オーストラリアシンクロトロンにおける逐次結晶学測定用リピニコ注入プロトコル

このプロトコールは、高粘度材料に埋め込まれたタンパク質結晶や、既存のセットアップでは現在特性評価が困難なその他のソフトマテリアルを特徴付ける機会を科学者に提供します。この方法を使用すると、サンプルはガラスシリンジで調製され、インジェクターに直接取り付けられるため、インジェクターシステムは使いやすく、サンプルの無駄が最小限に抑えられます。高粘性媒体で結晶を調製するには、まず結晶溶液を低速で遠心分離して、柔らかい結晶ペレットを形成します。

余分な媒体を取り除いた後、100マイクロリットルのガラスシリンジ1本の端にカプラーを固定し、シリンジバレルに28マイクロリットルの結晶溶液をロードします。プランジャーをシリンジの上部にゆっくりと挿入し、溶液をカプラー先端の端にそっと押し込みます。気泡を取り除くには、手袋をはめた指1本を使用して、鈍いカプラーの針先の上部に非常に穏やかな圧力を加えてシールを作成し、プランジャーを引っ込めて溶液を針先から引き離し、シリンジ内に圧力を蓄積してから、指を取り外して圧力をすばやく解放し、シリンジ内の気泡を破裂させます。

または、針を上に向けて片手でシリンジを持ち、プランジャーを2本の指の間に挟み、シリンジを保持しているアームを一方向に2〜3回すばやく回転させます。結果として生じる遠心力により、シリンジから気泡が押し出されます。すべての気泡を取り除いたら、細かいヘラを使用して、42マイクロリットルの高真空シリコーングリースを2番目の100マイクロリットルシリンジの上部に直接追加し、プランジャーを最後まで押し下げて気泡を取り除き、シリンジの端にエアギャップがないことを確認します。

両方のシリンジからすべての気泡が取り除かれたら、両方のシリンジの端を保持して、シリンジをカプラーに取り付けます。サンプルを混合するには、結晶溶液とシリコーングリースシリンジプランジャーの両方を、材料が完全に混合されて均一になるまで、50〜100回静かに順次押し下げます。次に、光学顕微鏡で結晶を視覚化します。

シリコーングリース中の結晶濃度を決定するには、光学顕微鏡の画像を使用して特定の領域の結晶の数を数えます。結晶濃度を下げるには、シリンジをセットする前に、高量のシリコングリースを使用して結晶調製を繰り返すか、結晶ペレットを結晶化バッファーで希釈します。結晶濃度を上げるには、粘度を10パスカル秒未満に下げないように注意しながら、少量のシリコーングリースを使用して結晶調製を繰り返します。

適切な結晶濃度が得られたら、サンプル全体を1つのシリンジに移し、カプラーをシリンジのベースに非常にしっかりとねじ込まれた内径108ミクロンの注射針と交換します。インジェクターを設定するには、ツールとホーミングモードとネガティブリミットスイッチを選択してホーミングを開始し、100マイクロリットルのシリンジがネジの下に収まるようにネジが十分に引っ込められるまでソフトウェアを実行します。空のシリンジの針をシリンジホルダーのスリットに挿入してシリンジをインジェクターに取り付け、シリンジをブラケットに並べます。

シリンジの中央部に 1 つの O リングを巻き付け、シリンジの両側のフックにリングを取り付け、シリンジ上部のフックに 2 つ目の O リングを巻き付けます。2番目のOリングの一部がガラスシリンジの上に配置されていることを確認してください。サンプルシリンジを調製するには、シリンジをプライミングし、インジェクターキャップをサンプルシリンジプランジャーヘッドに置き、シリンジをインジェクターにロードします。

ドライブネジをキャップの上部に動かします。インジェクター制御ソフトウェアで、速度モードを選択し、速度モードをアクティブにします。設定値を毎分3、000回転に設定し、[設定値の適用]をクリックします。

ネジがシリンジプランジャーヘッドのキャップに近づいたら、設定値をゼロに変更します。接触したら、[設定値の適用]をクリックしてプリセット値をアクティブにし、ネジを即座に停止します。次に、キャップをそっと小刻みに動かして、キャップがしっかりと固定されていることを確認します。

インジェクターを作動させるには、設定値を毎分100回転に変更し、チップを目視検査して、サンプルが押し出され始めるのを観察します。ハッチを閉じた後、ゆっくりとした安定した材料の流れが観察されるまで、設定値を10ずつ減らします。サンプルの流れがうまくいかない場合は、設定値を毎分10回転ずつ増やし、流れがまっすぐになるまで

ストリームが安定しない場合は、サンプルストリームの下にポリスチレンサンプルキャッチャーを挿入して、サンプルをガイドしますampファイル。あるいは、ベンチュリ吸引漏斗をサンプルキャッチャーに挿入し、オーストラリアのシンクロトロンのハッチにあるエアアウトレットチューブに接続することもできます。ストリームの流量を決定するには、Lipidico デバイス フロー計算機を使用します。

インジェクターの最適なサンプル実行速度を決定することは、ストリームの安定性にとって非常に重要です。流量が遅いと、インジェクターから押し出されるシリコーングリースが膨張し、流量が速いと流れが細くなります。粘性のあるメディアストリームのカールは定期的に観察されています。

高電荷サンプルでこの問題を解決するために、ポリスチレンキャッチャーを使用して弱い静電気力を導入することができます。この分析では、シリコーングリースに懸濁した26マイクロリットルのリゾチーム結晶を含むガラスシリンジを使用しました。38分以内に十分な量のデータが収集され、リゾチーム構造中のジスルフィド結合を囲む電子密度マップを生成することができました。

スライドガラス上に少量のサンプルを使用して、サンプルの結晶濃度を評価し、粘度を修正する必要があるかどうかを判断することを忘れないでください。インジェクターの汎用性により、他の高粘度材料のX線特性評価が可能になります。例えば、電池研究を用いたイオン液体構造や、乳製品を用いたコロイド材料などです。