エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略
August 29th, 2020
ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。
このビデオで初めて紹介されたプロトコルは、化学的なエピジェネティックな消去と生体力学的手がかりを組み合わせて、成体の末期分化細胞に多能性を誘導し維持するものです。このプロトコルの主な強みは、トランスジェニックベクターやウイルスベクターを必要としないことです。さらに、堅牢で再現性が高く、柔軟性があります。
この技術は遺伝子トランスフェクションを使用する必要がないため、トランスレーショナルメディシンと細胞療法の顕著な技術的進歩であり、高可塑性細胞の長期培養をサポートします。この手順を実演するのは、私の研究室の助教授であるGeorgia Pennarossaと博士課程の学生であるTeresina De Iorioです。まず、新鮮な1ミリモルの5-aza-CRストック溶液を調製します。
2.44ミリグラムの5-aza-CRを秤量し、高グルコースで10ミリリットルのDMEMに溶解します。ボルテックスにより粉末を再懸濁し、0.22μmのフィルターで溶液を滅菌します。5-aza-CRワーキング溶液を調製するには、1マイクロリットルのストック溶液を1ミリリットルの線維芽細胞培養液に希釈します。
テキスト原稿に記載されているように細胞をトリプシン化し、穏やかなピペッティングで細胞を取り除きます。次に、細胞懸濁液を回収し、円錐形のチューブに移します。光学顕微鏡下の計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。
細胞懸濁液をGの150倍で5分間遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットを再懸濁して、1マイクロモルの5-aza-CRを添加した30マイクロリットルの線維芽細胞培養培地に40, 000個の細胞を取得します。35mmのペトリ皿にPTFE粉末を充填してベッドを作り、30マイクロリットルの細胞を粉末ベッドに分注します。
ペトリ皿を円を描くようにゆっくりと回転させ、PTFE粉末が液滴の表面を完全に覆い、液体大理石のマイクロバイオリアクターを形成するようにします。大理石の直径に合わせてカットされた1000マイクロリットルのピペットチップを使用して、液体大理石マイクロバイオリアクターを手に取ります。マイクロバイオリアクターを清潔な細菌学のペトリ皿にプレートして、安定させます。
次に、マイクロバイオリアクターをペトリ皿から96ウェルプレートに移します。ウェルの縁から100マイクロリットルのメディアをゆっくりと加えます。マイクロバイオリアクターは、培地の上に浮かぶ必要があります。
液体大理石マイクロバイオリアクターを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で18時間インキュベートします。インキュベーション後、1000マイクロリットルのピペットチップを使用して液体大理石マイクロバイオリアクターを回収し、新しい35ミリメートル細菌学ペトリ皿に入れます。針を使って液体大理石に穴を開け、壊します。
形成されたスフェロイドを、実体顕微鏡で端部を切断した200マイクロリットルのピペットチップで回収します。5-aza-CRの残留物を洗い流すには、オルガノイドをESC培地を含むシャーレに移します。PTFE粉末床を含む新しい35mmシャーレを準備し、200マイクロリットルのカットピペットチップを使用して、30マイクロリットルのESC培養培地液の液滴中の単一のオルガノイドを粉末に分注します。
ディッシュを円を描くようにゆっくりと回転させて、新しい液体大理石マイクロバイオリアクターを形成し、96ウェルプレートのウェルに移します。ウェルの縁から100マイクロリットルのメディアを追加して、大理石をゆっくりと浸します。液体大理石のマイクロバイオリアクターを摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。
形態学的解析によると、脱メチル化剤5-aza-CRと18時間インキュベートした後、PTFEマイクロバイオリアクターにカプセル化された3種の哺乳類由来の線維芽細胞が凝集し、均一なサイズ形状の3D球状構造を形成しました。3D条件下では、カプセル化された細胞の86.31%が表現型を著しく変更しました。対照的に、2D標準条件で培養されたポスト5-aza-CR細胞は、粒状核を持ち、単層分布を保持したサイズがかなり小さくなりました。
形態学的変化は、3Dおよび2Dのポスト5-aza-CR細胞の両方で、多能性関連遺伝子発現の開始を伴いました。転写は、未処理の線維芽細胞には存在しないPOUクラス5ホメオボックス1、NANOGホメオボックス、ZFP42ジンクフィンガータンパク質、および性決定領域Ybox2で観察されました。10-11転座2上皮細胞接着分子とカドヘリン1遺伝子の有意なアップレギュレーションも、2D標準プラスチック皿で培養された細胞と比較して、3Dポスト5-aza-CR細胞で観察されました。
並行して、線維芽細胞特異的マーカーであるThy1細胞表面抗原のダウンレギュレーションが、3Dおよび2Dのpost-5-aza-CR細胞の両方で検出されました。ELISAでは、3Dおよび2Dのポスト5-aza-CR細胞の両方でメチル化レベルの有意な低下が確認されました。DNAメチル化レベルは、2D条件で培養された細胞と比較して、3Dポスト5-aza-CR細胞で有意に低かった。
さらに、3Dポスト5-aza-CR細胞は、獲得した3D球状構造、多能性関連遺伝子の高発現レベル、および低いDNAメチル化レベルを28日間保持し、その時点で培養が停止しました。マイクロバイオリアクターは、前駆細胞培養に最適な条件を維持したり、最終分化効率を高めたりするためにも使用できます。
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概要
この研究は、化学的エピジェネティック消去と生体力学的キューを相乗的に組み合わせて、成人の終末分化細胞に多能性を誘導する新しい方法を紹介します。この手法は遺伝子導入やウイルスベクターを必要とせず、翻訳医学と幹細胞療法にとって重要な進歩となっています。
研究の主要な構成要素
研究分野
- 幹細胞生物学
- 多能性誘導
- 翻訳医学
背景
- 多能性を誘導する現在の方法は、制限のあるウイルスベクターに依存していることが多い。
- 遺伝子修飾なしで多能性細胞を生成する能力は画期的です。
- 細胞リプログラミングの理解は再生医療の進歩にとって重要です。
使用した方法
- 化学的エピジェネティック消去と生体力学的刺激の組み合わせ
- 出発生物学的システムとして線維芽細胞の使用
- 細胞培養用の液体マーブルマイクロバイオリアクターの開発
主な結果
- 3D条件下で分化した線維芽細胞から多能性細胞を成功裏に生成しました。
- 多能性に関連する遺伝子の発現と顕著な形態学的変化が観察されました。
- この方法は時間とともに堅牢で再現可能な結果を示し、28日以上にわたって細胞の特性を維持しました。
結論
- この研究は、多能性細胞を生成するための効果的でウイルスフリーの方法を示しています。
- この結果は、幹細胞技術とその細胞療法への応用可能性に関する知識を深めています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This two-step strategy integrates chemical epigenetic erasing with biomechanical cues to induce and maintain pluripotency in adult mammalian cells, eliminating the need for gene transfection or viral vectors. The approach enhances predictive confidence in cell reprogramming and supports robust, reproducible generation of high-plasticity cells for early discovery and translational research. Its flexibility and reproducibility position it as a reusable capability for stem cell and organoid technology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell fate mechanisms through controlled epigenetic modification.
- Supports functional validation of pluripotency induction without genetic manipulation.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating chemical and biomechanical contributions to cell plasticity.
- Improves predictive confidence in reprogramming outcomes across mammalian species.
Screening & Assay Development
- Prepares validated high-plasticity cell systems for downstream screening workflows.
- Standardizes 3D culture conditions using PTFE micro-bioreactors for reproducible outputs.
- Enables quantitative assessment of pluripotency markers and DNA methylation status.
- Supports scalable and robust assay development for compound evaluation in reprogrammed cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by maintaining pluripotency-related gene expression over extended culture periods.
- Provides continuity from discovery-stage reprogramming to preclinical validation of cell therapies.
- Reduces biological risk by avoiding viral vectors and gene transfection in cell manufacturing.
- Enables long-term maintenance and differentiation studies in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery to preclinical continuum, supporting both hypothesis-driven reprogramming and scalable cell system preparation for advanced research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on epigenetic and biomechanical determinants of cell fate.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for pluripotency and methylation status.
- Analytics: Enables comparative analysis of gene expression and morphological changes across conditions.
- Translational Research: Maintains high-plasticity cells for extended periods, supporting preclinical modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, non-genetic platform adaptable to multiple mammalian systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell reprogramming.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for pluripotent cell generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in cell therapy pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of reprogramming strategies and cell-based models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetic modulation and 3D cell culture techniques.
- Needs access to PTFE micro-bioreactor materials and quantitative gene expression analysis tools.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in pluripotency assessment.
- Adaptable across mammalian species but may require optimization for specific cell types.
- Limitations include the need for careful handling of micro-bioreactors and monitoring of long-term culture stability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Fibroblast Exposure to 5-aza-CR
2:28
Fibroblast Encapsulation in PTFE Micro-Bioreactors
4:05
Culture in PTFE Micro-Bioreactors of Epigenetically Erased Cells
5:00
Results: Epigenetically Erased Cells Encapsulated in PTFE Micro-Bioreactors Show High Level and Long-term Maintenance of Pluripotency-Related Gene Expression
7:33
Conclusion
