Name: オーストラリアシンクロトロンにおける逐次結晶学測定用リピニコ注入プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶ 高粘性インジェクターLipidicoを用いた逐次結晶学サンプル調製法。ガラスシリンジでタンパク質結晶を調製し、オーストラリアシンクロトロンでデータ収集を効率化し、サンプル廃棄を最小限に抑える手法です。

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この研究は、オーストラリア研究評議会先端分子イメージング優秀センター(CE140100011)(http://www.imagingcoe.org/)によって支援されました。この研究は、ANSTOの一部であるオーストラリアのシンクロトロンでMX2ビームラインを使用して部分的に行われ、オーストラリア癌研究財団(ACRF)検出器を利用しました。

ガラス注射器を用いた高粘性媒体中の結晶の調製
<ol><li>結晶液を静かに遠心分離し(〜1,000xg、22°Cで〜10分)軟質結晶ペレットを形成し、余分な緩衝液を除去する。 これにより、ペレット中の結晶が高濃度になり、データ収集に使用できます。 注:粘性媒体の希釈を防止するために、このステップで結晶濃度を増加させます。各サンプルの結晶体積に対する粘性媒体の比率を最適化し、高い濃度の結晶を得ながら、メディアの高粘度を維持します。遠心分離液は、ペレットを形成し、過剰な緩衝液を除去して溶液中の結晶濃度を増加させる、ダルマニンetに記載されている。al.29.</li>
	<li>カプラーで2つの100 μLのシリンジをセットします。</li>
	<li>最初のスポイトの端までカプラーを締め、28 μLの水晶溶液をシリンジの上部に加えます。ゆっくりと、プランジャーをシリンジの上部に挿入し、溶液をカプラーチップの端まで静かに押し下げ、形成する気泡を取り除きます。この操作を行うには、以下に説明する 2 つの方法のいずれかを実行します。 注: 高粘性媒体に添加される結晶の体積は、サンプル全体の粘度を大きく変えない場合に変化させることができます。<ol>
<li>最初の方法:気泡を破裂させるために急速な圧力変化を使用する。<ol>
<li>慎重に鈍いカプラー針ポイントの上に1つの手袋をした指を置き、(非常に穏やかに)シールを作成するために圧力を加えます。これは、針刺しの損傷につながる可能性があるため、あまりにも多くの圧力を適用しないでください.</li>
			<li>今、針のポイントから離れて溶液を引き出すためにプランジャーを引き戻し、これは注射器の圧力の蓄積を生成します。</li>
			<li>鈍い針先から手袋をした指を取り除くことによって、注射器の上部の圧力を素早く解放します。注意してください, 指を取り除いたときにサンプルが先端に近すぎる場合は、サンプルの損失につながる噴霧可能性があります..シリンジ内の圧力の急激な変化は気泡を破裂させる。すべての泡が削除されるまで繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>第二の方法:気泡を除去するために「人間の遠心分離機」を使用します。<ol>
<li>注射器を片手に置き、針を上向きにし、プランジャーを2本の指の間にくさび付けして動かないようにします。</li>
			<li>注射器を持つ腕を素早く1方向に2~3回回転させると、サンプル上の遠心力によって、シリンジから気泡が出ます。あまりにもゆっくりと行った場合、サンプルが失われる可能性がありますので、注意してください。</li>
			<li>気泡が残っている場合は、すべての気泡が取り除かれるまで、ステップ1.3.2.1 - 1.3.2.2を繰り返して、気泡のシリンジを検査します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>細かいスパチュラを使用して、2番目のシリンジの上部に直接高真空シリコーングリースの〜42 μLを追加します。プランジャーを最後まで押し下げ、すべての気泡を取り除き、シリンジの端にエアギャップがないことを確認します。 注: シリコーングリースの精密な組成は不活性キャリアとして機能しているので重要ではありません。%gt;10 Pa.sの粘度値または約60:40シリコーングリースと結晶溶液の比は、注入に最適であるが、これはサンプルの正確な特性に応じて変化する可能性がある。シリコーングリースに添加する水溶液の体積を調整し、混合物中の結晶濃度を最適化します。シリコーングリース以外の高粘性メディアは、サンプル30、31、32、33と互換性がある限り使用できます。</li>
	<li>2つのシリンジのいずれにも気泡がないことを確認し、カプラーを使用して注射器を一緒に取り付けます。指から発生する熱のためにシリンジを温めることでサンプルに影響を与える可能性があるため、注射器の端部を握って注射器を垂直に保持します。</li>
	<li>シリコングリースに混ぜ合わせるようにクリスタル溶液側のプランジャーを軽く押してサンプルを混ぜ合わせ、シリコングリース側のプランジャーを押し込み、サンプルをクリスタル溶液側に押し戻します。このプロセスを 50 ~ 100 回繰り返して、サンプルを完全に混合し、均質に見えます。 注:結晶が高粘性媒体(例えば、脂質立方相、LCP)で直接成長する場合、ステップ1.1~1.6は必要ありません。注射器内の結晶を成長させるプロトコルは、劉 et.al で見つけることができます。34、35。このプロトコルに従って、サンプルの統合、ステップ10、すべてのサンプルが1つのシリンジに含まれ、結晶化バッファーが除去されます。このプロトコルでは、7.9MAG の追加は必要ありません。代わりに、注射器に液体が残らなくなるまで、サンプル中のプランジャーを静かに押し下げて、注射器から余分な液体をすべて取り除きます。</li>
	<li>シリンジを通して光学顕微鏡の下で結晶を視覚化するか、最良の結果を得るために、ガラススライドに少量(〜1μL)を抽出し、上部にカバースリップを置きます。</li>
	<li>結晶濃度を確認してください。<ol>
<li>光学顕微鏡画像を用いて特定の領域の結晶数を数えて、シリコーングリース中の結晶濃度を決定します。最良の結果を得るために、高い結晶ヒット率を得るためには、メディア全体に均一に分配される結晶の高密度(>106 の結晶/mL)が理想的です。</li>
		<li>ステップ1.3および1.4で粘性媒体に対する結晶の比率を変更することによって、シリンジの結晶濃度を調整します。<ol>
<li>結晶濃度を下げるには、ステップ1.4でシリコーングリース/HV培地の量を増やすことによって、またはステップ1.1でシリンジを設定する前に結晶ペレットを結晶化緩衝液で溶液中に希釈することによって、シリンジ中の結晶を希釈する。</li>
			<li>結晶濃度を上げるには、ステップ1.4でシリコーングリースの量を減らしますが、10Pa.s以下の粘度を下げないように注意してください。 注:ここで報告された結晶濃度は、この特定のサンプルと結晶サイズに最適化されました。しかし、理想的な結晶濃度は、結晶サイズ、ビームサイズ、針内径(I.D.)、および入射X線フラックスに依存します。これは、最適ヒット率が「良い」と見なされる30%の最適ヒット率から決定できます。実際には、望ましいヒット率を得るためにビーム時間の間に異なるサンプルのために結晶の濃度を最適化する必要があります。高濃度の結晶、109 結晶/mLから始めます。結晶濃度を調整する手順は、劉 et.al で与えられています。35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>インジェクタがデータ収集の準備ができるまで、プロトコルはここで一時停止できます。<ol>
<li>結晶がLCPで成長している場合は、それらを密封し、室温で数日間注射器に残るようにします。</li>
			<li>結晶が異なる高粘性媒体(例えば、シリコーングリース)に移された場合、測定の前に、時間の経過に応じ結晶の安定性試験を行う必要があります。これは、不活性メディア内の結晶が安定している時間(理想的には>8時間)とデータ収集の時間制限を決定します。ここで、リゾチームの結晶はシリコーングリース中で何日も安定しており、光学顕微鏡で検査した場合には溶解の兆候を示さなかった。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>カプラーを取り外す前に、すべてのサンプルを 1 つのシリンジに移動します。カプラーを注射器から外し、注射針を取り付けます。針をシリンジのベースにしっかりとねじ込み、漏れを防ぐためにしっかりと固定されていることを確認します。この実験には108μmのI.D.針(針長13mm、ポイントスタイル3)を用いた。結晶サイズとビームサイズに応じて、51 μmまたは108 μmのI.D.ニードルを取り付けます。 注:ビーム時間の前にサンプルストリームの事前テストは、正しいインジェクタの針のサイズを選択することができるようにする必要があります。サンプル特性(すなわち、粘度、充電、緩衝剤組成物)および針I.D.に応じて、サンプルは異なる流れになる。したがって、データ収集中の信号対雑音比を最大化するために、可能な限り最小のI.D.針で最も安定した流れを作り出すために、さまざまな針サイズをテストすることをお勧めします。</li>
	<li>インジェクタが既に取り付けられ、ビームラインに位置合わせされている場合は、セクション3に移動し、サンプルシリンジを直接インジェクタに取り付ける。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>2. インジェクターの取り付けと制御
<ol><li>インジェクターをビームラインに取り付ける。MX2ビームラインの極低温ノズルを取り外し、インジェクタに交換します。極低温ノズルを保持するクランプねじを緩め、電動ステージの隣にあるブラケットに取り付けます。</li>
	<li>黒いハンドルを持ってトロリーからインジェクタを持ち上げ、電動ステージに置きます。<ol>
<li>電動ステージにインジェクタを締める。黒いクランプスクリューノブを手で締めます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>空の注射器をインジェクターに取り付ける<ol>
<li>インジェクタ コンピュータコントロール インターフェイス (EPOS 位置制御ソフトウェア) で、ソフトウェア メニューの[ツール]の [ホーミング モード] を選択します。次に、[負の限界スイッチ]を選択し、[ホーミングを開始]を選択して、ネジがネジの下に収まるように十分にネジが引き込まれるまでソフトウェアを実行します。教師なし実行する場合、リミットスイッチは自動的にねじを停止します。</li>
		<li>空の(ダミーの)注射器を注射器に取り付け、注射器ホルダーのスリットに針を挿入します。シリンジをブラケットに合わせて並ぶ。</li>
		<li>2つのOリングで注射器を締め付け。<ol>
<li>最初のOリングをシリンジの中間部に巻き付け、シリンジの両側のフックに取り付けます。</li>
			<li>2 番目の O リングをシリンジの上部のフックの周りにループし、デモンストレーションと図 1Bに示すように、O リングの一部をガラスのスポイトの上に置きます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>X線ビームにインジェクタを合わせる<ol>
<li>ビームライン制御ソフトウェアを使用して、インジェクタを使用してX線相互作用点に向かって電動ステージを移動します。インラインカメラを使用して視覚化できます。ビームのサイズと位置は、画面上の赤い十字で示され、電動ステージは、X線相互作用領域に針を整列させるために移動することができます。</li>
		<li>ステージの x と y の位置を調整して、針を赤い十字に合わせます。</li>
		<li>針先が焦点になるまで z 位置を調整します。</li>
		<li>針先とX線ビームの位置合わせを、ギリンジ先端がビームラインカメラで生成された光学顕微鏡画像に見える十字線と合致していることを確認して確認します。</li>
		<li>針先が揃ったら、十字の上に先端を動かします。これにより、針先からX線散乱を除去します。 注:シンクロトロンでMX2ビームライン上のインジェクターの取り付けと位置合わせは、ビームラインの科学者によって行われ、30分以内に完了することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. サンプルシリンジの取り付け
<ol><li>ステップ 2.3 に従って、空のシリンジをサンプルシリンジに置き換えます。</li>
	<li>サンプルシリンジプランジャーヘッドにインジェクターキャップを置きます。</li>
	<li>ドライブねじをキャップの上部に移動します。</li>
	<li>インジェクタ制御ソフトウェアで [ベロシティ モード] を選択します。</li>
	<li>設定値として3000 rpm(〜115 nL/s)を入力し、設定値を適用を押します。</li>
	<li>ドライブねじがシリンジプランジャヘッドのキャップに触れたら、モーターを止めます。<ol>
<li>ねじがキャップに近づくと 、設定値 を「0」に変更して、インジェクタ制御ソフトウェアでrpm値をゼロに設定します。</li>
		<li>接触が行われたら、設定値を 適用 を押してプリセット値を有効にして、すぐにねじを停止します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>キャップを軽くく振り回して、しっかりと所定の位置に固定されていることを確認します。 メモ:コントロールソフトウェアの [設定値 ]ボックスに新しい設定値が入力されると、 設定値の適用を押した後にのみ有効になります。</li>
</ol>4. インジェクタの実行
<ol><li>キャップドライブのネジがプランジャの上部にしっかりと接触した後、rpm 設定値 を100に変更します。これは~4 nL/sに相当します。</li>
	<li>サンプルが最初に出てきたときに針先を視覚的に検査するか、針のビームラインカメラ画像を見て、サンプルが針先から押し出し始めるときに観察します。</li>
	<li>小屋の捜索を行い、小屋のドアを閉め、X線ビームをオンにします。この時点から、インジェクターは小屋の外から遠隔操作されなければならない。</li>
	<li>安定したストリームが生成されるまで、rpm を調整します。<ol>
<li>rpm 設定値 を90に下げます。</li>
		<li>ステップ 4.4.1 を繰り返し、rpm 設定値 を 10 ずつ減らすと、ストリームは遅くなりますが、安定したストリームを維持します。シリコーングリースの場合は30rpmの値が使用された。 注:典型的なrpmの範囲はサンプルの特徴およびX線の露出時間によって30-100のrpm(1- 4 nL/s)間で変わる。一般に、rpmは安定した流れを維持しながら(サンプル消費を最小にする)最も遅い流量を作り出すために調整されるべきである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フローがうまくないサンプル ストリームを管理する。<ol>
<li>ストリームがまっすぐになるまで、rpm 設定値 を10ずつ増やし続けます。ストリームが安定しない場合は、rpm 設定値 を最大値の100rpmに大きくした後でも、下記の2つの方法のいずれかを実施して安定性を向上させようと試みる。<ol>
<li>最初の方法:サンプルストリームの下にポリスチレンサンプルキャッチャーを挿入して、サンプルを導きます。この方法は、高い料金のサンプル ストリームに適しています。</li>
			<li>2番目の方法:ベンチュリ吸引漏斗をサンプルキャッチャーに挿入します。漏斗に空気を供給するには、小屋にある空気出口管に接続する。この方法は、ストリームの電荷とは無関係にサンプルフローを導き、安定化する際に役立つ。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>一定の安定した流れが得られたら、データ収集を開始し、通常のX線結晶学実験に従って検出器距離を最適化します。 注: rpm は、補足情報「Lipidico デバイス電卓」の提供された変換テーブルを使用して流量に変換されます。この計算機を使用して流量を計算するには、rpm値、針の直径、シリンジのボリュームを入力します。</li>
</ol>

<ol><li>Boutet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+protein+structure+determination+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography.</a> Science. 337 (6092), 362-364 (2012).</li>
<li>Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+lasers+for+structural+and+dynamic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">X-ray lasers for structural and dynamic biology.</a> Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601(2012).</li>
<li>Aquila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+protein+nanocrystallography+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser.</a> Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).</li>
<li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+the+first+five+years%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nylon+mesh-based+sample+holder+for+fixed-target+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 9, 6971(2019).</li>
<li>Martin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+X-ray+diffraction+reveals+three-dimensional+nanostructure+and+disorder+in+self-assembled+lipid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Materials%22%5BJournal%5D)">Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases.</a> Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+fixed-target+serial+virus+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed fixed-target serial virus crystallography.</a> Nature Methods. 14 (8), 805(2017).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nature Communications. 5, 3309(2014).</li>
<li>Weierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li>
<li>Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+delivery+media+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample delivery media for serial crystallography.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094(2019).</li>
<li>Batyuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+phasing+of+x-ray+free-electron+laser+data+for+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor.</a> Science Advances. 2 (9), 1600292(2016).</li>
<li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+intermediates+of+Kok%27s+photosynthetic+water+oxidation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock.</a> Nature. 563 (7731), 421(2018).</li>
<li>Suga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxyl%2Foxo+mechanism+for+oxygen-oxygen+coupling+in+PSII+revealed+by+an+x-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser.</a> Science. 366 (6463), 334-338 (2019).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Pande, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+structural+dynamics+drives+the+trans%2Fcis+isomerization+in+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein.</a> Science. 352 (6286), 725-729 (2016).</li>
<li>Ishigami, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot+of+an+oxygen+intermediate+in+the+catalytic+reaction+of+cytochrome+c+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).</li>
<li>Nango, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+movie+of+structural+changes+in+bacteriorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin.</a> Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+isomerization+in+bacteriorhodopsin+captured+by+a+femtosecond+x-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser.</a> Science. 361 (6398), (2018).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+millisecond+crystallography+of+membrane+and+soluble+protein+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).</li>
<li>Berntsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+millisecond+crystallography+instrument+at+the+Australian+Synchrotron+incorporating+the+%22Lipidico%22+injector%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector.</a> Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110(2019).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).</li>
<li>DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDePonte%2C+DP+%22Advances+in+X-Ray+Free-Electron+Lasers%3A+Radiation+Schemes%2C+X-Ray+Optics%2C+and+Instrumentation%3A+Proceedings+of+Society+of+Photo-Optical+Instrumentation+Engineers%22">Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers</a>. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078(2011).</li>
<li>Park, S. Y., Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+delivery+using+viscous+media%2C+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li>
<li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li>
<li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li>
<li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345(2016).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484(2016).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463(2016).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li>
<li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science%3A+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li>
</ol>

MKは、Kuselのデザインのために働く。カスタムラボデバイス開発者のKusel Designは、ラ・トローブ大学のピーター・ベントセン博士とANSTOのトム・カラドック・デイヴィス博士と協力し、オーストラリアのシンクロトロンのMX2ビームラインで高粘性研究を可能にする低コストデバイスを開発しました。この装置は、カラドック・デイヴィス博士と綿密に協議して開発されました。著者は競合する財政的利益を持っていません。

シンクロトロン源でSX実験を行うのに理想的な代替HVIが開発されました。既存の HVI に対して 2 つの重要な利点があります。まず、従来の結晶学とSXの間で迅速な切り替えを可能にするビームラインに設置することが容易であり、MX2の設置とアライメントには30分程度必要です。第二に、結晶を成長させるために使用されるサンプルシリンジは、直接注入のための貯蔵所として使用することができ、サンプル移動中の浪費を制限する。サンプルを変更するためのプロトコルが説明され、実証されています。この設計により、他のHVIと比較してジェットを制御するための複雑なガス流が不要になります。インジェクタの流量を変化させる簡単なプロセスが実証され、遅延応答なしで調整できる。
SXデータ収集を成功させるための最も重要なステップは、結晶濃度を最適化し、高粘性媒体の均質な混合物を得て、データ収集のための安定したストリームを生成することです。最適な結晶濃度と均質性は、ペレットに結晶を遠ざけ、より高濃度の結晶をキャリアメディアに添加することで達成でき、サンプルがカプラー系に十分に混合されることを保証します。結晶濃度が最適化...

シリアル結晶学(SX)は、X線自由電子レーザー(XFELs)1、2、3、4の文脈で最初に開発された技術です。固定ターゲットアプローチはSX5、6、7に使用できますが、通常、インジェクターシステムはX線ビームに連続した流れの結晶を送達するために使用されます。SXは多数の結晶からのデータを組み合わせることから、実験中に結晶のアライメントを必要としないため、室温8,9でデータを収集できます。適切なインジェクターの助けを借りて、結晶はX線相互作用領域に一つずつ流され、得られた回折データは領域検出器9、10上で収集される。現在までに、SXは、従来の結晶学を用いて測定するには小さすぎる結晶を含む多くのタンパク質構造1、11、12、13の解法に成功しています。また、XFELのフェムト秒パルス持続時間を利用することで、時間分解分子動力学に関する新たな洞察を提供しました。光レーザー光源を用いてポンププローブ反応を起こして、光システムII14,15,光活性黄色タンパク質16,17,シトクロムCオキシダーゼ18,ならびにバクテリオロドプシン19,20,21に関する詳細な研究が行われている。これらの研究は、時間分解された生物学的プロセスを理解するための連続結晶学の有意な可能性を示す光活性化後に起こる電子移動ダイナミクスを調査した。
シンクロトロン源9,12,20,23,24では逐次結晶学の開発も普及しつつある。シンクロトロンベースのSXにより、適切なインジェクターシステムを使用して、多数の個々の結晶を室温で効率的に測定することができます。このアプローチは、それゆえ、より小さい結晶に適しており、データを収集するために高速なフレームレート検出器を必要とすることに加えて、マイクロ焦点を当てたビームも必要とされる。従来の結晶学と比較して、SXはX線ビーム中の個々の結晶の取り付けおよび位置合わせを伴わない。多数の個々の結晶からのデータがマージされるため、各結晶によって受け取られる放射線量は、従来の結晶学に比べて大幅に低減することができる。シンクロトロンSXはまた、ミリ秒のレジームまで、十分に高いフレームレートを有する検出器を提供する時間分解反応の研究に適用することができる(例えば、100Hz以上)。XFELソース20,22,23で最初に開発されたインジェクターを用いてシンクロトロンでいくつかの連続結晶学実験が行われている。インジェクタの 2 つの最も一般的なタイプは、ガスダイナミックバーチャルノズル (GDVN)25と高粘性インジェクター (HVI)9、24 、26、27、28です。GDVNは低粘度、液体サンプルを注入するのに理想的であるが、安定した流れを達成するために高い流量を必要とし、その結果、高いサンプル消費率を導く。対照的に、HVIは、はるかに低い流量で安定した流れを生成することを可能にする高粘度サンプルに適しており、サンプル消費量がはるかに低くなります。したがって、HVIインジェクタは、粘性キャリアが好ましい(例えば、膜タンパク質の脂質ベース)および/または大量のサンプルが利用できないサンプルの送達を好む。SXインジェクターは一般的に使用が困難であり、操作するために広範なトレーニングが必要です。また、サンプルを特殊な貯蔵所にロードする必要があるため、サンプル転送プロトコルは長く、これは一般的に「死んだボリューム」または接続の漏出によって失われるサンプルのリスクが高くなります。したがって、X線ビームに到達する前に、あらゆる損失を軽減するためにインジェクタ設計を最適化することが望ましい。
最近、最初のSX結果は、アイガー16M検出器を用いてリソザイム標的を有するリピディコ23を用いて発表された。このインジェクター設計は、初期結晶化からインジェクターへの結晶の伝達に移り、その後にサンプルをX線ビームに送達するステップの数を最小限に抑えることによって、サンプルの浪費を制限します。この原稿は、サンプル調製から始まり、注入プロセスに移り、そして最後に同じ結晶化容器を用いてデータ収集するサンプル移送手順を説明し、デモンストレーションする。インジェクタの動作についても説明する。

<table><tbody><tr><td>鶏卵白リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>インジェクターの試験用結晶の成長に使用され、結晶はシリコングリースに移されます。 https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>高真空シリコングリース</td><td>ダウ・コーニング</td><td>Z273554-1EA</td><td>インジェクターの試験に使用 https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>インジェクター針 (108 &micro;m ID)</td><td>ハミルトン</td><td>部品番号:7803-05</td><td>www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>ガラス気密シリンジ、100&micro;l</td><td>ハミルトン</td><td>品番:7656-01</td><td>サンプル注入に使用するシリンジ www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>LCPシリンジカプラー</td><td>Formulatrix</td><td>209526</td><td>サンプルを混合するためのシリンジカプラー</td></tr><tr><td>リピーディコインジェクター</td><td>ラ・トローブ大学/ANSTO</td><td></td>は<td>、ラ・トローブ大学/ANSTOオーストラリア・シンクロトロン施設を通じてアクセスできる特定の機器です。</td></tr></tbody></table>

オーストラリアシンクロトロンにおける逐次結晶学測定用リピニコ注入プロトコル

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

オーストラリアのシンクロトロンで、連続結晶学測定を行う施設が開発されました。高粘性インジェクターであるリピコを組み込み、高分子結晶学(MX2)ビームラインの一部として、室温で多数の小結晶を測定します。この技術の目的は、結晶を成長/ガラス注射器に移し、連続結晶学データ収集用のインジェクターで直接使用できるようにすることです。このインジェクタの利点は、流れの中断なしに流量の変化に迅速に応答する能力を含む。この高粘度インジェクター (HVI) には、許容されるサンプル粘度の制限を含むいくつかの制限があります。ストリームの安定性は、サンプルの特定のプロパティによっては問題になる可能性もあります。オーストラリアのシンクロトロンでの連続結晶学測定用のサンプルの設定方法とインジェクターの操作方法の詳細なプロトコルを紹介します。この方法は、高粘性媒体へのリソチーム結晶の転写(シリコーングリース)、MX2でのデータ収集用インジェクターの動作を含むサンプルの調製を実証する。

Lipidico は、MX2 で使用する代替配信システムとして構築された HVI です (図 1)。これは、結晶が脂質立方相で成長するか、または高粘性不活性培地に移されるSXに最適です。
インジェクター用途を実証するために、リソチーム結晶と混合したシリコーングリースを使用して、オーストラリアのシンクロトロンのMX2ビームラインでSXデータを収集した。インジェクタをMX2ビームラインに取り付けるには、 図1に示すように、極低温ノズルを取り外してインジェクタに置き換えます。注射器サンプルは、インジェクタに直接取り付けられ、Oリングを使用して留め込まれる(図1B)。データ収集は、サンプル変更後数分で開始できます。インジェクタは、SXに慣れていないユーザーのために操作しやすい簡単なセットアップで迅速なサンプル制御用に設計されています。
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このプロトコルの目的は、最近オーストラリアのシンクロトロンで委託された高粘性インジェクター、Lipidicoでデータ収集のための連続結晶学サンプルを準備する方法を実証することです。

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

このプロトコールは、高粘度材料に埋め込まれたタンパク質結晶や、既存のセットアップでは現在特性評価が困難なその他のソフトマテリアルを特徴付ける機会を科学者に提供します。この方法を使用すると、サンプルはガラスシリンジで調製され、インジェクターに直接取り付けられるため、インジェクターシステムは使いやすく、サンプルの無駄が最小限に抑えられます。高粘性媒体で結晶を調製するには、まず結晶溶液を低速で遠心分離して、柔らかい結晶ペレットを形成します。余分な媒体を取り除いた後、100マイクロリットルのガラスシリンジ1本の端にカプラーを固定し、シリンジバレルに28マイクロリットルの結晶溶液をロードします。プランジャーをシリンジの上部にゆっくりと挿入し、溶液をカプラー先端の端にそっと押し込みます。気泡を取り除くには、手袋をはめた指1本を使用して、鈍いカプラーの針先の上部に非常に穏やかな圧力を加えてシールを作成し、プランジャーを引っ込めて溶液を針先から引き離し、シリンジ内に圧力を蓄積してから、指を取り外して圧力をすばやく解放し、シリンジ内の気泡を破裂させます。または、針を上に向けて片手でシリンジを持ち、プランジャーを2本の指の間に挟み、シリンジを保持しているアームを一方向に2〜3回すばやく回転させます。結果として生じる遠心力により、シリンジから気泡が押し出されます。すべての気泡を取り除いたら、細かいヘラを使用して、42マイクロリットルの高真空シリコーングリースを2番目の100マイクロリットルシリンジの上部に直接追加し、プランジャーを最後まで押し下げて気泡を取り除き、シリンジの端にエアギャップがないことを確認します。両方のシリンジからすべての気泡が取り除かれたら、両方のシリンジの端を保持して、シリンジをカプラーに取り付けます。サンプルを混合するには、結晶溶液とシリコーングリースシリンジプランジャーの両方を、材料が完全に混合されて均一になるまで、50〜100回静かに順次押し下げます。次に、光学顕微鏡で結晶を視覚化します。シリコーングリース中の結晶濃度を決定するには、光学顕微鏡の画像を使用して特定の領域の結晶の数を数えます。結晶濃度を下げるには、シリンジをセットする前に、高量のシリコングリースを使用して結晶調製を繰り返すか、結晶ペレットを結晶化バッファーで希釈します。結晶濃度を上げるには、粘度を10パスカル秒未満に下げないように注意しながら、少量のシリコーングリースを使用して結晶調製を繰り返します。適切な結晶濃度が得られたら、サンプル全体を1つのシリンジに移し、カプラーをシリンジのベースに非常にしっかりとねじ込まれた内径108ミクロンの注射針と交換します。インジェクターを設定するには、ツールとホーミングモードとネガティブリミットスイッチを選択してホーミングを開始し、100マイクロリットルのシリンジがネジの下に収まるようにネジが十分に引っ込められるまでソフトウェアを実行します。空のシリンジの針をシリンジホルダーのスリットに挿入してシリンジをインジェクターに取り付け、シリンジをブラケットに並べます。シリンジの中央部に 1 つの O リングを巻き付け、シリンジの両側のフックにリングを取り付け、シリンジ上部のフックに 2 つ目の O リングを巻き付けます。2番目のOリングの一部がガラスシリンジの上に配置されていることを確認してください。サンプルシリンジを調製するには、シリンジをプライミングし、インジェクターキャップをサンプルシリンジプランジャーヘッドに置き、シリンジをインジェクターにロードします。ドライブネジをキャップの上部に動かします。インジェクター制御ソフトウェアで、速度モードを選択し、速度モードをアクティブにします。設定値を毎分3、000回転に設定し、[設定値の適用]をクリックします。ネジがシリンジプランジャーヘッドのキャップに近づいたら、設定値をゼロに変更します。接触したら、[設定値の適用]をクリックしてプリセット値をアクティブにし、ネジを即座に停止します。次に、キャップをそっと小刻みに動かして、キャップがしっかりと固定されていることを確認します。インジェクターを作動させるには、設定値を毎分100回転に変更し、チップを目視検査して、サンプルが押し出され始めるのを観察します。ハッチを閉じた後、ゆっくりとした安定した材料の流れが観察されるまで、設定値を10ずつ減らします。サンプルの流れがうまくいかない場合は、設定値を毎分10回転ずつ増やし、流れがまっすぐになるまで増やしてください。ストリームが安定しない場合は、サンプルストリームの下にポリスチレンサンプルキャッチャーを挿入して、サンプルをガイドしますampファイル。あるいは、ベンチュリ吸引漏斗をサンプルキャッチャーに挿入し、オーストラリアのシンクロトロンのハッチにあるエアアウトレットチューブに接続することもできます。ストリームの流量を決定するには、Lipidico デバイス フロー計算機を使用します。インジェクターの最適なサンプル実行速度を決定することは、ストリームの安定性にとって非常に重要です。流量が遅いと、インジェクターから押し出されるシリコーングリースが膨張し、流量が速いと流れが細くなります。粘性のあるメディアストリームのカールは定期的に観察されています。高電荷サンプルでこの問題を解決するために、ポリスチレンキャッチャーを使用して弱い静電気力を導入することができます。この分析では、シリコーングリースに懸濁した26マイクロリットルのリゾチーム結晶を含むガラスシリンジを使用しました。38分以内に十分な量のデータが収集され、リゾチーム構造中のジスルフィド結合を囲む電子密度マップを生成することができました。スライドガラス上に少量のサンプルを使用して、サンプルの結晶濃度を評価し、粘度を修正する必要があるかどうかを判断することを忘れないでください。インジェクターの汎用性により、他の高粘度材料のX線特性評価が可能になります。例えば、電池研究を用いたイオン液体構造や、乳製品を用いたコロイド材料などです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

X線自由電子レーザーおよびシンクロトロン源での連続結晶学のための脂質立方晶相における膜タンパク質微結晶の調製と送達の手順を説明します。これらのプロトコールは、可溶性タンパク質微結晶の取り込みおよび送達にも適用できるため、液体注入と比較してサンプル消費量を大幅に削減できます。...

準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達

タンパク質微結晶を用いたX線結晶解析のためのプロトコールが提示されている。精製後又はcelluloにおける微結晶-grown インビボで分析する2つの例が比較されます。...

タンパク質結晶の微結晶化および<em&gt;セルロで</em&gt;回折

肺炎球菌から炭水化物基質結合タンパク質の豊富な生化学的および構造解析を実行するための合理化されたプロトコルが表示されます。...

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

このプロトコルでは、作製し、室温での x...

シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ

ここでは、いくつかの放射光ビームラインで自動スクリーニングおよびデータ コレクションは、使用可能なオプションを使用する方法をについて説明します。科学者が、放射光に冷凍サンプルを送る回折特性を上映、データ...

完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集

シリアル フェムト秒の時間分解構造解析実験の成功は、効率的なサンプル配信に依存します。ここでは、我々 は高粘度 404 マイクロ押出しインジェクターからバクテリオロドプシン微結晶の押し出しを最適化するためにプロトコルを説明します。方法論は小説 3 ウェイ カプラー...

微結晶の時間分解フェムト秒シリアル結晶学 x 線レーザーのための高粘度押出を改善

ダイヤモンドビームラインI24でのシリアルシンクロトロン結晶学用の固定対象サンプル調製、データ収集、データ処理に関する包括的なガイドを提供します。...

ダイヤモンド光源での固定ターゲットシリアルデータ収集

ここでは、長波長高分子X線結晶構造解析実験のために、ダイヤモンド光源のビームラインI23上の真空端局への極低温サンプル調製および結晶の移送のためのプロトコルを提示する。...

ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

ここでは、EMBLグルノーブルのHTX研究所でCrystalDirect技術に基づくタンパク質から構造への自動高分子結晶学パイプラインの使用方法、迅速なリガンド-タンパク質複合体分析、大規模なフラグメントスクリーニングの方法について説明します。...

グルノーブルのEMBL HTX施設における自動結晶学パイプライン

この寄稿では、結晶オンクリスタルデバイスでタンパク質結晶化をセットアップする方法と、オンチップ結晶化プラットフォームを使用して室温で自動シリアルデータ収集を実行する方法について説明します。...

室温でのオンチップ結晶化と大規模シリアル回折

ハーウェル研究施設の結晶化施設を使用したタンパク質の結晶化のプロトコルと、その後のダイヤモンドの多用途高分子結晶構造解析in...

Harwellの結晶化施設とダイヤモンド光源Beamline VMXiを用いた結晶化とその 場 室温データ収集

学ぶ 高粘性インジェクターLipidicoを用いた逐次結晶学サンプル調製法。ガラスシリンジでタンパク質結晶を調製し、オーストラリアシンクロトロンでデータ収集を効率化し、サンプル廃棄を最小限に抑える手法です。

オーストラリアシンクロトロンにおける逐次結晶学測定用リピニコ注入プロトコル

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