Name: 血液由来神経細胞のGMフリー生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶGMフリー血液由来神経細胞生成法。末梢血単核球から遺伝子改変なしで神経系細胞を誘導し、ラミニン培養で再分化を促進する。再生医療への安全な臨床応用が可能です。

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ライナー・サフリッチ博士の記憶に捧げ。
著者らは、比較神経生物学研究所、バレンシア大学CIBERNED、バレンシア、スペイン、プロメテオ・グラント・フォー・エクセレンス・リサーチ・グループPROMETEO/20190/077の研究資金によって支援された比較神経生物学研究所でEM実験と分析を行ったホセ・マヌエル・ガルシア=ヴェルドゥーゴとビセンテ・ヘランツ=ペレスに特に感謝している。この作品の残りの部分は、ACA CELLバイオテクノロジーGmbHハイデルベルク、ドイツによってサポートされました。

実験を行う際に倫理承認を得た。
1. ヒト末梢血単核細胞(PBMNC)の単離
<ol><li>すべてのドナーが、制度ガイドラインに従って血液を撤回する前に、インフォームド・コンセントに署名したことを確認してください。</li>
	<li>標準的なプロトコルに従って訓練された医療関係者によって健康なドナーから血液の30 mLを取る。</li>
	<li>密度勾配媒体によって PBMNC を分離します。リン酸緩衝塩水(PBS)で希釈した1:1の血液25mLの培地10mL、300xgの遠心分離機を30分間使用してください。</li>
	<li>プラズマと密度勾配媒体の間の相間層をピペット処理により分離する。5 mLの無菌PBSと遠心分離機で10分間300 x g で単離した細胞を洗浄し、2回繰り返します。</li>
	<li>カウントチャンバーを使用して標準的な方法で細胞の数を数えます。</li>
</ol>2. PBMNCの表面上の抗体架橋によるヒトGPIアンカー糖タンパク質の活性化
<ol><li>6 x 106個 の単核細胞(MNC)を15 mLチューブに入れ、ヒトGPI結合膜タンパク質特異的抗体(30μg/mL)を30分間PBSで30分間、37°Cで1%の牛血清アルブミン(BSA)で培養して抗体架橋を行う。</li>
	<li>インキュベーション培地を、10%の胎児ウシ血清(FBS)で補ったイコーブの修飾ダルベッコ培地に置き換えます。</li>
	<li>細胞を15 mLポリスチレンチューブで成長させ、37°Cでインキュベーターに入れ、8〜10日間(揺れせずに)5%CO2を入れます。D5では、15 mLチューブに10%FBSを加えたアイスコブの培地を1~2mL追加します。</li>
</ol>3. 新たに生成された分化細胞のソート
<ol><li>自動細胞カウンター(18 μL細胞懸濁液+ 2 μL蛍光色素)または計数チャンバー内の細胞を数えます。</li>
	<li>遠心分離機培養細胞懸濁液(5-7 x 106)で300xgで10分間、滅菌パスツールピペットで得られた上清を吸引した。 </li>
	<li>細胞ペレットを、予冷したPBS pH 7.2、0.5%BSAおよび2 mM EDTAの90 μLで再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液にCD45正のナノサイズの磁気ビーズ(80 μL)を加え、氷の上で15分間インキュベートします。</li>
	<li>PBSバッファーと遠心分離機を2 mL 300 x g で10分間加えて細胞を洗浄します。</li>
	<li>500 μL の PBS バッファーで細胞を再懸濁します。</li>
	<li>500 μL の事前冷却 PBS バッファーでカラムを洗浄し、磁場に入れます。</li>
	<li>カラムに細胞懸濁液を置き、500μLのPBSバッファー(2回)とCD45陰性細胞を含む遠心分離機流で洗浄します。1%BSAを補充アイスコブの培地でそれらを収集します。</li>
	<li>計数チャンバー内のセルをカウントします。</li>
</ol>4. 新たに生成した幹細胞の神経分化のための細胞培養皿の準備
<ol><li>培養血管にポリ-L-オルニチンとラミニンを塗布し、神経細胞を増殖させます。</li>
	<li>ガラスカバーリップを4ウェルプレートに入れ、ddH2Oで1:5希釈ポリL-オルニチン(0.1mg/mL)を37°Cインキュベーターに1時間置きます。その後、ddH2Oで洗浄します。</li>
	<li>ラミニン(0.5-2.0 mg/mL)をゆっくりと解凍し、カバーリップの上部に追加します。37°Cで2時間インキュベートする。</li>
	<li>D-MEM/F12の49 mL、N2サプリメントの500 μL、400 μLの非必須アミノ酸(NEAA)、20 ng/mL最終濃度(100 μg/mLストック溶液から調製)での基本的なFGF溶液、および2ng/mLの最終濃度でヘパリンからなる神経誘導培地N2を準備する。</li>
	<li>ピペット処理により余分なラミニンを除去し、培養皿に神経培地N2を加えます。</li>
</ol>神経細胞の分化血細胞の培養
<ol><li>培養BD由来CD45は、ラミニン/オルニチンコーティングガラスカバーリップ上で、37°C及び5%CO2のインキュベーターでN2培地で2日間培養し、新たにBD生成細胞の神経細胞分化を開始した。</li>
	<li>神経基底培地の48 mLからなる神経分化培地の培養細胞はさらに、L-グルタミンの500 μL、B27サプリメントの1 mL、NEAAの500 μL、 50 μL の組換えヒトグリア由来神経栄養因子 (GDNF) を PBS/0.1% BSA で 5 μg/250 μL、50 μL の組換えヒト脳由来神経栄養因子 (BDNF) を 5 μg/200μL で PBS/0.1% BSA/500 μL で 50 mLプレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れる。</li>
</ol>血液由来神経細胞の免疫蛍光顕微鏡分析
<ol><li>上記のように細胞を16日間培養し、培地を取り出す。<ol>
<li>75 mLの無菌水、4gのパラホルムアルデヒドからなる、あらかじめ温め込まれた固定液をインキュベートする。必要に応じて10 N NaOHを加え、溶液がクリアになるまでかき混ぜます。その後、10x PBSの10mL、MgCl2の0.5mL、0.5 M EGTAの2 mL、および4gのスクロースを加えます。 6 N HClでpH 7.4に触れ、15分間100mLの無菌水を持ち込む、とMarchenkoら7.</li>
		<li>固定剤を捨て、毎回5分間、細胞を3回洗浄します。すぐに作りたての0.3%トリトンX溶液を加え、5分間細胞を透過させます。PBSで3回洗浄し、PBSと5%BSAで作られたブロッキング溶液を追加します。</li>
		<li>ロッカープレートの室温で細胞を1時間ブロックします。</li>
		<li>1%BSA/PBSで適切な抗体希釈を調製し、ロッカープレート上の抗体希釈液を室温で1.5時間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄し、それぞれ5分間、DAPIで細胞をインキュベートし、顕微鏡上で視覚化するために取り付け培地でカバーリップを取り付けます。 注: この実験で使用した直接標識抗体は、一覧の 一覧は、材料表に記載されています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 新たに発生した細胞の透過型電子顕微鏡解析
<ol><li>8ウェルチャンバースライドでTEM用セルをシードします。</li>
	<li>37°Cで1時間、2%OsO4で2%OsO4で後固定し、暗闇の中で2%ウラニル酢酸を2時間30分間暗に汚します。</li>
	<li>最後に、蒸留水で細胞をすすい、エタノールで脱水し、エポキシ樹脂に一晩埋め込みます。翌日、樹脂硬化のため70°Cのオーブンに72時間移します。</li>
	<li>埋め込まれた細胞培養物をチャンバースライドから取り外し、接着してアルルディートブロックにします。</li>
	<li>シリアル半薄切片(1.5 μm)を機械で切り、ガラススライドに取り付け、1%トルイジンブルーで軽く汚します。</li>
	<li>選択した半薄いセクションをaralditeブロックに接着し、凍結(液体窒素中)と解凍を繰り返してガラススライドから取り外します。</li>
	<li>超薄いセクション(0.06-0.08 μm)を機械で準備し、さらにクエン酸鉛と対照的に。</li>
	<li>電子顕微鏡をデジタルカメラで撮影。</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glial%22%5BJournal%5D)">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

対応する著者は、彼女が新しいヒトGPIにリンクされたタンパク質に関連する特許保有者であると宣言し、彼女はACA CELLバイオテックで共同設立し、働いています。他の著者は、彼らが利益相反を持っていないと宣言します。

本研究で説明されたヒト細胞をリプログラミングする非GM法は、非操作ヒト末梢血から得られた自己再生PSCの 元生体 生成および拡張につながる脱分化のプロセスを開始するGPI結合ヒト膜糖タンパク質の背後にあるシグナル伝達の核活性化に膜に基づいている。これらの細胞は、適切な培地で培養した場合には、異なる生殖層6に属する細胞への再分化が可能である。
この研究で発表されたデータは、神経分化培地で培養したGMフリーのBD-PSC細胞が全く異なる表現型を獲得し、細長い形状を有し、オルガネラの発達が高まり、細胞間のより複雑な相互作用を確立したことを示している。また、ここで説明した条件を用いた再分化は、種々の神経系統に対する神経分化を意味する。
再分化研究で使用するために最適な数と再プログラム化された細胞の最高の品質を得るために、新鮮なMNC製剤は、凍結MNC製剤と比較して有利である可能性があります。この方法では再プログラムできない末端分化細胞からBD-PSCを分離した免疫磁気選...

基礎的および前臨床幹細胞研究法の開発は、神経疾患に対する幹細胞ベースの治療法の臨床応用を促進する。このような潜在的な治療は、機能回復につながるヒト神経細胞の生成方法に大きく依存する1.
神経幹細胞(NSC)は、成人神経新生と呼ばれるプロセスで、生涯を通じて新しいニューロンに自己更新し、分化します。非常に制限された脳領域だけが、成人期に新生児ニューロンを生成する能力のあるNSCを抱えています。このようなNSCは、学習や記憶に関与する成熟したニューロンを生み出し、失われたニューロンや損傷したニューロンを置き換えることができます。残念ながら、これらのNSCは制限された量で存在し、この限られた神経新生は若年発達中に急速に減少する2。したがって、神経細胞の他の供給源は、細胞治療の目的で考慮されなければならない。
変性神経疾患は、標準的な薬理学的アプローチを用いて治癒することは困難である。多くの薬用神経疾患を受け入れるための新しい治療戦略は、病気および負傷した組織の細胞置換療法に基づいています。NSC移植は、損傷した細胞を置き換え、有益な効果を提供することができます。神経細胞置換の他の供給源としては、哺乳類胚盤胞3の内細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(ESC)や、ESCのような広範な自己再生能力を有し、様々な細胞系統に分化することができるiPSC4が含まれる。NSCはまた、多能状態5を回避するヒト線維芽細胞からの直接再プログラミングによって生成することができる。
細胞補充療法は依然として困難な課題です。ESC、胎児、またはiPSは、多くの不治の神経疾患を治療するための神経細胞の生成源となり得るが、損傷した組織の自己成人SC細胞置換は、免疫学的、倫理的および安全上の懸念を回避するより良い代替手段である。
PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTENのリン酸化による抗体架橋によるヒトGPI結合タンパク質の活性化は、血液前駆細胞の脱分化および血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)6の生成を開始する。これらの細胞は、明視野、免疫蛍光、透過型電子顕微鏡(TEM)解析によって確認されたニューロン細胞に対するインビトロで分化します。
本研究では、GMフリーのBD-PSCの生成と、ニューロン表現型を有する細胞への再分化の成功について述べている。

<table><tbody><tr><td>アルブミンフラクション V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>抗GFAP Cy3抱合体</td><td>メルクミリポア</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>抗MAP2 アレクサフルオMAB3418A5</td><td></td><td></td>555 <td>メルクミリポア</td></tr><tr><td>反ネスチン アレクサフルオ 488</td><td>メルクミリポア</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>アンチTuj1 アレクサフルオア 488</td><td>BD Pharmingen</td><td>560381</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI Cell Viability kit</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym 販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。</td></tr><tr><td>アスコルビン酸 2-リン酸 sequimagnes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 無血清 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>基本 FGF 溶液</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td><td>Merck Millipore</td><td>L6115-BC</td><td>density gradient media</td></tr><tr><td>BSA Frac V 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>ナノサイズの磁気ビーズ</td></tr><tr><td>セルカウンティングスライド Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym 販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。</td></tr><tr><td>チャンバースライド Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td><td>エポキシ樹脂</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>販売終了.以下で入手可能: TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF 組換えヒト</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-グルタミン</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒドグレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム細胞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>ヒト BDNF</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td><td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>Laminin mouse</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Automated Cell Counter</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym 販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。</td></tr><tr><td>MACS バッファ</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml;ulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Morada デジタル カメラ</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterile</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤-3 ロックタイト</td><td>ヘンケル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI テクナイ G2 スピリット</td><td>FEI ヨーロッパ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウルトラカット UC-6</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウラニルアセテート C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

血液由来神経細胞のgmフリー生成

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

多くの人間の神経疾患は、脳内のニューロンおよびグリア細胞の変性によって引き起こされる。薬理学的および他の治療戦略の制限により、現在、負傷または病気の脳に対して利用可能な治療法はありません。細胞置換は、神経変性状態の有望な治療戦略として表示されます。.今日まで、神経幹細胞(NSC)は、胎児組織、ヒト胚細胞(ES)または人工多能性幹細胞(iPSC)から正常に生成されています。脱分化のプロセスは、多能性幹細胞の生成につながる新しいヒトGPI結合糖タンパク質の活性化によって開始された。これらの血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)は、明視野および免疫蛍光顕微鏡で示されるように、神経表現型を有する細胞に インビトロで 分化する。電子顕微鏡によるこれらの細胞の超構造解析は、その原始構造、ならびに神経細胞様形態および細胞内特性を確認する。

この新しいGMフリー法は、ヒトゲノムに直接作用することなく、血液前駆細胞を最も原始的な状態に戻すことができるという証拠を提供する。
我々は以前、GPI結合タンパク質特異的抗体架橋が、WNT、NOTCH、C-Kitなどの高度に保存された発達関連遺伝子のPLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTENアップレギュレーションを介して開始することを示し、HSCの生成への第一歩とBD-PS-PSの第2段階につながる脱分化のプロセスを開始した。
活性化されたMNC培養物は、CD45マイクロビーズを用いて免疫磁気選別を行った。この方法では再プログラムできない成熟した血液細胞(例えば、CD45陽性細胞)をカラムに保持し、再プログラムされた細胞を含む負の分画(CD45陰性細胞)を種々の神経系統細胞の生成に用いた。
まず、光とTEMを用いて、末梢BD分解細胞の...

我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。

血液由来神経細胞のGMフリー生成

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

プロトコルの重要性は、核シグナル伝達に膜に依存し、誘導多能性幹細胞の場合のように、ゲノムに直接影響を与えません。血液由来多能性幹細胞の非催奇形性は、この技術の主な利点であり、再生医療の様々な分野における安全な臨床応用に適しています。この手順のデモンストレーションは、プロジェクトリーダーのアン=キャスリン・ショット博士と、私の研究室のラボアシスタントであるオクサナ・グリーンエーカーです。PBMNCを分離するには、PBSで希釈した1対1の血液25ミリリットルを10ミリリットルの密度勾配培地に加え、300倍Gで混合物を30分間遠心分離する。プラズマと密度勾配媒体の間のインターフェース層をピペット処理で分離します。10分間、無菌PBSと遠心分離機を5ミリリットルで300倍Gで洗浄します。手順を2回繰り返した後、計数チャンバーを使用して細胞の数を数える。6個目の単核細胞に6×10を加えて15ミリリットルチューブに加え、ヒトGPI結合膜タンパク質特異的抗体をPBS内の細胞に1%BSAで添加し、摂氏37度で30分間インキュベートすることにより、抗体架橋を行う。架橋後、インキュベーション培地をイコーブの修正ダルベッコの培地に10%FBSを補充して交換してください。細胞を摂氏37度のインキュベーターに入れ、8~10日間、揺れることなく8~10日間培養器に入れて、細胞を15ミリリットルのポリスチレンチューブで成長させます。5日目には、15ミリリットルのチューブに10%FBSを加えたアイスコベス培地を1~2ミリリットル追加します。培養した細胞を計数チャンバーで数えます。次いで、細胞懸濁液を約5x10から6番目の細胞を300倍Gで10分間遠心し、滅菌パスツールピペットで得られた上清を吸引する。0.5%BSAおよび2ミリモルEDTAでpH 7.2の予冷却されたPBSの90マイクロリットルの細胞ペレットを再懸濁する。その後、80マイクロリットルのCD-45正のナノサイズの磁気ビーズを細胞懸濁液に加え、氷上で15分間インキュベートします。細胞を洗浄するには、PBSバッファーと遠心分離機を2ミリリットルGに10分間加えます。細胞を500マイクロリットルのPBSバッファーに再懸濁させる。500マイクロリットルのPBSバッファーでカラムを洗浄し、磁場に入れます。細胞懸濁液をカラムに置き、500マイクロリットルのPBSバッファーで2回洗浄します。1%BSAを補充したIscoveの培地内の細胞を収集し、計数チャンバー内の細胞を数えます。ガラスカバーリップを4ウェルプレートに入れ、1~5個の希釈ポリL-オルニチンと二重蒸留水でコーティングします。37°Cで1時間のカバーリップをインキュベートした後、二重蒸留水でそれらを洗います。ラミニン1ミリリットル当たり0.5~2ミリグラムゆっくりと解凍し、カバー

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

捨てられた人間の胎児皮質組織から神経幹細胞の単離および培養上シンプルで信頼性の高い方法が記載されている。既知のヒト神経疾患から派生した培養物は、病理学、細胞及び分子過程の特性だけでなく、薬理学的有効性を評価するためのプラットフォームを提供するために使用することができます。...

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

この方法では、マウスの脳から微小血管内皮細胞を分離し不死化する方法について説明します。我々は、脳組織、消化手順、播種し、細胞の不死化の均質化から始まるステップ·バイ·ステップのプロトコルを記述します。通常、それは均質、不死化血管内皮細胞株を得るために約5週間かかります。...

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

このビデオでは、血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)から神経細胞を生成する技術を示しています。BD-PSCは、血液前駆細胞のリプログラミングによって得られます。未分化BD-PSCは、神経誘導培地と神経分化培地を用いて細胞培養基質被覆カバースリップ上で培養され、神経細胞の表現型を持つ細胞への分化が引き起こされます。...

血液由来多能性幹細胞からの神経細胞の生成

このビデオは、成人のヒト皮膚線維芽細胞(aHDF)からのニューロンの生成を示しています。aHDFは、ニューロン転写因子とショートヘアピンRNA(shRNA)の遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターを使用して再プログラムされます。shRNAはニューロンの転写抑制因子の発現を阻害し、ニューロンの転写因子は遺伝子を活性化してaHDFをニューロンに分化します。これらの再プログラムされたaHDFは、成熟したニューロンを生成するために、初期および後期のニューロン変換媒体で培養されます。...

ヒト真皮線維芽細胞のリプログラミングによるニューロンの生成

出典:Becker-Kojić, Z. A., et al., GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells.J. Vis.

末梢血由来細胞から分化した神経細胞の免疫蛍光顕微鏡法

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

直接神経細胞リプログラミングと、開始の体細胞の年齢を維持するニューロンが生成されます。ここでは、大人の人間のドナーから得られる皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞を生成する単一ベクトル...

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。...

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

この記事では、ベンチトップ3D懸濁バイオリアクターにおけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンの生成のためのプロトコルについて説明します。...

3次元浮遊バイオリアクターにおけるヒトニューロゲニン2誘導性ニューロンの生産

この研究は、脳の炎症の間接的な評価を可能にするヒト単球由来ミクログリア様(iMG)細胞の確立のための新しいアプローチを示しています。これは、脳の潜在的な炎症と関連する神経精神障害に焦点を当てた研究に有益である可能性のある細胞モデルを示しています。...

ヒト血液誘導性ミクログリア様細胞の改変による脳の逆翻訳研究

学ぶGMフリー血液由来神経細胞生成法。末梢血単核球から遺伝子改変なしで神経系細胞を誘導し、ラミニン培養で再分化を促進する。再生医療への安全な臨床応用が可能です。

血液由来神経細胞のGMフリー生成

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