キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

このプロトコールは、活性真核生物翻訳の単一分子解析に既存の無細胞翻訳システムの利用を可能にするという点で重要です。この手法の主な利点は、バルク翻訳特性を保持し、単一分子の分解能を提供し、他のバルク翻訳アッセイから比較的簡単に適応できることです。この方法は、バルク条件下での効率的なキャップ依存翻訳を可能にすることが確認されている任意の無細胞翻訳システムに適用できます。

この手順を実演するのは、研究員のHongyun Wang氏と、Xiaohui Qu研究所の上級研究員であるAnthony Gaba氏です。1分子実験を行う少なくとも3時間前に、顕微鏡インキュベーターの電源を入れ、実験の過度の音響障害を避けるために、気流を低速度に減らしてください。次に、インキュベーターの温度を無細胞翻訳システムに固有の最適な温度に設定します。

実験の少なくとも1時間前に、レーザーボックスの後ろにあるレーザー電源ボタンを押し、レーザー安全キーを回し、スタートボタンを押してレーザーをオンにします。顕微鏡の電源を入れ、イメージングモード、対物レンズ、フィルターセットを選択します。EMCCDカメラ、ステージコントローラー、シリンジポンプ、コンピューターの電源を入れ、カメラ、レーザー、電動ステージ、シリンジポンプソフトウェアを開きます。

レーザー制御ソフトウェアで、[接続]をクリックしてレーザー強度を設定し、シャッターボックスのチェックを外して、[コントロール]をクリックしてレーザー制御ポップアップウィンドウの強度スライドバーをドラッグします。透過深度を入力してレーザーを希望の角度に設定し、イメージングしていないときにレーザーをオフモードに維持するためにシャッターボックスが閉じていることを確認します。カメラが冷却され、指定された動作温度まで安定したら、カメラソフトウェアで、取得モードにキネティックを選択し、露光時間、キネティックシリーズ長、および電子増倍ゲイン値のパラメーターを入力します。

ディレクトリを選択し、データイメージファイルを保存するためのファイル名を割り当てます。シリンジポンプを適度な流量から速い流量に設定し、500マイクロリットルの70%エタノールをマイクロフュージチューブに加えます。シリンジポンプのチューブ端をエタノール溶液に挿入し、シリンジポンプソフトウェアを使用してシリンジポンプを引き出しモードと分注モードの間で切り替え、チューブをエタノールで3回、RNaseフリー水で3回洗浄します。

最終的な水洗い後、チューブの端を清潔なティッシュペーパーで軽くたたいて、チューブの内側に残っている水分を取り除き、チューブの端を清潔なマイクロチューブに入れます。3つのプライムエンドのビオチン化mRNAを固定化するには、カバーガラス面を下にしてフローチャンバーを顕微鏡サンプルホルダーに置き、チャンバーをテープで固定します。テープを使用して、使用していない流路の入口と出口を覆い、200マイクログラム/ミリリットルのストレプトアビジン溶液の1.5倍の体積を流路に追加します。

室温で10分後、1回の洗浄につき3倍の量のT50洗浄バッファーと折りたたまれた実験組織でチャネルを3回洗浄および拭きます。最後の洗浄後、浸漬油を顕微鏡の対物レンズに一滴垂らし、ホルダーとチャンバーを顕微鏡ステージに置きます。次に、対物レンズの浸漬油がカバーガラスに接触するまで対物レンズをカバーガラスに近づけ、流路の位置が対物レンズの真上に来るようにサンプルステージを動かします。

顕微鏡制御のタッチスクリーンで、フォーカスタブを選択し、[フォーカス検索と開始]をクリックします。フォーカスプレーンが正常に達成されると、ビープ音が鳴ります。カメラソフトウェアで、ライブモードを選択します。

レーザー制御ソフトウェアで、レーザーシャッターを開き、レーザー強度レベルを調整します。ライブモードと顕微鏡制御タッチスクリーンで、ファインステップコントロールを使用して対物レンズ位置を調整することで、リアルタイムの蛍光画像を観察することができます。カメラソフトウェアでステージを動かし、流路検出面のさまざまな領域における蛍光バックグラウンドのレベルを評価します。

蛍光が低い場合は、レーザー制御ソフトウェアでライブモードを停止し、レーザーシャッターを閉じ、流路からの洗浄バッファーをビオチン化mRNA溶液の2倍の量に交換します。15分後、1回の洗浄につき3倍の量の翻訳適合バッファーでチャンネルを3回洗浄します。1分子検出では、mRNAを含まない解凍したばかりの翻訳ミックスを3倍の量で組み立て、最適な濃度の蛍光標識抗体を氷上の微量遠心チューブに添加し、チューブを短時間回転させてチューブの底に混合物を回収します。

トランスレーションミックスを700マイクロリットルのマイクロチューブキャップの内側に移し、シリンジポンプを引き出しモードに設定します。ポンプチューブの端をトランスレーションミックスに挿入し、シリンジの引き出しを開始します。トランスレーションミックスがポンプチューブに完全に入ったら、引き出しを停止し、シリンジポンプの設定をディスペンスモードに戻して、トランスレーションミックスの送達に最適な速度に流量を設定します。

必要に応じてシリンジを開始および停止して、並進混合物がチューブの端に到達するようにし、気泡を避けながらポンプチューブの端を流路の入口に挿入します。カスタムメイドの金属製ブラケットを顕微鏡サンプルホルダープレートにねじ込み、接続を安定させ、顕微鏡の焦点とイメージング領域の蛍光を評価します。ムービー取得パラメータが正しいこと、およびファイルの保存に適切なファイル名とディレクトリが入力されていることを確認してください。

ステージを動かして、流路検出面の中央の領域をイメージングできるようにします。そして、コンティニュアスAFタブで、スタートボタンをクリックします。フォーカスプレーンが正常に達成されると、ビープ音が鳴ります。

周囲光を減らした後、レーザーシャッターを開き、信号撮影ボタンをクリックして録音を開始します。5 秒後に run コマンドを入力して、変換ミックスをフロー チャネルに配信します。次に、フレーム時間あたり0.5〜2秒の解像度で最大2時間データを記録します。

Cy3 ANTI-FLAG結合イベントを解析するために、選択したCy3アルファフラグスポットの蛍光強度を動画全体のフレームごとに計算し、強度軌道を形成するために接続しました。生の軌道はノイズが多く見える場合があり、バックグラウンドノイズを減らすために非線形の前方/後方フィルターによる微調整が必要になる場合があります。歩数検出アルゴリズムを使用して軌道をデジタル化することで、さらなる改良を行うことができます。

新生ポリペプチドへの抗体の結合は蛍光の瞬間的な増加を引き起こしますが、抗体ポリペプチドの解離は瞬間的な蛍光の減少を引き起こします。ルシフェラーゼフラグmRNAの滞留時間ヒストグラムは、対数正規分布に適合し、ペプチド合成速度は1秒あたり2.5±0.1アミノ酸です。最初の到着時間ヒストグラムは、シフトされた対数正規関数に適合しており、単一のmRNA翻訳活性における高い不均一性を示しています。

ヒストグラムが示すように、単一のルシフェラーゼフラグmRNA分子に対する最初のペプチド合成イベントは、翻訳ミックス送達後2分から20分後に開始できます。ルシフェラーゼフラグmRNAによる翻訳と比較して、ヘアピンルシフェラーゼフラグmRNA翻訳による初回到着時間ヒストグラムでは、抗体の結合が遅いことが示されました。しかし、これらの同じmRNAを用いた無細胞翻訳反応からのバルク発光測定を使用しても、翻訳速度の違いは解決されません。

このアッセイの単一分子分解能は、他のアプローチでは容易に達成できないキャップ依存性翻訳のより速度論的な洞察を提供します。真核生物の無細胞翻訳は、小さな変動や実験条件に敏感です。したがって、このアッセイを使用して翻訳の小さな違いを正確に検出する際には、細部への注意と一貫性が重要です。