Name: エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学ぶ 化学的エピジェネティック消去と生体力学的刺激を組み合わせた新規プロトコルにより、哺乳類の終末分化細胞から多能性細胞を誘導・維持する手法。ウイルスベクター不要で再現性が高く、再生医療への応用が期待される。

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この研究は、Carraresi FoundationとMiND FoodS Hub ID:1176436から資金提供を受けました。著者らは全員、COST Action CA16119 In vitro 3-D Total cell guidance and fit(CellFit)のメンバーである。

すべての研究は、ミラノ大学の倫理委員会によってレビューされ、承認されました。すべての動物実験は、米国国立衛生研究所(NIH)が発行した実験動物のケアと使用のためのガイドに従って実施されました。健康な成人からのヒト細胞単離は、ミラノのマッジョーレ・ポリクリニコの倫理委員会によって承認された。我々の研究におけるすべての方法は、承認されたガイドラインに従って実施された。
1. 皮膚線維芽細胞の単離
注:以下に記載するすべての手順は、マウス、ブタ、およびヒトを含む異なる哺乳動物種から単離された線維芽細胞に適用することができる。7週齢の雄マウスからマウス細胞を単離し、ブタ皮膚組織を地元の屠殺場で採取した。ヒト細胞は、書面によるインフォームドコンセントの後、成人患者から単離した。
<ol><li>1%ブタゼラチン溶液を調製する。<ol>
<li>ブタゼラチン0.1gの重さを量り、100mLの水に溶かす。ゼラチン溶液は、使用前にオートクレーブ処理で滅菌してください。</li>
		<li>調製した溶液1.5mLを加えることによって0.1%ブタゼラチンで35mmシャーレをコーティングする。室温で2時間インキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>哺乳動物(マウス、ブタ、およびヒト)の皮膚生検を長さ約2〜5cm切断し、2%抗生物質抗真菌溶液を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れる。使用時まで+ 4°Cで保存してください。 注:生検の収集は、確立されたガイドラインに従って、倫理委員会の承認を得て実施する必要があります。</li>
	<li>採取した生検を2%抗生物質抗真菌溶液を含む新鮮な滅菌PBSで3回広範囲に洗浄する。</li>
	<li>最後の洗浄から生検を収集し、滅菌された100mmのペトリ皿に入れる。滅菌メスを使用して、それらを約2mm3 サイズの断片に切断する。</li>
	<li>2時間のインキュベーションの終わりに、35mmペトリ皿から過剰のゼラチン溶液を除去し(ステップ1.1.2に記載)、滅菌手術ピンセットを使用して、直ちに5〜6個の皮膚断片を各プレコーティング培養皿に入れる。</li>
	<li>線維芽細胞分離培地(表1)の液滴をそれぞれに100μL加えて断片を湿潤させた。5%CO2 インキュベーター中で37°Cで培養する。 注:培地が蒸発するのを防ぐため、35 mmのペトリ皿を滅菌水を含む100 mm以上のペトリ皿の中に置きます。両方のペトリ皿をキャップするようにしてください。</li>
	<li>24時間培養後、35mm培養シャーレ内の培地の量を確認する。必要に応じて、500 μLの線維芽細胞分離培地を加えて断片を濡らしておく。</li>
	<li>培地を慎重に取り出し、ピペットを使用して培養の少なくとも2日ごとにそれをリフレッシュする。</li>
	<li>線維芽細胞が35mmシャーレに置かれた皮膚断片から成長し始めると(ステップ1.5に記載)、細胞単層を形成し始める(通常6日間)。滅菌外科用ピンセットを用いて皮膚片を取り出し、2mLの線維芽細胞単離培地中で培養した。</li>
	<li>細胞単層を5%CO2 インキュベーター内で37°Cで80%コンフルエントになるまで培養し続け、1日おきに培地をリフレッシュした。</li>
</ol>線維芽細胞初代細胞株培養
<ol><li>線維芽細胞が80%コンフルエントに達したら、線維芽細胞単離培地を慎重に除去し、1%抗生物質抗真菌溶液を含むPBS3mLで細胞を3回洗浄する。</li>
	<li>細胞剥離のために、培養皿に600 μLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を加え、37°Cで3〜5分間インキュベートする。</li>
	<li>5.4 mLの線維芽細胞培養培地を加え、細胞が培養皿から剥離し始めたときにトリプシンを中和した(表1)。</li>
	<li>反復的かつ穏やかなピペッティングによって細胞を脱落させる。プレート細胞を新しい培養皿(ゼラチンなし)に入れ、継代比を1:2〜1:4(増殖速度に依存する)に保つ。 注:遠心分離は必要ありません。</li>
	<li>培養中の細胞を維持し、それらが80%のコンフルエントに達するまで2日ごとに培地を交換し、それらを継代する。 注:線維芽細胞を週に2回増殖させ、活発な成長を維持します。</li>
</ol>3. 5-アザ-CRへの線維芽細胞曝露
<ol><li>新鮮な1 mM 5-アザ-CRストック溶液を調製する。<ol>
<li>2.44mgの5-アザ-CRの重量を量り、10mLのDMEM高グルコースに溶解する。渦巻きによって粉末を再懸濁させる。溶液を0.22μmフィルターで滅菌する。 注:5-aza-CRストック溶液は、使用直前に調製する必要があります。</li>
		<li>5-aza-CRストック溶液(3.1.1.1.)を1 mLの線維芽細胞培養液で1 μL希釈して5-aza-CR作業溶液を調製する。 注:5-アザ-CR作動溶液の濃度は1μM 1,2,3,8,9である。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前述のように細胞をトリプシン処理し(2.1.-2.3.)、繰り返し穏やかにピペッティングすることによって細胞を取り除きます。</li>
	<li>細胞懸濁液を収集し、円錐形のチューブに移す。</li>
	<li>室温で光学顕微鏡下の計数チャンバを用いて細胞を計数する。細胞を再懸濁するのに必要な培地の体積を計算し、1 μM 5-aza-CRを添加した30 μLの線維芽細胞培養培地中の4 x 104 細胞を得た(ステップ3.1.2参照)。 メモ: 使用する式は、チャンバーの特定のタイプによって異なります。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg">
</li>
	<li>細胞懸濁液を室温で5分間150 x g で遠心分離する。上清を除去し、ペレットを1μM 5-aza-CRを添加した線維芽細胞培養培地で再懸濁した(ステップ3.1.2参照。使用する線維芽細胞培養液の容量については、工程3.4を参照されたい。 注:ネガティブコントロールとして、5-aza-CRを含まない線維芽細胞培養培地に同じ濃度の細胞を再懸濁し、PTFE粉末への細胞封入を進める(ステップ4.1.-4.13。</li>
</ol>4. PTFEマイクロバイオリアクターにおける線維芽細胞のカプセル化
<ol><li>35mmのシャーレにポリテトラフルオロエチレン(PTFE)粉末を充填し、ベッドを製造した(図1A)。 注:液体大理石の付着を避けるために、35mmの細菌学ペトリ皿を使用してください。薄い疎水性および多孔質シェルを得るためには、平均粒径1μmのPTFE粉末を使用し、最大粉砕物2.0NPIRIで製造する。これにより、気体透過性の液体大理石の作成が可能になります。さらに、透光性コーティングは、リアルタイムでの細胞凝集プロセスの観察を容易にし、より大きな粒径は、蒸発の上昇、変形および球形の喪失、ならびにマイクロバイオリアクターの早期溶解を引き起こす可能性がある高い多分散性をもたらす。</li>
	<li>4 x 104個の細胞 を含む 30 μL の単一液滴 (ステップ 3.4.-3.5 を参照) を粉末床に分注します (図 1B)。</li>
	<li>35mmのシャーレを円運動で静かに回転させ、PFTE粉末が液体滴の表面を完全に覆うようにして、液体大理石のマイクロバイオリアクターを形成します(図1C)。</li>
	<li>1,000 μLのピペットチップを使用して液体大理石マイクロバイオリアクターを拾い上げ、エッジで切断し、大理石の直径を収容する(図1D、E)。液体大理石のマイクロバイオリアクターを清潔な細菌学ペトリ皿にプレートして安定化させます(図1F)。 メモ: 先端の内側の大理石をつかむための摩擦を引き起こすには、液体大理石の直径よりわずかに小さい直径のピペットチップを切断します。</li>
	<li>液体大理石マイクロバイオリアクターをペトリ皿から96ウェルプレート(1つの大理石/ウェル)に移します(図1G)。</li>
	<li>ウェルの縁から100μLの培地をゆっくりと加える。マイクロバイオリアクターは、培地の上に浮かび始めます(図1H)。 注:マイクロバイオリアクターは、PTFE疎水性の破壊のために、直接液体接触で壊れる。代替アプローチとして、液体大理石マイクロバイオリアクターを35mmの細菌学培養皿に個々に配置することができる。この場合、液体大理石の蒸発を防ぐために、マイクロバイオリアクターを含む35mmのシャーレを100mmのシャーレに挿入し、滅菌水で事前に割り振る必要があります。</li>
	<li>液体大理石マイクロバイオリアクターを5%CO2インキュベーター1、2、3、8、9中で37°Cで18時間インキュベートする。 注:1μmのPTFE粒径は、内部液体と周辺環境との間の最適なガス交換を保証することができる。</li>
	<li>5-aza-CRインキュベーションを18時間行った後、エッジで切断した1,000 μLのピペットチップを用いて液体大理石マイクロバイオリアクターを回収する(ステップ4.5参照)。</li>
	<li>マイクロバイオリアクターを新しい35mm細菌学ペトリ皿に入れる(図1D-F)。</li>
	<li>針を使って液体大理石を穿刺し、それを壊す。</li>
	<li>形成されたスフェロイドを200 μLのピペットチップで回収し、エッジで切断し、実体顕微鏡下で(図1I、J)。 注:PTFEに封入されたエピジェネティックに消去された細胞は、3D球状構造(各液体大理石に1つの凝集体)を形成する。</li>
	<li>5-aza-CRに応答した多能性状態の獲得を評価するために、定性PCRにより、多能性関連遺伝子発現OCT4、NANOG、REX1、およびSOX2の発症を確認する(表2)。</li>
	<li>以下で説明するように、プロトコルの 2 番目のステップに進みます。</li>
</ol>5. エピジェネティック消去細胞のPTFEマイクロバイオリアクターでの培養
<ol><li>新鮮なESC培養液を調製する(表1)。</li>
	<li>オルガノイドを、5−アザ−CR残留物を洗浄するためのESC培地を含むシャーレに移す(ステップ5.1.〜5.2を参照されたい)。</li>
	<li>PTFEパウダーベッドを含む新しい35mm細菌学ペトリ皿を準備する(ステップ4.1も参照のこと)。</li>
	<li>200 μL のピペットチップを使用して、30 μL の ESC 培養培地の液滴中の単一のオルガノイドを粉末床に分注し、端で切断します (ステップ 4.9 を参照。5.3.).</li>
	<li>35mmのシャーレを円運動で静かに回転させて新しい液体大理石マイクロバイオリアクターを形成し、1,000μLのピペットチップを使用してそれを拾い上げ、端で切断し、新しく形成されたマイクロバイオリアクターを96ウェルプレート(1つの大理石/ウェル)のウェルに入れます(ステップ4.3.-4.6を参照)。</li>
	<li>マイクロバイオリアクターを浮かべるには、ウェルの縁から100μLの培地を加えて大理石をゆっくりと浸します(注4.7参照)。</li>
	<li>培養液は大理石マイクロバイオリアクターで37°Cで、必要な限り5%CO2 インキュベーター内で培養する。5.3.-5.7で説明されている手順に従って、1日おきに培地を交換してください。 注:本原稿では、オルガノイドを28日間培養して得られた結果を提供する。ただし、必要に応じてより長い培養期間を行うことができる。</li>
</ol>

<ol><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+changes+of+human+granulosa+cells+exposed+to+5-azacytidine+and+addressed+toward+muscular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333(2015).</li>
<li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li>
<li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li>
<li>Manzoni, E. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-azacytidine+affects+TET2+and+histone+transcription+and+reshapes+morphology+of+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts.</a> Scientific Reports. 6, 37017(2016).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+reviews+and+reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li>
<li>Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+striated+muscle+cells+from+non-myoblast+precursors+following+5-azacytidine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment.</a> Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Azacytidine%2C+DNA+methylation%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li>
<li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-azacytidine+and+its+2%27-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li>
<li>Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+inhibitor+5-Aza-2%27-deoxycytidine+induces+reversible+genome-wide+DNA+damage+that+is+distinctly+influenced+by+DNA+methyltransferases+1+and+3B%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).</li>
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<li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+signaling-directed+YAP%2FTAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li>
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著者らは開示するものは何もありません。

過去数十年間、いくつかの研究は、終末分化した細胞をあまりコミットされておらず、より高い許容状態に戻すための戦略の開発に焦点を当てていました。ここに記載されるプロトコルは、成体成熟末端分化細胞から始まる多能性細胞の生成および長期維持を可能にする。この方法は、化学的エピジェネティック消去およびその後の3D培養システムを使用して保証されるその維持によって達成される高い許容状態の誘導を含む2つの独立したステップを組み合わせる。
PTFE内包細胞で観察された3Dスフェロイド構造の形成(図2)は、細胞凝集を効率的に促進するPTFEの能力を実証する他の研究と一致し、嗅覚被覆細胞(OEC)スフェロイド構造25の確立または3Dトロイダル凝集体26の形成を促進する。これらの形態学的変化は、多能性関連遺伝子発現の発症(図3、図4、図5)と平行しており、2D後5-aza-CR細胞(図3、図<s...

過去数十年間、細胞の関与と分化に向けた一方向の進行という広く受け入れられている概念は完全に改訂されました。セルの仕様を逆転させることができ、最終分化したセルを、異なる方法を使用して、あまりコミットされず、より高い許容状態にプッシュできることが実証されています。
提案されているいくつかの方法の中で、最も有望な方法の1つは、いわゆる化学的に誘導された多能性に細胞を誘導するための化合物の使用を含む。このアプローチで使用される小分子は、成体成熟細胞のエピジェネティックなシグネチャーと相互作用および修飾することができ、トランスジェニックおよび/またはウイルスベクター1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の必要性を回避することができる。.多数の研究が最近、高メチル化遺伝子の再活性化を誘導する特定の生化学的および生物学的刺激を提供することによって、細胞をある表現型から別の表現型に切り替えることが可能であることを示している11、12、13、14、15。これらの脱メチル化事象は、最終分化細胞を原始的前駆細胞、多能性または高可塑性/多能性細胞1、2、3、4、5、6、7、8、9、10に変換することを可能にする。
並行して、多くの研究は最近、機械化関連の手がかりの理解、より具体的には、機械的力を使用して細胞の可塑性および/または分化に直接影響を与える可能性に焦点を当てている16,17,18,19。実際、細胞外マトリックス(ECM)が細胞運命の制御において重要な役割を果たしていることが明確に実証されている。特に、ECMによって産生される生体力学的および生物物理学的シグナルは、分子機構およびシグナル伝達経路を直接調節し、細胞の挙動および機能に影響を及ぼす20、21。これらの最近のデータは、in vivo細胞微小環境をより厳密に模倣し、細胞挙動を駆動する機械的および物理的刺激を複製する新しい3D培養システムの開発への道を開いた。
ここでは、哺乳類の多能性細胞を生成するために、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりの使用を組み合わせた2段階のプロトコルについて説明します。第1の工程では、細胞を脱メチル化分子5−アザ−シチジン(5−アザ−CR)と共にインキュベートする。この薬剤は、直接テン-イレブン転座2(TET2)媒介作用8,10およびDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)22,23の間接阻害の併用効果を通じて、有意なグローバルDNA脱メチル化を誘導することができる。この工程は、多能性関連遺伝子発現のその後の再活性化を伴うエピジェネティックブロックの除去を誘導し、したがって、可塑性の高い細胞1、2、3、8、10、以下「エピジェネティック消去細胞」という。第2のステップでは、細胞は3D培養系に封入される。この目的のために、非反応性疎水性合成化合物ポリテトラフルオロエチレン(PTFE;粒径1μm)がマイクロバイオリアクターとして使用され、従来の2D培養システム10の使用によって達成不可能な細胞微小環境の創造を可能にする。PTFE粉末粒子は、細胞が再懸濁され、液体コアを支持表面から隔離する液体滴の表面に付着し、内部液体と周囲環境24との間のガス交換を可能にする。このようにして得られた「PTFEマイクロバイオリアクター」は、「液体大理石」とも呼ばれ、細胞同士の自由な相互作用を促し、3D細胞再構成25,26,27を促進し、バイオメカノセンシング関連の手がかり10を通じて獲得した高い可塑性状態を延長し、安定に維持する。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>ESC培地の成分</td></tr><tr><td>5-アザシチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR、線維芽細胞エピジェネティック消去用</td></tr><tr><td>アデノシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>ESC培地用ヌクレオシドミックスの成分</td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌剤溶液 (100回;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>線維芽細胞およびESC培地の成分</td></tr><tr><td>CFX96 リアルタイムPCR</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>NA</td><td>定量PCR用サーマルサイクラー</td></tr><tr><td>シチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4654</td><td>ESC培地用ヌクレオシドミックスの成分</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>41966052</td><td>線維芽細胞の単離および培養培地用</td></tr><tr><td>DMEM、低グルコース、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31885023</td><td>ESCミディアム</td></tr><tr><td>ダルベッコ用S Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>PBS; for biopsy and cell wash and solution</td></tr> preparation <tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61021</td><td>mRNA estraction</td></tr><tr><td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ESG1106</td><td>Component of ESC medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10500064</td><td>線維芽細胞およびESC培地の成分</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA10-155) 組換えヒトタンパク質</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHG0024</td><td>ESC培地の成分</td></tr><tr><td>豚皮からのゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>ディッシュコーティング用</td></tr><tr><td>GeneAmp PCRシステム 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td>NA</td><td>定性的PCR用サーマルサイクラー</td></tr><tr><td>グローバルDNAメチル化 ELISAキット</td><td>CELL BIOLABS</td><td>STA-380</td><td>メチル化研究</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA ポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M7801</td><td>定性的PCR</td></tr><tr><td>グアノシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6264</td><td>ESC用ヌクレオシドミックスの成分</td></tr><tr><td>ハムのF-10栄養ミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>31550031</td><td>ESC用ミディア</td></tr>ム <tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>10828028</td><td>ESC培地の成分</td></tr><tr><td>KOVA グリッド付きガラススライド10</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>ライカMZ APO 実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>NA</td><td>オルガノイド観察用</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>線維芽細胞およびESC培地の成分</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140035</td><td>ESCミディアムのコンポーネント</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 &micro;mポアフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGS033SB</td><td>溶液滅菌用</td></tr><tr><td>M-MLV 逆転写酵素、RNase H マイナス、点変異体</td><td>プロメガ</td><td>M3681</td><td>mRNA 逆転写</td></tr><tr><td>ムルチスカン FC マイクロプレート 光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51119000</td><td>ELISAプレート読み取り用</td></tr><tr><td>ニコンエクリプス TE300 逆位相コントラスト顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>NA</td><td>細胞用観察</td></tr><tr><td>パーキン・エルマー サーマルサイクラー 480</td><td>パーキン・エルマーNA</td><td></td><td>逆転写用サーマルサイクラー</td></tr><tr><td>ポリ(テトラフルオロエチレン) 1 &mu;m 粒径</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>430935</td><td>マイクロバイオリアクターの生成用</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K182001</td><td>ゲノムDNAエストラクション</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1728</td><td>定量PCR</td></tr><tr><td>チミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>ESC培地用ヌクレオシドミックスの成分</td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ100X20 mm、標準</td><td>Sarstedt</td><td>833902</td><td>線維芽細胞分離用</td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ35X10 mm、</td>標準<td>Sarstedt</td><td>833900</td><td>線維芽細胞分離</td></tr><tr><td>用組織培養ディッシュ35X10 mm、懸濁液</td><td>Sarstedt</td><td>833900500</td><td>Bacteriologyペトリ皿液体大理石培養</td></tr><tr><td>用組織培養プレート96ウェル、標準、F</td><td>Sarstedt</td><td>833924005</td><td>液体大理石培養用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>線維芽細胞解離</td></tr><tr><td>用 チューブ 15ml、120x17mm、PS</td><td>Sarstedt</td><td>62553041</td><td>細胞懸濁液遠心分離用</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td>ESC培地用ヌクレオシドミックスの成分</td></tr></tbody></table>

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

細胞表現型は、各技術に固有の利点および制限を有する、異なる方法で逆転または改変することができる。ここでは、哺乳類の多能性細胞を生成するために、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせた新しい戦略について説明します。主に 2 つの手順が必要です。第1のステップでは、成体成熟(末端分化)細胞をエピジェネティック消しゴム5-アザ-シチジンに曝露し、多能性状態に駆動する。プロトコルのこの部分は、細胞の運命と分化を制御するエピジェネティックなメカニズムの理解の高まりに基づいて開発され、エピジェネティック修飾剤を使用して細胞の分化状態を消去し、その後、一時的な高可塑性ウィンドウに駆動することを含む。
第2のステップでは、消去された細胞は、液体大理石としても知られるポリテトラフルオロエチレン(PTFE)マイクロバイオリアクターに封入され、3D細胞の再配列を促進し、獲得した高い可塑性を伸長および安定に維持する。PTFEは非反応性疎水性合成化合物であり、その使用は、従来の2D培養システムでは達成できない細胞微小環境の創出を可能にする。このシステムは、バイオメカノセンシング関連の手がかりを通じて多能性の維持を奨励し、促進する。
ここで説明する技術的手順は、成体体細胞における高い可塑性状態の誘導および維持を可能にするための単純な戦略である。このプロトコルは、試験したすべての哺乳動物種における可塑性の高い細胞の誘導を可能にした。遺伝子トランスフェクションの使用を伴わず、ウイルスベクターを含まないため、トランスレーショナルメディシンアプリケーションにとって顕著な技術的進歩を表す可能性があります。さらに、マイクロバイオリアクターシステムは、可塑性の高い細胞、すなわちESC、iPSC、エピジェネティックに消去された細胞およびMSCの長期培養を可能にする特定の微小環境をin vitroで再現することにより、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を提供する。

本プロトコールは、成体体細胞から哺乳動物多能性細胞を生成しかつ安定に維持するために行われるべき全てのステップを記載する。この方法は、異なる哺乳動物種、すなわちマウス、ブタおよびヒトから単離された線維芽細胞で成功している。ここで報告される代表的な結果は、起源の種のそれぞれにかかわらず、すべての細胞株から得られている。
形態学的分析は、脱メチル化剤5-aza-CRとの18時間のインキュベーション後、PTFEマイクロバイオリアクター(3D Post 5-aza-CR)に封入された線維芽細胞が凝集し、考慮された3つの種すべてにおいて、均一なサイズの幾何学的形状を示す3D球状構造を形成したことを示している。(図2A-C、3Dポスト5-アザ-CR)。86.31±封入された細胞の4.13%がそれらの表現型を著しく改変し、典型的には高い可塑性表現型に関連する特徴を示す8。対照的に、2D標準条件に培養した後の5−aza−CR細胞は、典型的な線維芽細胞細長い形状...

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

このビデオで初めて紹介されたプロトコルは、化学的なエピジェネティックな消去と生体力学的手がかりを組み合わせて、成体の末期分化細胞に多能性を誘導し維持するものです。このプロトコルの主な強みは、トランスジェニックベクターやウイルスベクターを必要としないことです。さらに、堅牢で再現性が高く、柔軟性があります。この技術は遺伝子トランスフェクションを使用する必要がないため、トランスレーショナルメディシンと細胞療法の顕著な技術的進歩であり、高可塑性細胞の長期培養をサポートします。この手順を実演するのは、私の研究室の助教授であるGeorgia Pennarossaと博士課程の学生であるTeresina De Iorioです。まず、新鮮な1ミリモルの5-aza-CRストック溶液を調製します。2.44ミリグラムの5-aza-CRを秤量し、高グルコースで10ミリリットルのDMEMに溶解します。ボルテックスにより粉末を再懸濁し、0.22μmのフィルターで溶液を滅菌します。5-aza-CRワーキング溶液を調製するには、1マイクロリットルのストック溶液を1ミリリットルの線維芽細胞培養液に希釈します。テキスト原稿に記載されているように細胞をトリプシン化し、穏やかなピペッティングで細胞を取り除きます。次に、細胞懸濁液を回収し、円錐形のチューブに移します。光学顕微鏡下の計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液をGの150倍で5分間遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットを再懸濁して、1マイクロモルの5-aza-CRを添加した30マイクロリットルの線維芽細胞培養培地に40, 000個の細胞を取得します。35mmのペトリ皿にPTFE粉末を充填してベッドを作り、30マイクロリットルの細胞を粉末ベッドに分注します。ペトリ皿を円を描くようにゆっくりと回転させ、PTFE粉末が液滴の表面を完全に覆い、液体大理石のマイクロバイオリアクターを形成するようにします。大理石の直径に合わせてカットされた1000マイクロリットルのピペットチップを使用して、液体大理石マイクロバイオリアクターを手に取ります。マイクロバイオリアクターを清潔な細菌学のペトリ皿にプレートして、安定させます。次に、マイクロバイオリアクターをペトリ皿から96ウェルプレートに移します。ウェルの縁から100マイクロリットルのメディアをゆっくりと加えます。マイクロバイオリアクターは、培地の上に浮かぶ必要があります。液体大理石マイクロバイオリアクターを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で18時間インキュベートします。インキュベーション後、1000マイクロリットルのピペットチップを使用して液体大理石マイクロバイオリアクターを回収し、新しい35ミリメートル細菌学ペトリ皿に入れます。針を使って液体大理石に穴を開け、壊します。形成されたスフェロイドを、実体顕微鏡で端部を切断した200マイクロリットルのピペットチップで回収します。5-aza-CRの残留物を洗い流すには、オルガノイドをESC培地を含むシャーレに移します。PTFE粉末床を含む新しい35mmシャーレを準備し、200マイクロリットルのカットピペットチップを使用して、30マイクロリットルのESC培養培地液の液滴中の単一のオルガノイドを粉末に分注します。ディッシュを円を描くようにゆっくりと回転させて、新しい液体大理石マイクロバイオリアクターを形成し、96ウェルプレートのウェルに移します。ウェルの縁から100マイクロリットルのメディアを追加して、大理石をゆっくりと浸します。液体大理石のマイクロバイオリアクターを摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。形態学的解析によると、脱メチル化剤5-aza-CRと18時間インキュベートした後、PTFEマイクロバイオリアクターにカプセル化された3種の哺乳類由来の線維芽細胞が凝集し、均一なサイズ形状の3D球状構造を形成しました。3D条件下では、カプセル化された細胞の86.31%が表現型を著しく変更しました。対照的に、2D標準条件で培養されたポスト5-aza-CR細胞は、粒状核を持ち、単層分布を保持したサイズがかなり小さくなりました。形態学的変化は、3Dおよび2Dのポスト5-aza-CR細胞の両方で、多能性関連遺伝子発現の開始を伴いました。転写は、未処理の線維芽細胞には存在しないPOUクラス5ホメオボックス1、NANOGホメオボックス、ZFP42ジンクフィンガータンパク質、および性決定領域Ybox2で観察されました。10-11転座2上皮細胞接着分子とカドヘリン1遺伝子の有意なアップレギュレーションも、2D標準プラスチック皿で培養された細胞と比較して、3Dポスト5-aza-CR細胞で観察されました。並行して、線維芽細胞特異的マーカーであるThy1細胞表面抗原のダウンレギュレーションが、3Dおよび2Dのpost-5-aza-CR細胞の両方で検出されました。ELISAでは、3Dおよび2Dのポスト5-aza-CR細胞の両方でメチル化レベルの有意な低下が確認されました。DNAメチル化レベルは、2D条件で培養された細胞と比較して、3Dポスト5-aza-CR細胞で有意に低かった。さらに、3Dポスト5-aza-CR細胞は、獲得した3D球状構造、多能性関連遺伝子の高発現レベル、および低いDNAメチル化レベルを28日間保持し、その時点で培養が停止しました。マイクロバイオリアクターは、前駆細胞培養に最適な条件を維持したり、最終分化効率を高めたりするためにも使用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

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