高分解能融解解析を用いた CALR 遺伝子の遺伝的変異体検出

この方法は、特に他の診断オプションが限られているか、非血液疾患と重複している場合に、血液疾患が疑われる患者のカルレティキュリン変異を正確に定義します。高解像度ミラー技術の主な利点は、カルレティキュリン遺伝子のホットスポット領域における一般的な体細胞遺伝的変異体を、検出の許容限界と手頃な価格で検出できることです。この技術により、骨髄増殖性疾患、特に本態性血小板血症と原発性骨髄線維症の迅速かつ非侵襲的な診断が可能になります。

現在、これらの患者の治療法の選択に影響を与えていません。.ただし、これは将来変更される可能性があります。まず、テキスト原稿に記載されているようにqPCR HRMマスターミックスを調製し、各DNAサンプルとコントロールを3回繰り返すのに十分な量を作ります。

チューブを軽く叩いて反転させ、2〜3秒間ボルテックスして反応内容物を混合した後、チューブを短時間回転させて飛散した液滴を回収します。19マイクロリットルのqPCR HRMマスターミックスを96ウェル光学反応プレートの各ウェルに移します。ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、サンプルの1マイクロリットルを、DNAの代わりにqPCR HRMマスターミックスの調製に使用される無菌RNAおよびDNAの自由水の1マイクロリットルで、テンプレートコントロールまたはNTCなしのプレートの適切なウェルにピペットで移します。

反応プレートを光学接着フィルムでしっかりとシールし、運転中の蒸発を防ぎます。その後、室温でGの780倍で1分間回転させます。液体が反応プレートのウェルの底にあることを確認し、アッセイを実行します。

装置システムソフトウェアでコントロールとサンプルを適切なウェルに割り当て、デフォルトの装置増幅プロトコルを変更します。テキスト原稿に記載されているように装置をプログラムし、qPCRの直後に解離分析を実行します。実行が終了したら、増幅プロットを確認して確認します。

装置システムソフトウェアの実験メニューで、増幅プロットオプションを選択します。データが表示されない場合は、緑色の分析ボタンをクリックします。[Amplification Plot]タブで、プロットタイプのドロップダウンメニューから、増幅データを蛍光の読み取り値として表示するプロットを選択し、サイクル番号の関数としてパッシブリファレンスからの蛍光に正規化し、プロットの色ドロップダウンメニューで[sample]を選択します。

グラフ タイプのドロップダウン メニューから、線形増幅グラフ タイプを選択し、ベースラインの開始サイクルと終了サイクルが正しく設定されていることを確認します。終了サイクルは、有意な蛍光シグナルが検出されるサイクル番号の数サイクル前に設定する必要があります。[グラフ タイプ] ドロップダウン メニューから [log 10 増幅] グラフ タイプを選択し、しきい値オプションを選択してグラフにしきい値の線を表示し、しきい値を調整します。

閾値線は、qPCR 曲線で指数位相を横切る必要があります。すべてのサンプルウェルとポジティブコントロールウェルの増幅曲線が正常であること、および NTC ウェルに増幅がないことを確認します。正規増幅プロットは、サイクル15と35の間のしきい値を超える蛍光の指数関数的な増加を示しています。

導関数の融解曲線で、融解前と融解後の領域または温度線を確認します。溶融前および溶融後の領域は、蛍光レベルに大きなピークや傾きがない平坦な領域内にある必要があります。必要に応じて、溶融前と溶融後の温度ラインの開始と停止を、互いに約0.5°C離して設定します。

パラメータが調整されている場合は、解析ボタンをクリックして解析を再開します。差分ポットタブのプロット設定タブで、野生型コントロールの複製の1つを参照DNAとして選択し、解析ボタンをクリックして解析を再開します。整列したMelt curvesタブで、すべてのポジティブコントロールが正しい遺伝子型を持っていること、およびNTCが増幅に失敗したことを確認します。

ウェルテーブルからコントロールウェルを選択して、分析プロットで対応する融解曲線を強調表示し、線の色が正しい遺伝子型に対応していることを確認します。整列されたメルトカーブタブで、未知のサンプルのプロット表示を慎重に確認し、コントロールのプロット表示と比較します。不明なサンプルの複製を含むウェルを選択し、コントロールを含むウェルを 1 つずつ選択して、メルトカーブをコントロールに順序付けられた順序で整列させます。

「差分プロット」タブで未知のサンプルの結果を分析し、得られた結果が一貫していることを確認します。未知のサンプルの反復を含むウェルを選択し、メルトカーブを順序付けられた順序でコントロールに整列させ、コントロールを含むウェルを1つずつ選択します。蛍光核酸株を含む4%アガロースプレキャストゲル上でqPCR HRM製品を実行します。

陽性の陰性NTCを1回のみ実行し、qPCR HRMの複製をサンプリングします。プレキャストゲルとカセットをパッケージから取り出し、コームを取り外し、製造元の指示に従ってゲルを装置に挿入します。10 マイクロリットルのサンプルを滅菌 RNA および DNA フリー水で 20 マイクロリットルに希釈し、希釈したサンプルを各ウェルに 20 マイクロリットルロードします。

DNAサイズの標準溶液3マイクロリットルを20マイクロリットルに希釈し、マーカーウェルにロードします。空のウェルには、20マイクロリットルの滅菌RNAとDNAの自由水を入れます。すぐにパーセンに応じてプログラムを選択し、実行されているゲルのeと装置の実行時間を20分に設定します。

サンプルをロードしてから1分以内に電気泳動を開始します。電気泳動が完了したら、ブルーライトまたはUV透過照明を使用してDNAとゲルを視覚化します。また、蛍光光線がサイクル 15 から 35 の間の閾値を超え、すべてのレプリケートとコントロールで定量サイクルの値が非常に狭い値で関心領域を増幅することに成功したことは、高分解能融解分析による遺伝的分散の信頼性の高い同定の前提条件です。

HRM分析はqPCRの直後に実行され、サンプルの活性融解領域、コントロール、およびNTCを使用して、整列した融解曲線プロットが作成されます。溶融前と溶融後の領域を正しく設定することは、サンプルの遺伝的分散を適切に視覚化および同定するために重要です。ここでは、整列したメルトカーブとさまざまなポットを示しています。

未知のサンプルは、ポジティブコントロールの1つと密接に整列しています。融解前と融解後の領域または温度線の設定を間違えると、融解曲線が整列し、プロットが異なるため、遺伝的分散の正確な識別がより困難になります。サンプル中の遺伝的変異は、サンプルのバンドパターンをコントロールと比較することで特定できます。

そして、HRMとアガロースゲル電気泳動を組み合わせることによって。正しい遺伝的変異の同定は、HRMアッセイで使用されたコントロールの1つと同じ遺伝的変異を含むサンプルに対してのみ行うことができます。希少なカルレティキュリン遺伝的変異を含むサンプルは、HRMの結果と電気泳動のバンドパターンが異なります。

このプロトコールを試行する際には、既知サンプルとコントロールサンプルのアライメントされたメルトカーブプロット表示を慎重に比較することが重要です。