
- Provides a platform for hypothesis testing of BBB-related therapeutic mechanisms.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized BMEC monolayers for quantitative TEER and efflux transporter assays.
- Enables reproducible assessment of compound permeability across the BBB.
- Supports assay scalability and platform reuse for high-content screening.
- Prepares validated biological systems for downstream co-culture and organoid workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro BBB models with translational biomarker endpoints such as TEER and transporter activity.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of CNS drug candidates.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on human-relevant BBB function.
- Supports modeling of BBB dysfunction in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions iPSC-derived BMECs as a bridge from early discovery to preclinical CNS drug evaluation, supporting both target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of BBB mechanisms and pathway clarification in human-derived systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative TEER and transporter activity readouts for compound evaluation.
- Analytics: Delivers standardized measurements for cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with preclinical BBB biomarkers and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse CNS drug discovery and disease modeling initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BBB permeability and transporter function for CNS portfolios.
- Operational Value: Standardizes BMEC derivation, expansion, and cryopreservation for reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-relevant BBB data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS assets based on functional BBB validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, differentiation, and endothelial cell biology.
- Needs access to TEER instrumentation, multi-plate readers, and immunocytochemistry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell density, media, and matrix coatings for reproducibility.
- Adaptation across disease models may require protocol optimization for specific iPSC lines.
- Lower TEER and marker localization after cryopreservation may limit some downstream applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
Brain Microvascular Endothelial Cell (BMEC) Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)
1:46
iPSC-Derived BMEC Subculture and Purification
3:02
Trans-Endothelial Electrical Resistance (TEER) Measurement and Analysis
4:09
Efflux Transporter Activity and Analysis
5:22
Results: Representative BMEC Differentiation and Characterization After Passaging, Subculture, and Cryopreservation
7:18
Conclusion
