Name: 嚢胞性線維症患者の喀痰中の 緑膿菌 の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶ嚢胞性線維症患者の喀痰中における緑膿菌とPsl多糖類の可視化手法。組織透明化と蛍光in situハイブリダイゼーションを用いて、バイオフィルム形成と抗菌薬感受性の関係を解析する方法です。

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著者らは、この研究に資金を提供してくれた嚢胞性線維症財団と、抗Psl0096抗体を惜しみなく寄付してくれたMedImmuneに感謝の意を表したいと思います。この研究では、トロント大学のCAMiLoDイメージング施設でイメージングを実施しました。

研究倫理委員会(REB)の承認は、被験者から喀痰サンプルを収集して保管するために必要です。本論文で紹介する研究は、Hospital for Sick Children REB#1000058579によって承認されました。
1.痰の収集
<ol><li>喀痰を滅菌コレクションカップに保管し、固定前に4°Cで最大24時間直ちに保管します。. 注:固定せずに4°Cで喀痰を長時間放置すると、細胞の分解、特に白血球の分解につながる可能性があります。できるだけ早く固定することが望ましいです。</li>
	<li>喀痰サンプルを滅菌15mLチューブに移します。</li>
	<li>等量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を喀痰サンプルに加えます。例えば、喀痰サンプルが0.5 mLの場合、0.5 mLの4%PFAを加えます。穏やかな反転で混ぜます。</li>
	<li>喀痰を4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>固定喀痰2 mLそれぞれに5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えてサンプルを洗浄します。 注:この洗浄ステップに必要な遠心分離はありません。</li>
	<li>ピペットで上澄みを慎重に取り除きます。 注意: 先端を痰から遠ざけてピペットで痰を吸い上げないようにし、表面の液体を非常にゆっくりと吸引します。洗浄ステップは遠心分離を伴わないため、喀痰栓の構造的完全性を損なわない。</li>
	<li>手順1.6〜1.7をさらに2回繰り返します。</li>
	<li>0.01%(w/v)のアジ化ナトリウムを含むPBSの2倍の容量でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>喀痰を4°Cで保管します。</li>
</ol>2. 喀痰のMiPACT(ティッシュクリアリング技術)処理
<ol><li>ハイドロゲル成分(30%29:1アクリルアミド:ビスアクリルアミド、硬化剤、PBS)を嫌気性パックを含む密閉容器で72時間脱気します。 注:酸素はアクリルアミドの重合を阻害するため、嫌気性パックと密閉容器が必要です。あるいは、嫌気性フード内でこのステップを実行するか、密閉容器に真空を適用するか、またはアクリルアミド混合物を通してN2 ガスをバブリングすることによって、酸素を除去することができる。<ol><li>密封された嫌気性容器内でキャップを外した状態で、30% 29:1 アクリルアミド:ビスアクリルアミド溶液 2 mL を 15 mL チューブに加えます。</li>
		<li>15 mL チューブ中の PBS 5 mL に 0.5 g の硬化剤を添加して、10% (w/v) 硬化剤の濃縮ストックを作成します。キャップをチューブから外し、密閉された嫌気性容器に保管してください。</li>
		<li>数 mLの滅菌PBSを、キャップを外した状態でチューブに入れ、嫌気性容器内に残します。</li>
	</ol></li>
	<li>最終濃度が0.2%硬化剤、4%の29:1アクリルアミド:ビスアクリルアミドをPBSに溶かしたハイドロゲルの溶液を15 mLのチューブで5 mLの溶液にします。反転して混合し、フィルター滅菌します。</li>
	<li>喀痰サンプルを冷蔵庫から取り出し、メスで無菌状態で小さなセクション(直径約5 mm)に切断します。 注:喀痰が非常に流動的な場合でも、このステップを実行できますが、メスを使用して目的の画分を分離する前に、ピンセットで保存溶液から喀痰を取り除くには、忍耐力と練習が必要です。</li>
	<li>カットした喀痰サンプルを8チャンバーのカバーガラススライドのウェル内に置きます。</li>
	<li>ステップ2.2のフィルター滅菌したヒドロゲル溶液300μLを、喀痰を含む各ウェルに加えます。</li>
	<li>嫌気性パックが入った密閉容器内に8チャンバーのカバーガラスを置き、37°Cで3時間放置します。 注:喀痰が埋め込まれたヒドロゲルを重合すると、固いゲルの粘稠度になるはずです。</li>
	<li>凝固したヒドロゲル喀痰サンプルを、pH 8の8%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)5 mLを含む15 mLの培養チューブに移し、喀痰が透明になるまで、37°C(振とうの有無にかかわらず)で3〜14日間サンプルを透明にします。 注:クリアリング時間は喀痰の組成に依存し、一般的に振とうで短縮できます。ただし、サンプルの完全性を損なうほど振とう速度を上げないように注意してください。DNAに富むサンプルが多いほど、粘液に富むサンプルに比べて透明化に時間がかかります。</li>
	<li>8%SDS溶液を廃棄物収集容器にデカントします。滅菌ピンセットを使用して、ハイドロゲルに包埋した各サンプルを滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移します。50 mLのコニカルチューブのそれぞれに10 mLのPBSを加えてハイドロゲルを洗浄し、溶液を30分から1時間放置してからデカントします。これをさらに2回繰り返します。 注意: この洗浄ステップには遠心分離は含まれていません。余分な水分と上澄み液はピペットで慎重に取り除かれます。</li>
	<li>洗浄したサンプルを、0.01%(w/v)アジ化ナトリウムと1x RNase阻害剤を含むPBSで4°Cで保存します。</li>
</ol>3. ヒドロゲル蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)プロトコル
<ol><li>滅菌ピンセットを使用して保存溶液からハイドロゲルサンプルを取り出し、サンプルを滅菌表面(スライドガラスやペトリ皿など)に置きます。</li>
	<li>滅菌メスを使用して、ハイドロゲルを~1mmの厚さのスライスに切断します。</li>
	<li>ハイドロゲルの1 mm切片を滅菌1.5 mLチューブに入れます。</li>
	<li>1.5 mLのチューブに1 mLのハイブリダイゼーションバッファー(25%ホルムアミド、0.9 M NaCl、20 mM Tris-HCl [pH 7.6]、0.01% SDS、精製および脱イオンH2O)を調製します。</li>
	<li>蛍光標識したPseaerAプローブ(150.7 nM12)をハイブリダイゼーションバッファーに添加し、逆位で混合します。 注意: ホルマリン溶液は直火から遠ざける必要があります。ハイブリダイゼーション緩衝液は、事前に調製し、-20°Cでアリコートで保存することができる13。</li>
	<li>200〜500μLのハイブリダイゼーションバッファーをハイドロゲルの各~1 mm切片に添加し、ハイドロゲルサンプル全体が浸漬されていることを確認します。</li>
	<li>PseaerAプローブをヒドロゲルサンプルとハイドロゲルサンプルを暗所に置き、46°Cで振とうせずに18~24時間ハイブリダイズさせます。</li>
	<li>ハイブリダイゼーション緩衝液を廃液回収容器にデカントする。</li>
	<li>フィルター滅菌洗浄バッファー(337.5 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)[pH 7.2]、0.01% SDS、精製および脱イオン化H2O)でサンプルを1回すすぎ、1.5 mLチューブのそれぞれに1 mLの洗浄バッファーを添加し、除去します。 注:洗浄バッファーは事前に作成し、室温(RT)で保存できます。</li>
	<li>新鮮な洗浄バッファー 1 mL をチューブに加え、暗所で 48 °C で 6 時間、振とうせずにサンプルをインキュベートします。</li>
</ol>4. ヒドロゲルとPsl0096抗体の結合
<ol><li>洗浄バッファーを 1 mL ピペッターで滅菌除去します。</li>
	<li>PBS 溶液中の 2% BSA(w/v)溶液に 1 mL の 2% BSA 溶液を加えて除去し、サンプルをすすぎます。</li>
	<li>500 μL の 2% BSA/PBS 溶液をハイドロゲルサンプルに添加して、非特異的タンパク質結合をブロックします。その後、サンプルを暗所の室温で一晩、振とうせずにインキュベートします。</li>
	<li>ブロッキング溶液を1 mLピペットで滅菌除去します。</li>
	<li>Psl0096-Texas Red抗体溶液を、500 μLの新鮮な2% BSA/PBS中で最終濃度0.112 μg/mLに希釈して調製します。</li>
	<li>500 μLの抗体溶液をハイドロゲルサンプルに加え、振とうをせずに、光から保護した状態で室温で6時間インキュベートします。</li>
</ol>5. DAPI(4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール)染色
<ol><li>磁性攪拌子を入れたフラスコに、40 gの非イオン性密度勾配培地、30 μLのTween20、3 μgのアジ化ナトリウム、および30 mLのPBSを加えて、屈折率マッチング溶液(RIMS)を調製します。溶液をマグネチックスターラーで15分間、または完全に溶解するまで攪拌します。</li>
	<li>10 mLのシリンジと滅菌済みの0.2 μmフィルターを使用して、溶液を50 mLのコニカルチューブにフィルター滅菌します。 注:溶液は4°Cで数ヶ月間保存できます。</li>
	<li>Psl0096-Texas Red抗体溶液を滅菌済み1 mLピペットで除去します。</li>
	<li>1 mL の PBS を添加してから除去することにより、ハイドロゲルサンプルをすすぎます。</li>
	<li>ハイドロゲルサンプルを 250 μL の RIMS 溶液と 10 μg/mL の DAPI と室温で、暗所で穏やかに振とうしながら一晩インキュベートします。</li>
	<li>共焦点イメージングの前に、サンプルを0.9mmまたは1.7mmの灌流チャンバーにマウントし、ガラスカバーガラスで密封します。 注:FISHおよび/または免疫組織化学の後、RIMSに浸漬する前に、喀痰粘液の可視化が必要な場合は、蛍光レクチン染色を適用できます12。</li>
</ol>6. イメージング
<ol><li>25倍、40倍、63倍、または100倍の倍率で標準的な技術を使用して共焦点レーザー走査型顕微鏡イメージングを実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis%3A+What+drug+and+which+way%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li>
<li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis%3A+Pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li>
<li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913(2019).</li>
<li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526(2013).</li>
<li>Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+extracellular+polysaccharides%2C+alginate%2C+Pel%2C+and+Psl%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 167(2011).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Wozniak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+is+not+a+significant+component+of+the+extracellular+polysaccharide+matrix+of+PA14+and+PAO1+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).</li>
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</ol>

このプロトコルの目的はCFの患者からの喀痰の P.のaeruginosa のセルのその場の構成に垣間見るようにすることである。喀痰サンプルは、すぐに固定できない場合は、処理されるまで4°Cで保存する必要があります。喀痰中の 緑膿菌 の細胞数は、4°Cで保存した場合、1時間、24時間、または48時間処理しても有意に変化しないことが実証されていますが、25°Cで24時間または48時間放置すると、細菌の増殖の結果として細菌の細胞数が大幅に増加します14。この研究では、喀痰サンプルは去痰後最大24時間まで4°Cで保存されました。炎症性細胞数は、4°Cで放置し、9時間以上後に処理すると、喀痰中に減少することが示されていることに注意する必要があります15。したがって、サンプル処理のカットオフ時間を決定する際には、喀痰で視覚化したい特定の細胞とマーカーを考慮することが重要です。
この方法でのサンプル処理は、喀痰サンプルを 4 % PFA に固定することから始まります...

本研究では、小児嚢胞性線維症(CF)患者の喀痰中の緑膿菌のin vivo構造を可視化する実験が設計されました。緑膿菌感染症は、小児CF人口の30〜40%で慢性化します。慢性感染症が確立されると、それらを排除することはほとんど不可能です1.緑膿菌の早期感染患者から分離された緑膿菌株は、一般的に抗菌薬の影響を受けやすいため、慢性感染症の確立を防ぐために抗シュードモナル抗生物質で治療されます2。残念ながら、すべての緑膿菌分離株が抗生物質療法後に肺から効果的に除去されるわけではありません。抗生物質の失敗に関連する正確なメカニズムは完全には解明されていません。これまでの研究では、バイオフィルム細胞の密度、凝集、多糖類産生のばらつきが抗生物質の有効性に影響を与える可能性があることが示されています3。緑膿菌は、Pel、Psl、アルギン酸の3つの細胞外多糖類を産生します4。緑膿菌のほとんどの菌株は、それぞれのエキソ多糖類を発現する遺伝的能力を持っていますが、多くの場合、1種類の多糖類が主に発現しています5。アルギン酸エキソ多糖類は、CF肺の慢性感染症と関連しており、ムコイド表現型6,7をもたらします。多糖類のPelとPslは、初期接着の補助やバイオフィルム構造の維持、抗生物質耐性の付与など、複数の機能を持っています8。
組織のin vivo構造を可視化することを目的とした方法は、さまざまなサンプルタイプに対して開発されています9,10,11。最近では、CF患者の喀痰中のin vivo微生物群集を視覚化するように調整されています12。喀痰内の微生物群集の同定に特化した組織透明化プロトコルの最適化は、DePas et al., 201612によって開発されました。MiPACTという用語は、Passive CLARITY techniqueの後にmicrobial identificationの略で、CF痰11,12の除去のために造られました。組織透明化技術では、標本は最初に固定され、次に透明化され、染色と顕微鏡的視覚化のために固有の構造をそのまま残します11。CF喀痰サンプルを固定・除去することで、バイオフィルム構造、細菌細胞密度、多微生物との関連、病原体と宿主細胞との関連に関する疑問に答えることができます。喀痰内に保存された細菌を直接調べる利点は、宿主特異的な状況で分析・可視化できることです。実験のために実験室で臨床分離株をin vitroで増殖させることは非常に有益ですが、そのような方法ではCF肺環境を完全に再現することができず、その結果、検査結果と患者の転帰の間に乖離が生じます。
ここで紹介する方法は、CF患者や他の呼吸器感染症の患者からの細菌を視覚化するために、喀痰を固定および除去するために使用できます。本明細書に記載の染色および顕微鏡分析の特定のタイプは、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)であり、続いてハイドロゲル内での抗Psl抗体結合、およびその後の共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)による分析である。組織透明化に続いて、他の免疫組織化学および顕微鏡検査法も適用できます。

<table><tbody><tr><td>29:1 アクリルアミド ビスアクリルアミド、30 % 溶液</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Coverwell perfusion chambers</td><td>Electron Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>注文内容: 製品:改変DNAオリゴ;名前:PseaerA;シーケンス: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC;合成:50 nmol;精製:HPLC;出荷状態:フルイールド(ドライ)</td></tr><tr><td>Psl0096-テキサスレッド</td><td>メディミューン</td><td></td><td>Psl0096-テキサスレッド抗体は、メディミューンから提供された贈り物であり、注文に関するお問い合わせは会社に連絡する必要があります。</td></tr><tr><td>VA-044 硬化剤</td><td>和光</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

嚢胞性線維症患者の喀痰中の 緑膿菌 の可視化

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

嚢胞性線維症患者の肺内の緑膿菌の早期発見と根絶は、慢性感染症を発症する可能性を減らすことができます。慢性緑膿菌感染症の発症は、肺機能の低下と罹患率の増加に関連しています。したがって、小児患者の約10〜40%で発生する抗生物質療法で緑膿菌を根絶できない理由を解明することに大きな関心があります。緑膿菌の宿主クリアランスと抗生物質感受性に影響を与える多くの要因の1つは、空間構成(凝集やバイオフィルム形成など)と多糖類産生の変動です。そこで、CF患者の喀痰中の緑膿菌のin situ特性を可視化することに興味を持ちました。喀痰サンプルをハイドロゲルマトリックスに包埋した後、組織透明化技術を適用し、宿主細胞に対する3D構造を保持しました。組織透明化後、蛍光標識および色素を添加し、可視化を可能にした。細菌細胞の可視化のために蛍光in situハイブリダイゼーションを行い、エキソ多糖類の可視化のために蛍光標識抗Psl抗体を結合させ、DAPI染色を行って宿主細胞を染色し、構造的洞察を得ました。これらの方法により、共焦点レーザー走査型顕微鏡によるCF患者の喀痰中の緑膿菌の高解像度イメージングが可能になりました。

実験の全体的な計画を図 1 と 図2にまとめます。 図1 は、喀痰処理と喀痰除去プロトコルの概要を示しています。喀痰の処理と除去には最大17日かかる場合があります。ただし、プロトコルは停止する可能性があり、サンプルはPFAによる固定後(2日目)または組織除去後(クリア時間に応じて5〜17日目)に保存できます。 図2に、FISHと抗体の結合プロトコルをまとめました。FISHおよび抗体染色プロトコルは完了するまでに4日かかりますが、開始後に完了し、共焦点画像を撮影する必要があります。上記のプロトコルを使用して、緑 膿菌 細胞の高解像度3D画像を取得し、喀痰内のin-situ構造を視覚化することができます。
このプロトコルで使用される藻の除去そしてそれに続く適用はサンプル内の P.の緑膿菌の 詳しい視覚化を可能にする...

このプロトコルは嚢胞性線維症の患者の喀痰内の細菌のセルそして多糖類の統合の遺伝子座(Psl)の多糖類の視覚化のための方法を提供する。

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

このプロトコルは、嚢胞性線維症の痰内の緑膿菌と外多糖類Pslを直接視覚化できるため、重要です。この手法は、凝集やバイオフィルムなどの緑膿菌の空間構成が宿主のクリアランスと抗菌剤感受性にどのように影響するかについての質問に答えるのに役立ちます。去痰された ?? は、固定前に最大24時間、摂氏4度の滅菌コレクションカップに保管します。.サンプルを固定する準備ができたら、滅菌済みの15ミリリットルチューブに移し、等量の4%PFAを加えてから、喀痰を摂氏4度で一晩インキュベートします。固定痰2ミリリットルごとに5ミリリットルのPBSを追加してサンプルを洗浄します。ピペットで上清を慎重に取り除き、さらに2回洗浄を繰り返します。ペレットをPBSの2倍の容量に0.01%アジ化ナトリウムで再懸濁し、摂氏4度で保存します。密閉された嫌気性容器内でキャップを外した状態で3ミリリットルのチューブに1つのアクリルアミド/ビサクリアミド溶液に2ミリリットルの30%29を加え、次に3ミリリットルのチューブ内のPBSの2ミリリットルに0.5グラムの硬化剤を追加します。.キャップをチューブから外し、密封された嫌気性容器に保管します。嫌気性容器内のキャップを外した状態で、数ミリリットルの滅菌PBSをチューブに入れます。密閉容器内のヒドロゲル成分を嫌気性パックで72時間脱気します。15ミリリットルのチューブにPBS中の最終濃度0.2%硬化剤と4%アクリルアミド/ビスアクリルアミドの最終濃度を持つヒドロゲルの2.5ミリリットル溶液を作り、反転してハイドロゲルを混合し、溶液をろ過滅菌します。喀痰サンプルをメスで2つの小さなセクションに切り、次に各サンプルを8チャンバーの蓋付きスライドガラスのウェルに入れます。喀痰を含む各ウェルに300マイクロリットルのフィルター滅菌ヒドロゲル溶液を加え、嫌気性パック付きの密閉容器内に37°Cで3時間入れます。固化したヒドロゲル喀痰サンプルを、pH 8で8%SDSを5ミリリットル含む15ミリリットルの培養チューブに移し、喀痰が透明になるまで3〜14日間摂氏37度でサンプルを透明にします。滅菌ピンセットを使用して、各ハイドロゲル包埋サンプルを50ミリリットルのコニカルチューブに移し、10ミリリットルのPBSを加えてハイドロゲルを洗浄します。溶液を30〜60分間放置してからデカンテーションし、さらに2回洗浄を繰り返します。洗浄したサンプルは、0.01%アジ化ナトリウムとRNase阻害剤を含むPBSで摂氏4度で保存します。ハイドロゲルサンプルを保存溶液から取り出し、サンプルを滅菌面に置きます。滅菌メスを使用して、ハイドロゲルを約1ミリメートルの厚さにスライスし、切片を1.5ミリリットルのチューブに入れます。1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーを調製し、蛍光標識されたSeer A-probeを添加し、反転して混合します。各セクションに200〜500マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを追加し、ヒドロゲルサンプル全体が水没していることを確認します。Seer A-probeをヒドロゲルサンプルとハイドロゲルサンプルを46°Cの暗所に約18〜24時間置いてハイドロゲルサンプルとハイブリダイズさせた後、チューブに1ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーを加え、48°Cの暗所で6時間インキュベートします。500マイクロリットルの2%BSAおよびPBSをハイドロゲルサンプルに加えて非特異的タンパク質の結合をブロックし、サンプルを暗所で一晩インキュベートします。翌日、PBS中の新鮮な2%BSAの500マイクロリットルで抗体を最終濃度0.112マイクログラム/ミリリットルに希釈することにより、Psl0096-Texas Red抗体溶液を調製します。抗体溶液をハイドロゲルサンプルに加え、暗所で6時間インキュベートします。次に、ヒドロゲルサンプルを250マイクロリットルのRIMs溶液と10マイクログラム/ミリリットルのDAPI溶液と一晩、暗闇で穏やかに振とうしながらインキュベートすることにより、DAPIで染色します。染色後、サンプルを0.9mmまたは1.7mmの灌流チャンバーにマウントし、ガラスカバースリップで密封します。25倍、40倍、63倍、または100倍の倍率で共焦点レーザー走査型顕微鏡法を実行します。このプロトコルを使用して、緑膿菌細胞とその喀痰内のNC2構造の高解像度3D画像を取得しました。ここには、喀痰サンプル内の細胞の凝集体が示されています。個々の棒状は、Seer A-488プローブのP.aeruginosa細胞への種特異的結合から緑色で見られました。Psl0096-Texas Red抗体は、喀痰中のシュードモナル外多糖が緑膿菌細胞とほぼ重なっていたことを示しています。この方法は、喀痰内のシュードモナール細胞を他の細菌細胞や宿主構造との関係で可視化するためにも使用されました。緑膿菌細胞のクラスターは、真核細胞内で食作用することが見られ、他の小さな球菌細胞クラスターは近くで観察されました。また、PSL 0096抗体は、プランクトン性緑膿菌由来のPSLに結合できることも実証されました。この技術の主な利点は、組織透明化アプローチとそれに続く蛍光in situハイブリダイゼーション、抗体染色、および共焦点顕微鏡法が実施されることです。これにより、研究者は画像処理技術を視覚化して使用し、CF喀痰内の緑膿菌コロニー形成構造の違いを患者の健康転帰に関連して定量的に測定することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

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嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

学ぶ嚢胞性線維症患者の喀痰中における緑膿菌とPsl多糖類の可視化手法。組織透明化と蛍光in situハイブリダイゼーションを用いて、バイオフィルム形成と抗菌薬感受性の関係を解析する方法です。

嚢胞性線維症患者の喀痰中の緑膿菌の可視化

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