Name: DYT/PARK-ATP1A3ジストニアの症理学的マウスモデルを確立するための浸透性ポンプの移植とストレスの誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶ浸透性ポンプによる慢性薬物投与と運動課題によるストレス誘導を用いたDYT/PARK-ATP1A3ジストニアマウスモデルの確立法。脳カニューレ移植手術と行動学的表現型評価の詳細なプロトコルを解説する。

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この研究は、連邦教育研究省(BMBF DysTract to C.W.I.)とヴュルツブルク大学の学際学際臨床研究センター(IZKF)(Z2-CSP3からL.R.)によって支援されました。著者らは、ルイザ・フレス、ケアリ・レーム、ヴェロニカ・センガー、ハイケ・メンツェルに感謝し、動物ケアに対するヘルガ・ブリュナーと同様に、彼らの技術支援に感謝する。

すべての手順は、動物のケアと使用のための適用される国際、国内、および/または制度上のガイドラインに従って行われました。ドイツ・ヴュルツブルクのレジエルン・フォン・ウンターフランケンの地元当局は、すべての動物実験を承認した。
1. 浸透圧ポンプのプライミング
注:このステップは手術前に少なくとも48時間実行する必要があります。ALZETの浸透性ポンプは、ポンプ速度が着床前の安定した状態に達することを確実にするために、事前に充填される必要があります。
<ol><li>慢性灌流のために必要な溶液を事前に準備してください。溶剤と薬剤が浸透ポンプおよびカテーテルと互換性があることを確認します。本明細書中のプロジェクトでは、室温で10倍のウアバン(-20°Cで保存)の10倍のストック溶液を解凍し、10sの渦を解凍する。 注意:ワバンは有毒です:それは手袋でのみ扱われ、吸入を避けるために無菌フードの下でのみ開くべきです。</li>
	<li>無菌フードをオンにします。フードの下にそれらを置く前に必要なすべての機器や材料だけでなく、フードだけでなく、消毒します。</li>
	<li>浸透性ポンプを取り扱う前に外科用手袋を着用してください。別に線条体と小脳のポンプのために指定されたワバン溶液を準備します。 注: 線条体用のポンプ内の溶液の濃度は、小脳用に指定されたポンプ内の溶液の濃度と比較して2倍にする必要があることを考慮してください。これは、線条体用のポンプが二重カニューレに接続されていることが原因であり、流量は、単一のカニューレに接続されている小脳のポンプと同じです。</li>
	<li>次の式を使用して、必要なソリューションの量を計算します。 大量配送率 (ko)= 車両内の薬剤の量送達率 (Q) x 濃度 (Cd) 本プロジェクトでは、浸透ポンプをプライミングし、コントロール群に対して11.2 ng/hまたは0.9%生理食動物の濃度でワバーン溶液を充填した。</li>
	<li>ボルテックスは、10 sおよび無菌フィルター(すなわち、0.22 μmシリンジエンドフィルター)用の両方のワバーン溶液を、溶液ごとに異なるフィルターを使用して、別々の新しいマイクロ遠心チューブにします。</li>
	<li>フローモデレータ(約0.4 g)と一緒に空の浸透圧ポンプの重量を量ります。</li>
	<li>1 mL シリンジに27 G充填カニューレ(好ましくは鈍い先端)を無菌濾過ワバン溶液または車両溶液で充填します。</li>
	<li>すべての気泡をシリンジから取り出し、浸透圧ポンプを直立した位置に保持し、カニューレをポンプに挿入し、余分な溶液が上に現れるまでゆっくりと貯水池を満たします(ポンプ内の気泡につながる可能性がありますので、急速な充填を避けてください)。次に、フローモデレータをポンプに挿入します(過剰なソリューションが上部に表示されます)。</li>
	<li>フローモデレータ(約5mm)を引き出し、慎重にはさみで白いフランジを脱ぎ、フローモデレーターにビニールチューブの一部を接続します。カテーテルの長さは約2cmで、動物の適切な移動を可能にします。</li>
	<li>充填された浸透圧ポンプをもう一度計量して、充填されたポンプと空のポンプの重量差が、ロードされた溶液の予想重量と一致していることを確認します。 注:ほとんどの水溶液では、この重量はマイクロリットルの体積に等しいです。重量が予想される容積に一致しない場合、空気はポンプの内部に閉じ込められ、空にして補充する必要があります。</li>
	<li>ポンプのプライミングのために、2つの2つのmLマイクロ遠心分離管、線条体用の1つのチューブ、小脳用のチューブを2つ用意します。</li>
	<li>0.9%の生理液で中途半端に満たされたマイクロ遠心分離管にポンプを浸します。カテーテルの開いた端を水没しないでください。マイクロ遠心チューブを37°Cで48時間熱サイクルに入れ、ポンプが着床前に安定したポンプ速度に達し、カテーテルが予充填されるようにします。</li>
</ol>2. カニューレおよび浸透圧ポンプの注入
<ol><li>マウス(男性、C57Bl/6N、11-12週齢)を吸入麻酔用に設計されたチャンバーに入れます。イオブルランの流量を2~3%、酸素の流量を2 L/minに設定します。</li>
	<li>承認されたプロトコルに従ってマウスが深く麻酔された後、動物の頭の上部、背部首および背中の近位3分の1を剃る。</li>
	<li>動物を定位フレームに入れ、立体戦術機器用に設計されたマウス麻酔マスク(イオフルラン流量1.5~2%、2 L/分酸素)を介してイオフルランで麻酔を続けます。</li>
	<li>ゴムチップまたは非破裂耳棒を使用して、頭が平準化されていることを注意して、立体的なフレームで動物の頭部を固定します。</li>
	<li>低体温を防ぐために、動物の下に加熱パッドを置き、直腸温度プローブを挿入し、温度を37°Cに設定します。 各目に眼科軟膏を一滴使用して、動物の目を乾燥から保護します。</li>
	<li>手術を開始する前に、カルプロフェン(5mg/kg体重)などの鎮痛薬を皮下に塗布してください。</li>
	<li>皮下注射器を用いて、0.25%のブピバカインを0.2mLまで注入し、局所麻酔が有効になるまで30s待ちます。</li>
	<li>ギヤ部分を十分に消毒し、オクテニジン二塩酸塩などの消毒剤を使用します。</li>
	<li>外科領域を徹底的に消毒した後、メスを使って頭のてっぺんに切開を行い、はさみを使って前肢まで切開を続ける。ブルドッグクランプの助けを借りて頭蓋骨を露出させ、滅菌綿先端アプリケーターで骨膜を拭きます。</li>
	<li>ペンまたは黒いインクに染まったカニューレの先端をブレグマで揃え、適切な座標を使用して頭蓋骨の脳カニューレの3つのエントリポイントをマークします(大脳神経節の灌流に必要な両側の穴の座標:前/後部:+ 0.74 mm、 内側/側方:+/- 1.50mm(右側を示す+、ブレグマに対する左側)、小脳の正中線の穴の座標:前/後部:- 6.90mm。次に、大脳大脳に指定された二重カニューレと小脳用に指定された単一カニューレの穴を慎重に掘削します(図1A)。</li>
	<li>線条体と小脳の間の小さなネジのために4番目の穴を開けます。このねじは最終的に歯科用セメントに埋め込まれ、カニューラのための追加のホールドを提供する。細かい鉗子とスクリュードライバーを使用して、頭蓋骨にしっかりと固定されるまで、慎重に小さな穴にネジを導入します。これは、脳組織に損傷を与えるので、あまりにも深くネジを埋め込まないでください。 注:浸透圧カニューレを挿入する前に、浸透圧ポンプの注入を続けることをお勧めします。これはポンプを注入するときカニューレに偶発的な損傷を引き起こすのを避ける。</li>
	<li>動物の両側の浸透圧ポンプ用の小さなポケットを作るためには、組織鉗子を使用して皮下組織層を分離する。鉗子を後ろ脚に向かって進め、皮下ポケットを広げるために鉗子をわずかに開けます。反対側でも同じ手順を繰り返し、最初に切開から鉗子を取り除き、次に第2後脚に向かってそっと押します。 注:ポケットは、ポンプが簡単に滑り込むために許可する必要がありますが、それは皮膚の下に移動するためにあまりにも多くの余地を持っている必要があります。</li>
	<li>ティッシュ鉗子の助けを借りて、チューブの接続された部分と一緒に最初のポンプを取り、1つの皮下ポケットにそれをスライドさせます。2つ目のポンプでも同じ手順を繰り返します。</li>
	<li>ミニポンプホルダーを使用して、小脳の正中に掘削された穴に3.0 mmのカスタム長さの単一の浸透カニューレを導入します。カニューレヘッドを慎重に取り外し、カニューレと小さなネジを歯科用セメントで固定し、浸透ポンプのチューブ用の接続部分を覆わないように注意してください。カニューレを取り巻く歯科用セメントが完全に乾燥してから手術を続行してください。</li>
	<li>中心から中心までの距離3.0mmのダブルカニューレを、大脳基底核の上に開く穴に4.0mmのカスタムメイドの長さを挿入する前に、2つの短いビニールチューブ(0.5 cm)をダブルカニューレの2つの接続部分に取り付けます。ビニルチューブを分岐アダプターで接続し、アダプターとカニューレを含むチューブシステム全体をワバン溶液または車両(室温、滅菌濾過済事前)で慎重に事前に充填します。これは、分岐アダプタの単一の後端に導入された1 mLシリンジと27 G充填カニューレで最もよく行うことができます(図1B)。</li>
	<li>ミニポンプホルダーを使用して、二重カニューレを慎重に両側の穴に挿入します。クランプを使用してカニューレヘッドを取り外し、歯科用セメントでダブルカニューレを固定します。</li>
	<li>浸透圧ポンプのカテーテルを、分岐アダプターと単一カニューレにそれぞれ接続します。カテーテルがカニューレの接続部分を強く保持していることを確認します。 注:両方のポンプは、等しい流量を持っているので、同じ濃度が大脳基底核と小脳の両方に到達することを確認するために、分岐アダプタに二重濃縮溶液と浸透ポンプを接続するように注意してください。</li>
	<li>頭蓋骨の方向にできるだけステッチで動物の背中の切開を閉じ、皮膚を伸ばし過ぎないように注意してください(図1C)。</li>
	<li>マウスの脱水を避けるために、体温を持つべき0.9%生理食動物の0.5mLを皮下注射して、慎重にポンプを避ける。</li>
</ol>3. モータチャレンジ
<ol><li>被験者のワバーンまたは車両を浸透させたマウスは、手術後4時間の軽度のストレス暴露の一形態として運動タスクに挑戦し、その後24時間ごとに繰り返しジストニアのような動きを誘発する。これには、動作特性は含まれません。その目的は、通常のケージの維持に比べて高いストレスレベルを誘導することです。</li>
	<li>直径1cmの木製ポール(鼻を下向き)の50cmの粗面の木製ポールの上にマウスを置きます。ポールが落下した場合に十分な寝具を備えた大きなケージに入れられるようにします。降下時間を測定する必要はありませんが、ポールを降りながらワバーンを透過した動物によって提示された前肢と後肢の不随意的な過延長に気を付けてください。マウスはポールを3回降下させ、降下間の2分の回復を可能にする。 注:ワバン透過マウスは、手術後4時間のブラジキネシアのような最初の症状を提示する必要があります。しかし、手術後24時間マウスは、下降時にジストニアのような動きの徴候として、前肢および後肢の不随意過伸筋を提示し始めるべきである。</li>
	<li>2 番目のモータ タスクでは、ロタロッドパフォーマンステストの実行に従って、回転ロッドにマウスを配置します。ロタロッド装置は、落下までの待ち時間の尺度として使用されず、その目的は、マウスを強制活性に供することである。マウスを回転ロッドに3回置き、テストの間に2分の回復を可能にします。 メモ:ストレスの露出を増やすには、加速ロタロッド装置を使用してください。本明細書に記載されたプロジェクトの場合、ロッドは300秒の設定された期間にわたって5〜50rpmから加速する。</li>
	<li>ポールテストとロタロッド性能試験の間に動物が30分間回復し、プロトコルステップ4に記載されているようにジストニアのような動きに対して得点する前に再び30分間回復させます。反復的なストレス暴露の間に、マウスは24時間間隔で回復することを可能にする。</li>
</ol>4. ジストニア運動評価のためのスコアリングシステム
注: 偏見を防ぐために、実験者はグループ割り当てに対してブラインドを付ける必要があります。マウスの表現型を特徴付けるために使用される行動テストは、異常評価尺度スコアリング異常、ジストニア様運動、およびテールサスペンションテストを使用した行動スコアの2つのスコアリングシステムです。軽度のストレスにさらされた後、30分の回復時間後のジストニア様運動を評価する。
<ol><li>ジストニア評価スケール 注:事前定義された行動タスクの欠如のために、ジストニア評価スケールは、ヒトジストニアの臨床評価尺度と同様に、観察者ベースのスコアリングシステムとして確立されました。カルデロンら13.によって使用されるジストニア評価スケールの修正版です。<ol>
<li>動物がプラスチックまたは木箱に入れられた後、4分の期間にわたって動物の姿勢と歩行を記録します。</li>
		<li>0~4点のジストニア運動の周波数と分布のスコア:(0)通常の運動行動;(1)異常運動行動、ジストニアのような動きがない。(2)軽度の焦点ジストニアのような動きを伴う軽度の運動障害。(3)重度の焦点ジストニアのような動きを伴う中等度の運動障害。(4)重度の障害、持続的な、一般化されたジストニア様運動(図2)。前肢の過伸展、後肢の広い姿勢または過伸展、およびキフォシスのジストニアのような動きや姿勢を考えてみましょう。単一の身体部分が影響を受ける場合、およびトランクおよび少なくとも2つの他の身体部分が影響を受ける場合に一般化された場合に焦点としてジストニアを考慮してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>テールサスペンション試験 注:テールサスペンションテストは、しばしば後肢のクラスピングの観察とスコアに使用されます。しかし、これは運動障害を示す非常に非特異的な表現型である。以下のプロトコルは、ジストニア様運動に特異的なスコアリングシステムを提案する。DYT/PARK-ATP1A3患者におけるジストニアの一般化により、ジストニア様運動は前肢、体幹および後肢で評価されるべきである。0~8点の新開発スコアリングシステムが開発され、合計スコア<2はジストニアのような動きが存在しないということを示した(図3)。<ol>
<li>そのベースの近くの尾でマウスを拾い、動物を持ち上げます。テールサスペンションテストの2分のビデオを記録し、その後の記録の徹底した分析でスコアを割り当てます。</li>
		<li>前肢を0~4ポイント、片方または両方の前肢の繰り返しまたは持続的なトニック引き込み、および前肢の交差と組み合わせた過伸展をジストニア様に分類したスコア:(0)異常な動きはない。(1)記録された時間の50%以上を見た足の過伸展を伴う前肢の動きを減少させる。(2) 前肢の軽度のジストニア様運動 < 記録された時間の 50%;(3) 前肢の軽度のジストニア様運動 ≥ 50% 記録された時間または重度の < 記録された時間の 50%;(4)前肢の重度のジストニア様運動は、記録時間の50%以上である。 注:ヒンドリムクラスピングは、ジストニアのようなスコアを付けてはならない異常な動きです。</li>
		<li>後肢の引き込みと握り、および持続的な過伸展がジストニア様として評価された0から3ポイントまでの後肢をスコアする:(0)異常な動きがない。(1)記録された時間の50%以上を見た足の過伸展を伴う後肢の動きを減少させる。(2) 1つの後肢のジストニア様運動;(3)両後肢のジストニア様運動。</li>
		<li>トランカル歪み > 記録された時間の 80% の場合は、スコアに追加のポイントが追加されます。</li>
		<li>動物をケージに戻します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このDYT/PARK-ATP1A3薬理学的マウスモデルは、大脳基底核および小脳中のナトリウムカリウムイオンポンプの阻害とストレス暴露に関連する変化によってのみ誘発される脳内構造および神経化学的変化の詳細な分析を可能にする。マウスの場合、最大2つの浸透圧ポンプを皮下に移植することができる。ここでは、単一のカニューレに加えて分岐アダプターに接続された二重カニューレを実施することにより、複数の脳構造への慢性薬物送達を詳述する方法を提示する。この方法論は、複数の脳構造を同時かつ慢性的に浸透させる必要があるあらゆるアプリケーションに使用することができる。
ストレスにさらされた後に患者が永久的な症状を発症する稀な運動障害のマウスモデルを提示する。この推定遺伝子と環境の相互作用はまだ十分に理解されていないが、DYT/PARK-ATP1A3開発における重要な病理メカニズムの1つを表す可能性がある。マウスをストレスにさらすさまざまな方法が過去に公開されており、電気フットショック、拘束、寒冷または暖かい環境、および様々な臭い11、12、13,13への暴露が含まれる。11,移動値を持つ軽度のストレス因子にマウスをさらすために、ここでは、挑戦的な運動タスクにマウスの繰り返しの主観を説明する。ポールテストのために、ワバンを穿フュードした動物は、前肢および後肢の不随意過伸展を明らかにした。これらの動きは、動物の4分のビデオ記録と尾サスペンションテストの間に観察されたジストニアのような動きと非常によく似ていた。挑戦的な運動タスクの形で軽度のストレスの適用は、遺伝子環境相互作用が病気の進行の程度に大きく影響する運動症状または神経変性を示す他のマウスモデルで有用であることが証明されるかもしれない。
マウスの異常な動きや姿勢を分類するための評価尺度と同様に、事前に定義された行動タスクの一般的な欠如があります。利用可能な運動タスクのほとんどは、神経変性18、19を伴う運動障害の多くのマウスモデルでよく知られている現象である後肢のクラスピングのような非特異的な異常を19明らかにする。表現型の適切な特徴付けのためには、マウスモデルが疾患の顕著な特徴を再現しているかどうかを分析する必要があります。ここで、ジストニアマウスモデル15,16,16における運動障害の評価のために以前に使用されたジストニア評価尺度の改変版を提示する。さらに、ヒトジストニアの臨床評価尺度と同様に確立されたテールサスペンション試験用のオブザーバーベースのスコアリングシステムを開発した。両方の評価スケールは、ワバン浸透、ストレスマウスのスコアが、ワバンを浸透させた非ストレス動物および車両浸透動物と比較して有意に高いスコアを示す。観測者ベースのスコアリングシステムの欠点は、一貫したスコアリングを確保し、観測者の変動性を減らすために、評価者の必要なトレーニングであり、分析されたグループに完全に盲目でない場合は、評価者のバイアスの可能性を減らすことです。しかし、観察者ベースのスコアリングシステムは、表現型を特徴付けるための簡単にアクセス可能な方法をまだ提示し、ジストニア様運動の評価のために現在のプロジェクトで行われているように、分析されたマウスモデルに適合させることができる。異なる評価者間で一貫したスコアリングを確保するために、トレーニングビデオを利用可能にする必要があります。潜在的なバイアスを減らすために、異なるレート担当者が同じビデオクリップをスコアリングし、個々のスコアを平均化することをお勧めします。この作品の中で言及された両方のスコアリングシステムは、動物におけるジストニアのような動きの存在を記録する。評価尺度は、プロジェクト内の特定の要件に従って適応することができ、Ipららによって以前に行われたように、ヒストニア1(DYT-TOR1A)20のマウスモデルにおけるジストニア様の動きに対して後肢のみを採点した。20評価尺度は、他の以前に公表されたスコアリングシステムによって補完することができ、例えばCalderonらによる移動障害スコアで行われたげっ歯類におけるブラジキネシアの程度を評価する。

脳に直接連続薬物送達の利点は数多くあります。動物にとって不必要なストレス因子を表す反復的かつ頻繁な注射は回避でき、より一定の脳内濃度の薬物を達成することができる。これは、全身投与された薬物が血液脳関門に容易に浸透しない場合に特に有効である。さらに、浸透性ポンプを介した慢性薬物送達は、そうでなければシステム全体の副作用を有するであろう基質の局所的な送達を可能にする。薬物は、所望の脳構造に標的を絞った方法で送達することができ、結果として得られる効果を直接追跡することができる。これは、治療効果の研究や病態機構の研究など、さまざまな用途に利用できます。この最後のアプリケーションは、ジストニアの薬理学的マウスモデルを作成するために本明細書のプロジェクトで使用された。
3番目に多い運動障害を表すジストニック症候群の分析と理解は、遺伝的動物モデルが病気の人間と病態生理学に見られる疾患表現型をほとんど再現できないという事実によって大きく制限されている。この問題は、ジストニック症候群に限らず、実際には運動障害の分野で多くのトランスジェニックげっ歯類モデルに関する11,22に関する。トランスジェニックげっ歯類モデルにおける表現型の欠如の理由は、非常に効果的な補償機構に基づいている可能性があります3.ジストニアの場合、この疾患は、ねじれ運動および異常な姿勢を引き起こす不随意筋収縮によって特徴付けられる。ジストニック症状の二次原因(すなわち、脳損傷)の研究は、基底神経節5のようなこれらの運動異常の症状に関与する構造を同定するのに役立った。ジストニアの遺伝性形態の脳イメージング研究は、運動制御および感覚運動統合を担うほぼすべての脳領域において機能異常を示している6,,7。しかし、げっ歯類モデルは、分子および大規模ネットワークレベルでの神経機能障害の理解を深めるとともに、治療オプションの開発のために必要とされています。これは、薬理学的マウスモデルがより正確な方法で疾患の臨床的および病理学的特徴を複製する可能性を提供する場所です。
急速発症ジストニア-パーキンソニズム(DYT/PARK-ATP1A3;RDP;DYT12)は、ジストニアの遺伝性形態の一つである。これは、ATP1α3遺伝子の機能喪失突然変異によって引き起こされ、Na+/K+-ATPase8のα3サブ+ユニットに対+してコードする。8さらに、ストレスの多い事象に曝された後、遺伝子変異担体は、持続的な一般化ジストニアおよびパーキンソニズムを急性に発症する前に、何年も症状を持たなくすることができることが認識されています。確かに、DYT/PARK-ATP1A3の浸透は不完全でストレスの多い事象であり、身体的な過度の加量や極端な温度からアルコールや感染症の過剰消費まで、トリガー範囲として機能します9,,10.DYT/PARK-ATP1A3を研究し、潜在的な治療介入を見つけるために、げっ歯類モデルにおけるストレス依存性疾患の発症を模倣するために何度も試みられてきた。しかし、一過性の異常および痙攣のような動きが低体温によって誘発された既存の遺伝的DYT/PARK-ATP1A3マウスモデルを除いて、DYT/PARK-ATP1A3のすべての公開された遺伝的マウスモデルは、ジストニック症状1、11、1211,12を1生成することができませんでした。カルデロンら以前に、野生型マウスの心臓グリコシドワバンを介して大脳基底核と小脳でα3-サブユニットを両側で遮断すると、軽度の歩行障害13が生じることを実証した。暖かい環境での電気フットショックへの追加の暴露は、ジストニックおよびブラジキネティック表現型につながり、したがって、ウアバインの慢性的かつ標的化された灌流に続いてストレスがDYT/PARK-ATP1A3表現型を模倣することに成功したことを実証した。
しかし、2時間にわたる暖かい環境で動物を電気的な足のショックにさらし、特にジストニアの発達に関連するカテコールアミン系の変化の評価のために、交絡要因を表す動物の痛みや不安を誘発する。したがって、ここでは、軽度から中等度の運動がDYT/PARK-ATP1A3患者9のトリガーとして記述されている事実に関連する、高い翻訳値を有する異なる種類のストレスパラダイムを記述する。また、反復運動は、焦点ジストニア14のよく知られたトリガである。マウスは、木製ポールの3つの子孫(「ポールテスト」)とロタロッド装置上の3つのラン(「ロタロッド性能試験」)で構成される挑戦的な運動タスクを繰り返し受けました。50cmの木極の上部に動物を配置して動物を降下させるのに用いたが、ロタロッド装置は、マウスを回転ロッドに置くことによって強制的に活動することを供量するために用いた。
ジストニアのマウスモデルの運動表現型の特性は、事前に定義されたテストとスコアがないため、特に困難です。しかし、げっ歯類13、15、16におけるジストニア様運動の重症度および分布を評価するために、15,16運動障害評価の1つのバリエーションが過去数年にわたって繰り返し使用されてきた。我々は、ジストニア評価尺度の改変版を提示し、4分間の期間にわたって観察された場合に動物のジストニア様表現型を評価するのに有効であることが証明された。ジストニア様運動を評価する第2の方法として、テールサスペンション試験中の異常動き評価用に新開発のスコアリングシステムを発表する。これは、前肢、後肢だけでなく、トランクのジストニアのような動きや姿勢の頻度と持続時間の評価を可能にします。

<table><tbody><tr><td>0.9%生理食塩水</td><td>フレゼニウスカビ</td><td></td><td>PZN06178437</td></tr><tr><td>アルツェット浸透圧ポンプ</td><td>Durect</td><td>4317</td><td>モデル1002、流量0.25 &mu;L / h</td></tr><tr><td>アンカーネジ</td><td>AgnThoの</td><td>MCS1x2</td><td>2 mmの長さ、1mm O.D.のネジ</td></tr>山<tr><td>ブルドッグは</td><td>AgnThoの</td><td>13-320-035</td><td>ストレート、3.5センチメートル</td></tr><tr><td>Bupivacain 0.25%イエナファーム</td><td>mibe株式会社Arzneimittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カニューレとミニポンプ</td><td>ホルダーStoelting株式会社をクランプします。</td><td>51636</td><td>3.4 mmカニューレヘッドを保持するように設計されています</td></tr><tr><td>カニューレ分岐</td><td>プラスチック1</td><td>21Y</td><td>カスタムメイド</td></tr>カ<tr><td>ニューレチューブ</td><td>プラスチック1</td><td>C312VT / PKG</td><td>ビニール、0.69 mm x 1.14 mm</td></tr>デュ<tr><td>モン #5SF 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td><td>ファイン鉗子</td></tr><tr><td>アイクリームBepanthen</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガス麻酔マスク定位固定装置、マウス</td><td>ストールティング株式会社</td><td>56109M</td><td></td></tr><tr><td>硬化ファイン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14090-09</td><td></td></tr>高速<tr><td>ロータリーマイクロモーターキット</td><td>Foredom</td><td>K.1070-2</td><td></td></tr>イ<tr><td>ソフルランCP 1 mL / mL、250mL</td><td>cp-pharma</td><td>1214</td><td>処方箋が必要</td></tr>イ<tr><td>ソフルランシステムDr&auml;ger Vapor 19.3</td><td>Dr. Wilfried M&uuml;ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kallocryl A / C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>歯科用セメント、液体</td></tr><tr><td>Kallocryl CPGM腐敗</td><td>Speiko</td><td>1692</td><td>歯科用セメント、赤い粉末</td></tr><tr><td>マウスと新生児用</td><td>アダプターStoelting Co.</td><td>従来のUフレームニードルホルダー用マウス用</td><td>51625</td></tr><tr><td></td><td>アダプターKLSマーティングループ</td><td>20-526-14</td><td></td></tr><tr><td>非破裂イヤーバーとラバーチップf /マウスステレオシック</td><td>ストールティング株式会社</td><td>51649</td><td></td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&uuml;lke</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>浸透圧ポンプコネクタ マウス用カニューレ、ダブル</td><td>プラスチック One</td><td>3280PD-3.0/SPC</td><td>28 ゲージ、長さ 4.0 mm、c/c 距離 3.0 mm</td></tr><tr><td>マウス用浸透圧ポンプコネクタ カニューレ、シングル</td><td>プラスチック 1</td><td>3280PM/SPC</td><td>28、ゲージ、カスタム長さ 3.0 mm</td></tr><tr><td>Ouabain 八水和物 250 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03125-250MG</td><td>注意: 有毒</td></tr><tr><td>精密バランス</td><td>カーン&Sohn</td><td>PFB 6000-1</td><td></td></tr><tr><td>直腸サーマルプローブ</td><td>Stoelting Co.</td><td>50304</td><td></td></tr><tr><td>リマジル 50 mg/mL、注射可能な</td><td>Zoetis</td><td></td><td>カルプロフェン、処方箋が必要</td></tr><tr><td>Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>RotaRod Advanced</td><td>TSE Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドライバーセット</td><td>AgnTho's</td><td>30090-6</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼バリ</td><td>AgnTho's</td><td>HM71009</td><td>0.9 mm &Oslash; バリ</td></tr><tr><td>ステンレス鋼Burrs</td><td>AgnTho's</td><td>HM71014</td><td>1.4 mm &Oslash; バリ</td></tr><tr><td>StereoDrive</td><td>Neurostar</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td>Neurostarによるカスタムメイド</td></tr><tr><td>定位固定装置ロボット</td><td>Neurostar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>縫合糸:コーティングされたビクリル、ポリグラチン 910</td><td>Ethicon</td><td>V797D</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf AG</td><td>5382000015</td><td></td></tr></tbody></table>

dyt/park-atp1a3ジストニアの症理学的マウスモデルを確立するための浸透性ポンプの移植とストレスの誘導

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

遺伝子組み換えマウスモデルは、特に運動障害を研究する場合、利用可能なトランスジェニックげっ歯類モデルのほとんどがヒト疾患の臨床的側面に似た運動表現型を提示しない場合に限界に直面する。薬理学的マウスモデルは、病理機構および行動表現型に対するその影響をより直接的に研究することを可能にする。脳カニューレに接続された浸透圧ポンプは、局所および慢性薬物送達を介して薬理学的マウスモデルを作成する可能性を開きます。急速発症ジストニア-パーキンソニズムの遺伝性運動障害の場合、Na+/K+-ATPaseのα3サブユニットにおける機能喪失突然変異は、グリコ+シドワバンを介して非常に特異的な遮断によってシミュレートすることができる。大脳基底核と小脳のα3サブユニットを局所的に遮断するために、急速発症ジストニアパーキンソニズムの病因に大きく関与すると考えられている2つの脳構造である、両側カニューレは立体的に条体に移植され、追加の単一のカニューレが小脳に導入される。カニューレはビニールチューブを介して2つの浸透性ポンプに接続され、動物の背中に皮下に埋め込まれ、ワバンの慢性的かつ正確な送達を可能にする。急速発症ジストニア-パーキンソニズムのための薬理学的マウスモデルは、無症候性および症候性突然変異担体の臨床的および病理学的特徴を再現する付加的な利点を運ぶ。急速発症ジストニアパーキンソニズムの突然変異担体と同様に、ワバン透過マウスはストレスに追加された後にのみジストニア様運動を発症する。我々は、軽度の応力パラダイムを実証し、モーター表現型の評価のための2つの修飾されたスコアリングシステムを導入する。

図4 は、ラウシェンベルガーら17から修正された。ジストニア評価尺度(A)と尾サスペンション試験(B)の両方のデータ分析では、各動物の各時点の合計スコアを計算します。各時間ポイントと各グループの平均は、適切なグラフにプロットする必要があります。値の分布を調査し、適切な統計的検定を適用して有意性を決定する必要があります。十分な数の動物を使用すると、運動表現型は、ジストニア評価尺度と尾サスペンション試験の異常な動きの評価の両方で検出することができます。ジストニア様表現型は、ワバン透過、ストレスを受けたマウスと対照マウスと比較して、ワバン浸透、ストレス群の両方の評価において有意に高い運動スコアによって実証される。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg"> 図1:カニューレおよび浸透性ポンプの移植のための主な外科手術ステップ。(A)示された座標では、大脳基底核に指定された二重カニューレと小脳の中線に配置された単一のカニューレのために、穴を二国間で掘削する必要がある。2つの完全に構築された浸透圧ポンプは、動物の両側に示されています。(B) 画像は、歯科用セメントで固定された小脳に埋め込まれた単一のカニューレを示しています。大脳基底核の二重カニューレは、分岐アダプターに接続され、移植前にワバンで事前充填する必要があります。(C)完成した手順の画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg"> 図2:ジストニア評価尺度によるジストニア様運動の評価4分のビデオの間に、ジストニアのような動きは、身体の分布と持続時間に基づいて採点された。前肢の不随意過伸展、後肢の広いスタンスまたは過伸展、ならびにキフォシスはジストニア様と評価された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg"> 図3:尾サスペンション試験中のジストニア様運動の評価2分の尾サスペンションテスト中の異常な動きのための新開発のスコアリングシステムは、合計で0-8ポイントから前肢、後肢および体幹のジストニアのような動きを評価する。前肢の場合、前肢の過伸展と交差、およびジストニア様として修飾されたトランクに向かう強壮な屈曲。後肢の不随意過伸展ならびに中線上の延長による引き込みは、ジストニア様として採点された。記録された時間の80%以上のトランカル歪みが1ポイントで得点されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg"> 図4:ジストニア評価尺度およびテール懸濁試験の代表的なグラフ。(A) グラフは、NaClパーフューズド、ストレスを受けたマウス(点線黒線)、ワバン透過マウス、非ストレスマウス(オレンジ線の点線)、およびワバーンパーフューズドマウス(濃い青色の線)のジストニア評価尺度を示しています。各時点について、平均値±標準誤差の平均値(SEM)が示されている。(B)この図は、NaCl透過したストレスマウス(点線黒線)、ワバン透過マウス、ストレスを受けないマウス(点線オレンジ線)、ワバンパーフューズドマウス(濃い青色線)に対する2分間の尾サスペンションテスト中の異常な動きの評価を示している。ジストニア評価尺度と尾サスペンション試験のスコアリングについて、両側のマン・ホイットニー検定を用いて統計解析を行った。p値のボンフェローニ・ホルム補正(§)は、72時間の観察期間に有意差を示した。ダークブルー*は、ワバン浸透、ストレスマウス、ワバン透過マウス、非ストレスマウスの有意な違いを示し、黒い*はNaClパーフューズド、ストレスマウスとワバン透過、ストレスマウス、ならびにNaCl浸透マウスとワババン透過マウスとワババン透過マウスの間の有意な違いを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

我々は、浸透圧ポンプに接続された大脳基底核および小脳へのカニューラの移植を介して、薬理学的DYT/PARK-ATP1A3ジストニアマウスモデルを生成するためのプロトコルを提供する。我々は、運動課題の適用によるジストニア様運動の誘導と行動スコアリングシステムを介した表現型の特徴を記述する。

DYT/PARK-ATP1A3ジストニアの症理学的マウスモデルを確立するための浸透性ポンプの移植とストレスの誘導

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

このプロトコルの全体的な目標は、浸透圧ポンプで脳カニューラを使用し、挑戦的な運動タスクを介してストレスを誘発することによってDYT/PARK-ATP1A3ジストニアの症候性、薬理学的マウスモデルを確立することに関与する手順を記述することです。この方法は、複数の脳カニューレへの浸透圧ポンプを介した慢性薬物送達を用いた薬理学的マウスモデルの確立方法と、挑戦的な運動タスクを介して表現型を誘導する方法を詳述する。軽度の運動ストレスパラダイムはまた、運動障害における遺伝子環境相互作用の役割に関する洞察を提供し、他のげっ歯類モデルに適用することができる。動物実験は、動物のケアおよび使用に関する適用可能な国家および制度的ガイドラインに従って行われた。滅菌環境で浸透圧ポンプを準備し始めます。まず、1ミリリットルのシリンジに27ゲージ充填カニューレを無菌濾過ワバン溶液または車両溶液で充填します。浸透圧ポンプを直立した位置に保持し、カニューレをポンプに挿入し、余分な溶液が上に現れるまでゆっくりと貯水池を満たします。次に、フローモデレータをポンプに挿入します。フローモデレータの白いフランジをはさみで慎重に外し、ビニールチューブをフローモデレーターに接続します。各ポンプを生理食動物溶液で満たしたエペンドルフチューブに沈め、サーモサイクラー37度に入れて、ポンプ速度が手術を開始する前に安定した状態に達するようにします。承認されたプロトコルに従って動物を深く麻酔した後、動物を定位フレームに入れ、ゴムチップまたは非破裂した耳棒を使用して頭部を固定します。外科領域を徹底的に消毒した後、メスを使って頭の上部に切開を配置し、はさみを使用して前肢まで切開を続ける。ブルドッグクランプの助けを借りて頭蓋骨を露出させ、滅菌綿先端アプリケーターで骨膜を拭きます。脳のカニューレの3つの入り口点を、黒いインクで染まったペンまたはカニュールの先端をブレグマで揃え、適切な座標を使用して、頭蓋骨の脳カニューレの3つのエントリポイントをマークします。次に、大脳大脳に指定された二重カニューラと小脳用に指定された単一のカニューレの穴を慎重に掘削します。線条体と小脳の間の小さなネジのために4番目の穴を開けます。このねじは最終的に歯科用セメントに埋め込まれ、カニューラのための追加のホールドを提供する。動物の両側の浸透圧ポンプ用の小さなポケットを作るためには、組織鉗子を使用して皮下組織層を分離する。鉗子を後ろ脚に向かって進め、皮下ポケットを広げるために鉗子をわずかに開けます。反対側でも同じ手順を繰り返し、最初に切開から鉗子を取り除き、次に第2後脚に向かってそっと押します。鉗子の助けを借りて、慎重に各皮下ポケットにポンプと接続されたカテーテルを挿入します。ポケットはポンプが容易に滑り込むことを可能にするべきである。ミニポンプホルダーを使用して、小脳の正中線に掘削された穴に3.0ミリメートルのカスタム長さの単一の浸透カニューレを導入します。カニューレヘッドを慎重に取り外し、カニューレと小さなネジを歯科用セメントで固定し、浸透ポンプのチューブ用の接続部分を覆わないように注意してください。カニューレを取り巻く歯科医のセメントが完全に乾燥していることを確認してから手術を続けます。二重カニューレを大脳基底核の上に掘削された穴に挿入する前に、2つの0.5センチメートルの長さのビニールチューブをダブルカニューレの2つの接続部分に取り付けます。ビニルチューブを分岐アダプターで接続し、チューブシステム全体に無菌ワバン溶液または車両を慎重に事前に事前に充填します。次に、二重カニューレを歯科用セメントで固定することにより、単一カニューレとエンドに対して前述と同じ手順を繰り返します。浸透圧ポンプのカテーテルを分岐アダプターに接続し、それぞれ単一のカニューレに接続します。両方のポンプは等しい流量を持っているので、同じ濃度が大脳基底核と小脳の両方に達することを確実にするために、二重濃縮溶液を二重濃縮溶液で接続するように注意してください。皮膚を伸ばすことなく、できるだけステッチで動物の背中の切開を閉じます。皮下に無菌生理食い物を注入します, 脱水を避けるために体温を持っている必要があります.動物を立体性フレームから取り出し、回収ケージに入れます。ジストニア様運動を誘発するためには、ワバーンを透過させたマウスは、手術後4時間ごとに軽度のストレスパラダイムとして挑戦的な運動タスクにさらされ、その後24時間ごとに繰り返し行われるべきである。これには、動物の行動特性は含まれません。ここでは、50センチメートルの粗い表面の木製ポールの上に置かれ、鼻を下向きにした車両を浸透させた動物の例を示します。落下時には、ポールの底部に十分な寝具を用意します。ワバンを透過させたマウスの場合、動物は手術後4時間でブラジキネシアのような最初の症状を提示し始めるべきである。しかし、手術後24時間後、下降時のジストニア様運動の徴候として、前肢または後肢の不随意過伸展を見るべきです。マウスは極を3回降下させ、各降下の間に少なくとも2分間の回復を可能にするべきである。降下時間を測定する必要はありません。ポールテストは、回転ロッドを使用して、第二のモータタスクが続く必要があります。ロタロッド性能試験で行われたように、ストレス群のワバンマウスと車両透過マウスは回転ロッドに配置されます。落下までの待ち時間を測定する必要はありません。前のテストで行ったように、マウスは回転ロッドに3回置かれ、2分間の回復を可能にする。修飾ジストニア評価スケールは、マウスのジストニアのような動きの頻度、重症度、および身体分布を評価するために使用することができる。動物はプラスチックまたは木箱に入れ、動きは4分間記録されるべきです。評価者は、グループの割り当てに目を見えない必要があります。ジストニアのような動きや姿勢は、前肢の不随意過伸展、広い姿勢、後肢の過伸展、およびキフォシスである。1つの身体部分のみが影響を受ける場合、ジストニアは焦点とみなされるべきです。体幹と少なくとも2つの他の身体部分が影響を受ける場合、ジストニアは一般化と見なされるべきです。新たに開発された2番目のスコアリングシステムは、テールサスペンションテスト中のジストニア様運動の有無と重症度を評価します。テストの場合は、マウスをベース付近の尻尾で2分間押し上げてください。テールサスペンションテストを記録し、その後の映像の分析にスコアを割り当てることをお勧めします。前肢はゼロから4ポイントに得点されます。両方の前肢の1つの反復または持続的な強壮剤の引き込み、ならびに前肢の交差と組み合わせた過伸展は、ジストニア様として採点される。後肢のジストニアのような動きは、引き込みと食いしばり、ならびに持続的な過伸展を意味し、ゼロから3ポイントにスコア付けされる。記録された時間の80%以上のトランカル歪みが追加点で採点されます。後肢のクラスピングは運動障害に対する非特異的徴候であり、採点してはならない。このグラフは、ジストニア評価尺度の結果を示す。ワバン透過型ストレスマウスは、非ストレスワバン透過群および動物よりも72時間の観察期間にわたってジストニア様の動きを有意に多く提示する。この画像は、尾部懸濁液試験の結果を示し、ジストニア評価尺度と同様の結果を示しています。なお、各時点の各動物の合計スコアから平均の結果を得る。このビデオを見た後、あなたは立体的に複数の脳カニューレを移植する方法と皮下浸透性ポンプを移植する方法をよく理解しているはずです。この方法の主な利点は、反復的でストレスの多い注射を避けることができ、そうでなければシステム全体の副作用を持つであろうワバンのような基質が特定の脳構造に直接送達できることである。

implantation-osmotic-pumps-induction-stress-to-establish-symptomatic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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