Name: キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶキャップ依存翻訳キネティクス解析のためのインビトロ単分子イメージングアッセイ。無細胞翻訳系を用いて、翻訳開始と伸長の動態を単分子レベルで高分解能に解析する手法です。

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この研究は、国立衛生研究所[R01GM121847]によってサポートされました。メモリアルスローンケタリングがんセンター(MSKCC)サポートグラント/コアグラント(P30 CA008748);そしてMSKCC機能ゲノミクスイニシアティブ

著者らは開示するものは何もない。

一般的なインビトロTIRF単一分子実験と比較して、ここで説明するアッセイによる単一分子イメージングは、細胞抽出物および蛍光標識抗体の高濃度の使用による追加的に複雑である。1ラウンドの表面PEGylationの一般的な手法と比較して、PEGylationの第2ラウンド(ステップ2)は、検出面15に結合する非特異的抗体を大幅に減少させる。蛍光性抗体の拡散濃度が高いと、極めて高い蛍光バックグラウンドが生じ、抗体結合の単一分子検出がマスクされます。この蛍光背景を低減するために、レーザー入射角度は臨界角より大きく増加する(ステップ3.4)。抗体検出は、過剰なフルオロフォア不安定性によっても減少し、住み込み時間を定量化する能力を制限する可能性があります。この問題が発生した場合、蛍光方を、三重状態のクエンチャー47に結合したものなど、よりフォト可能な蛍光方に置き換えるか、レーザー照明強度を低下させる。酸素清掃システムは、フルオロフォア光化を抑制するインビトロ単分子実験で一般...

真核生物系における翻訳は、主に7-メチルグアノシン(m7G)キャップ依存経路1を介して起こる。研究は、真核生物翻訳の開始段階がレート制限であり、規則2、3、4の共通の目標であることを示している。キャップ依存性翻訳のメカニズムは、遺伝的5、生化学的6、7、8、構造9、およびゲノム10バルクアプローチを用いて広範囲に研究されてきた。これらの方法は、キャップ依存の開始を制御する多様なメカニズムを特定しましたが、その解決は、異種および非同期開始イベントからの信号のアンサンブル平均に制限されます。さらに最近では、生体内翻訳イベントの個々の可視化は、新生ポリペプチド11、12、13、14上のエピトープに結合する蛍光抗体を測定する方法によって可視化されている。しかし、これらの新しいアプローチは、複数の蛍光抗体が新生ペプチドに結合して、単一の翻訳事象を高細胞内蛍光のバックグラウンドから解決できるようにするために、個々の開始事象を解決する能力にも限界があります。多くの生物学的相互作用において、解決された個々の運動事象は、分子レベルで同期することができない複雑な多段階および反復的な生物学的プロセスを理解するための重要な洞察を提供してきた。キャップ依存の開始と規制をより深く理解するためには、個々の翻訳イベントのダイナミクスを追跡できる新しい方法が必要です。
我々は最近、単一分子分解能15を有するキャップ依存性開始運動を測定するインビトロアッセイを開発した。この開始経路3,16に関与する既知および未知のタンパク因子の多数を考慮すると、単一分子アッセイは、細胞因子および堅牢な翻訳活性17、18、19、20、21、22、23、24、25の保存の恩恵を受けるために、既存のインビトロ無細胞翻訳系と互換性があるように開発された。さらに、無細胞翻訳システムを使用することで、単一分子観測と以前のバルク結果との比較がより互換性があります。このアプローチは、キャップ依存開始の既存の機械化フレームワークに新しい単一分子運動学的洞察を簡単に統合することを提供する。単一分子アッセイを確立するために、従来の無細胞翻訳システムは3つの方法で修飾されます:エピトープコード配列はレポーターmRNAのオープンリーディングフレーム(ORF)の最初に挿入されます。レポーターmRNAの3′末端は、単一分子検出表面へのmRNA末端テザリングを容易にするためにビオチン化される。蛍光標識抗体は翻訳抽出物に補足されます。これらの修飾は、基本的な分子生物学の技術と一般的に入手可能な試薬のみを必要とします。さらに、これらの改変および単一分子イメージング条件は、バルク無細胞翻訳反応15の翻訳動態を維持する。
このアッセイ(図1)において、5′末端キャップおよび3′末端ビオチン化レポーターmRNAは、流れチャンバ内のストレプトアビジン被覆検出面に固定化される。流れチャンバは、次いで蛍光標識抗体を補充した無細胞翻訳混合物で満たされる。エピトープ配列26,27の下流にある約30~40コドンに対するmRNA翻訳が行われた後、エピトープはリボソーム出口トンネルから出現し、蛍光標識抗体と相互作用するようになります。この相互作用は迅速であり、単一分子蛍光イメージング技術による検出により、活性無細胞翻訳中の単一分子分解能による翻訳キネティックスの追跡が可能になります。このアッセイは、キャップ依存翻訳キネティクスとその規制、特に働くバルクインビトロアッセイを有するシステムに関するインビトロ研究に大きく利益をもたらすべきである。
この単一分子アッセイを確立するための前提条件は、働くバルク無細胞翻訳アッセイであり、市販または前に述べた方法28に記載された翻訳抽出物を使用して達成することができる。真核生物翻訳抽出物は、真菌、哺乳類、および植物28を含む多様な細胞から得ることができる。イメージングのために、このアッセイは、調整可能なレーザー強度と入射角度、電動サンプルステージ、電動流体システム、およびサンプル温度制御装置を備えたTIRF顕微鏡を必要とします。このような要件は、現代 のインビトロ 単一分子TIRF実験に対して一般的であり、異なる方法で達成され得る。ここで紹介する実験では、市販の顕微鏡、ソフトウェア、および付属品から構成される客観的なタイプのTIRFシステムを使用して、すべての 材料表に記載されています。

<table><tbody><tr><td>100X オイル対物レンズ、N.A. 1.49</td><td>オリンパス</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>アクリルミド/ビス (40%, 19:1)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>アルカリ性液体洗剤</td><td>デコン</td><td>5332</td><td></td></tr><tr><td>アミノシラン (N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシラン)</td> <td>UCT Specialties, LLC</td><td>A0700</td><td></td></tr><tr><td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CSO-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solisソフトウェア</td><td>Andor</td><td></td><td>Andor EMCCD</td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td>制御用 <td>Chroma</td><td>532/640/25</td><td></td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td><td>Chroma</td><td>NF03-405/488/532/635E-25</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Biotin-PEG-SVA</td><td></td></tr><tr><td>Coenzyme A 遊離酸</td><td>Prolume</td><td>309-250</td><td></td></tr><tr><td>Cooltermソフトウェア</td><td></td><td></td><td>シリンジポンプの制御用</td></tr><tr><td>デスクトップコンピュータ</td><td>Dell</td><td></td><td>顕微鏡、カメラ、ステージ、ポンプの制御用。</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>Semrock</td><td>R405/488/532/635</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1139450</td><td></td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>ホタルルシフェリン D-ルシフェリン遊離酸</td><td>Prolume</td><td>306-250</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1185500</td><td></td></tr><tr><td>ペリオキシド水素</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>216763-500ML</td><td></td></tr><tr><td>浸漬油</td><td>オリンパス</td><td>Z-81226A</td><td>低自家蛍光</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>プロメガ</td><td>E1500</td><td></td></tr>メガ<tr><td>スクリプトT7転写キット</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAM1334</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー科学</td><td>MMX04751</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗FLAG M2-Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9594</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>MS(PEG)4</td><td>Thermo Scientific</td><td>22341</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>No 1.5 顕微鏡 カバーガラス</td><td>フィッシャーバンド</td><td>12-544-C</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス レーザー、532nm 100mM</td><td>オリンパス デジタル レーザーシステム</td><td>CMR-LAS 532nm 100mW</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス TirfCtrl ソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td></td><td>レーザー強度と入射角の制御用</td></tr><tr><td>光学テーブル</td><td>TMC 振動制御</td><td>63-563</td><td>防振フェ</td></tr><tr><td>ノールクロロホルムイソアミルアルコールミックス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>20160</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウムペレット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Prior 電動XY翻訳ステージ</td><td>Prior</td><td>PS3J100</td><td></td></tr><tr><td>Prior PriorTestソフトウェア</td><td>前</td><td></td><td>以前の電動ステージを制御するため</td></tr><tr><td>組換えRNasin RNase阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>生体内科学(世界の精密機器)</td><td>98710-1</td><td>カスタムメイドのアクリルケージ付き</td></tr><tr><td>染色ジャー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>08-817</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>43-4301</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A300212</td><td></td></tr><tr><td>SYBR グリーン II</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S7564</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>1725RN</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ・ポンプ</td><td>ハーバード・デバイス</td><td>55-3333</td><td></td></tr><tr><td>トリス (1M)、pH = 7.0</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>ブランソン</td><td></td><td></td>CPX1800H</tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>ワクシニア キャッピング システム</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-Spin IC カラム</td><td>Zymo Research</td><td>C1004</td><td></td></tr></tbody></table>

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

キャップ依存性タンパク質合成は、真核細胞における主要な翻訳経路である。様々な生化学的および遺伝的アプローチにより、キャップ依存翻訳とその調節に関する広範な研究が可能になっているが、この翻訳経路の高解像度運動特性は依然として欠けている。最近では、キャップ依存性翻訳キネティクスを単一分子分解能で測定する インビトロ アッセイを開発しました。このアッセイは、蛍光標識された抗体が、新生エピトープタグ付きポリペプチドに結合することに基づいている。新生ペプチド-リボソーム-mRNA複合体との抗体の結合および解離をイメージングすることにより、個々のmRNA上の翻訳進行を追跡することができます。ここでは、mRNAおよびPEGylatedスライド調製物、翻訳のリアルタイムイメージング、単一分子軌道の解析など、このアッセイを確立するためのプロトコルを提示する。このアッセイは、個々のキャップ依存翻訳イベントの追跡を可能にし、開始率や伸長率などの主要な翻訳キネティクスを解決します。このアッセイは、明確な翻訳システムに広く適用することができ、キャップ依存翻訳キネティクスおよび翻訳制御機構の インビトロ 研究に広く役立つべきである。

記載されたプロトコルに従って、3'末端テザリングレポーターmRNAの活性無細胞翻訳中に単一分子分解能を有する新生N末端タグ付きポリペプチドとの個々の抗体相互作用のイメージングを可能にする(図1)。最小の実証実験は、3つの合成mRNAを使用して報告されます: LUC (タグなしルシファーゼをコード化), LUCFLAG (3xFLAGタグ付きルシファーゼをコード),およびhp-LUCFLAG (5' リーダー領域で安定したステムループを持つLUCFLAG) (図2C).ルシメラーゼコードmRNAを使用することで、単一分子観測とバルク発光測定の比較が可能になります。3'ビオチン化mRNAの完全性を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびRNA染色を変性することによって評価した。良質のmRNAは単一のクリーン...

個々の翻訳イベントを追跡することで、キャップ依存翻訳メカニズムの高解像度の運動研究が可能になります。ここでは、蛍光標識抗体とエピトープタグ付き新生ペプチドとのイメージング相互作用に基づく インビトロ 単分子アッセイを示す。この方法は、 インビトロ キャップ依存的なアクティブな翻訳中の開始およびペプチド伸長性キネティクスの単一分子特性を可能にする。

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

このプロトコールは、活性真核生物翻訳の単一分子解析に既存の無細胞翻訳システムの利用を可能にするという点で重要です。この手法の主な利点は、バルク翻訳特性を保持し、単一分子の分解能を提供し、他のバルク翻訳アッセイから比較的簡単に適応できることです。この方法は、バルク条件下での効率的なキャップ依存翻訳を可能にすることが確認されている任意の無細胞翻訳システムに適用できます。この手順を実演するのは、研究員のHongyun Wang氏と、Xiaohui Qu研究所の上級研究員であるAnthony Gaba氏です。1分子実験を行う少なくとも3時間前に、顕微鏡インキュベーターの電源を入れ、実験の過度の音響障害を避けるために、気流を低速度に減らしてください。次に、インキュベーターの温度を無細胞翻訳システムに固有の最適な温度に設定します。実験の少なくとも1時間前に、レーザーボックスの後ろにあるレーザー電源ボタンを押し、レーザー安全キーを回し、スタートボタンを押してレーザーをオンにします。顕微鏡の電源を入れ、イメージングモード、対物レンズ、フィルターセットを選択します。EMCCDカメラ、ステージコントローラー、シリンジポンプ、コンピューターの電源を入れ、カメラ、レーザー、電動ステージ、シリンジポンプソフトウェアを開きます。レーザー制御ソフトウェアで、[接続]をクリックしてレーザー強度を設定し、シャッターボックスのチェックを外して、[コントロール]をクリックしてレーザー制御ポップアップウィンドウの強度スライドバーをドラッグします。透過深度を入力してレーザーを希望の角度に設定し、イメージングしていないときにレーザーをオフモードに維持するためにシャッターボックスが閉じていることを確認します。カメラが冷却され、指定された動作温度まで安定したら、カメラソフトウェアで、取得モードにキネティックを選択し、露光時間、キネティックシリーズ長、および電子増倍ゲイン値のパラメーターを入力します。ディレクトリを選択し、データイメージファイルを保存するためのファイル名を割り当てます。シリンジポンプを適度な流量から速い流量に設定し、500マイクロリットルの70%エタノールをマイクロフュージチューブに加えます。シリンジポンプのチューブ端をエタノール溶液に挿入し、シリンジポンプソフトウェアを使用してシリンジポンプを引き出しモードと分注モードの間で切り替え、チューブをエタノールで3回、RNaseフリー水で3回洗浄します。最終的な水洗い後、チューブの端を清潔なティッシュペーパーで軽くたたいて、チューブの内側に残っている水分を取り除き、チューブの端を清潔なマイクロチューブに入れます。3つのプライムエンドのビオチン化mRNAを固定化するには、カバーガラス面を下にしてフローチャンバーを顕微鏡サンプルホルダーに置き、チャンバーをテープで固定します。テープを使用して、使用していない流路の入口と出口を覆い、200マイクログラム/ミリリットルのストレプトアビジン溶液の1.5倍の体積を流路に追加します。室温で10分後、1回の洗浄につき3倍の量のT50洗浄バッファーと折りたたまれた実験組織でチャネルを3回洗浄および拭きます。最後の洗浄後、浸漬油を顕微鏡の対物レンズに一滴垂らし、ホルダーとチャンバーを顕微鏡ステージに置きます。次に、対物レンズの浸漬油がカバーガラスに接触するまで対物レンズをカバーガラスに近づけ、流路の位置が対物レンズの真上に来るようにサンプルステージを動かします。顕微鏡制御のタッチスクリーンで、フォーカスタブを選択し、[フォーカス検索と開始]をクリックします。フォーカスプレーンが正常に達成されると、ビープ音が鳴ります。カメラソフトウェアで、ライブモードを選択します。レーザー制御ソフトウェアで、レーザーシャッターを開き、レーザー強度レベルを調整します。ライブモードと顕微鏡制御タッチスクリーンで、ファインステップコントロールを使用して対物レンズ位置を調整することで、リアルタイムの蛍光画像を観察することができます。カメラソフトウェアでステージを動かし、流路検出面のさまざまな領域における蛍光バックグラウンドのレベルを評価します。蛍光が低い場合は、レーザー制御ソフトウェアでライブモードを停止し、レーザーシャッターを閉じ、流路からの洗浄バッファーをビオチン化mRNA溶液の2倍の量に交換します。15分後、1回の洗浄につき3倍の量の翻訳適合バッファーでチャンネルを3回洗浄します。1分子検出では、mRNAを含まない解凍したばかりの翻訳ミックスを3倍の量で組み立て、最適な濃度の蛍光標識抗体を氷上の微量遠心チューブに添加し、チューブを短時間回転させてチューブの底に混合物を回収します。トランスレーションミックスを700マイクロリットルのマイクロチューブキャップの内側に移し、シリンジポンプを引き出しモードに設定します。ポンプチューブの端をトランスレーションミックスに挿入し、シリンジの引き出しを開始します。トランスレーションミックスがポンプチューブに完全に入ったら、引き出しを停止し、シリンジポンプの設定をディスペンスモードに戻して、トランスレーションミックスの送達に最適な速度に流量を設定します。必要に応じてシリンジを開始および停止して、並進混合物がチューブの端に到達するようにし、気泡を避けながらポンプチューブの端を流路の入口に挿入します。カスタムメイドの金属製ブラケットを顕微鏡サンプルホルダープレートにねじ込み、接続を安定させ、顕微鏡の焦点とイメージング領域の蛍光を評価します。ムービー取得パラメータが正しいこと、およびファイルの保存に適切なファイル名とディレクトリが入力されていることを確認してください。ステージを動かして、流路検出面の中央の領域をイメージングできるようにします。そして、コンティニュアスAFタブで、スタートボタンをクリックします。フォーカスプレーンが正常に達成されると、ビープ音が鳴ります。周囲光を減らした後、レーザーシャッターを開き、信号撮影ボタンをクリックして録音を開始します。5 秒後に run コマンドを入力して、変換ミックスをフロー チャネルに配信します。次に、フレーム時間あたり0.5〜2秒の解像度で最大2時間データを記録します。Cy3 ANTI-FLAG結合イベントを解析するために、選択したCy3アルファフラグスポットの蛍光強度を動画全体のフレームごとに計算し、強度軌道を形成するために接続しました。生の軌道はノイズが多く見える場合があり、バックグラウンドノイズを減らすために非線形の前方/後方フィルターによる微調整が必要になる場合があります。歩数検出アルゴリズムを使用して軌道をデジタル化することで、さらなる改良を行うことができます。新生ポリペプチドへの抗体の結合は蛍光の瞬間的な増加を引き起こしますが、抗体ポリペプチドの解離は瞬間的な蛍光の減少を引き起こします。ルシフェラーゼフラグmRNAの滞留時間ヒストグラムは、対数正規分布に適合し、ペプチド合成速度は1秒あたり2.5±0.1アミノ酸です。最初の到着時間ヒストグラムは、シフトされた対数正規関数に適合しており、単一のmRNA翻訳活性における高い不均一性を示しています。ヒストグラムが示すように、単一のルシフェラーゼフラグmRNA分子に対する最初のペプチド合成イベントは、翻訳ミックス送達後2分から20分後に開始できます。ルシフェラーゼフラグmRNAによる翻訳と比較して、ヘアピンルシフェラーゼフラグmRNA翻訳による初回到着時間ヒストグラムでは、抗体の結合が遅いことが示されました。しかし、これらの同じmRNAを用いた無細胞翻訳反応からのバルク発光測定を使用しても、翻訳速度の違いは解決されません。このアッセイの単一分子分解能は、他のアプローチでは容易に達成できないキャップ依存性翻訳のより速度論的な洞察を提供します。真核生物の無細胞翻訳は、小さな変動や実験条件に敏感です。したがって、このアッセイを使用して翻訳の小さな違いを正確に検出する際には、細部への注意と一貫性が重要です。

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生物化学

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています...

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。...

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本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング...

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

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インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

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単一の卵母細胞レポーターアッセイを用いたインビトロ成熟時の母体母体翻訳プログラムの定義

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

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キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

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