エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

このビデオで初めて紹介されたプロトコルは、化学的なエピジェネティックな消去と生体力学的手がかりを組み合わせて、成体の末期分化細胞に多能性を誘導し維持するものです。このプロトコルの主な強みは、トランスジェニックベクターやウイルスベクターを必要としないことです。さらに、堅牢で再現性が高く、柔軟性があります。

この技術は遺伝子トランスフェクションを使用する必要がないため、トランスレーショナルメディシンと細胞療法の顕著な技術的進歩であり、高可塑性細胞の長期培養をサポートします。この手順を実演するのは、私の研究室の助教授であるGeorgia Pennarossaと博士課程の学生であるTeresina De Iorioです。まず、新鮮な1ミリモルの5-aza-CRストック溶液を調製します。

2.44ミリグラムの5-aza-CRを秤量し、高グルコースで10ミリリットルのDMEMに溶解します。ボルテックスにより粉末を再懸濁し、0.22μmのフィルターで溶液を滅菌します。5-aza-CRワーキング溶液を調製するには、1マイクロリットルのストック溶液を1ミリリットルの線維芽細胞培養液に希釈します。

テキスト原稿に記載されているように細胞をトリプシン化し、穏やかなピペッティングで細胞を取り除きます。次に、細胞懸濁液を回収し、円錐形のチューブに移します。光学顕微鏡下の計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。

細胞懸濁液をGの150倍で5分間遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットを再懸濁して、1マイクロモルの5-aza-CRを添加した30マイクロリットルの線維芽細胞培養培地に40, 000個の細胞を取得します。35mmのペトリ皿にPTFE粉末を充填してベッドを作り、30マイクロリットルの細胞を粉末ベッドに分注します。

ペトリ皿を円を描くようにゆっくりと回転させ、PTFE粉末が液滴の表面を完全に覆い、液体大理石のマイクロバイオリアクターを形成するようにします。大理石の直径に合わせてカットされた1000マイクロリットルのピペットチップを使用して、液体大理石マイクロバイオリアクターを手に取ります。マイクロバイオリアクターを清潔な細菌学のペトリ皿にプレートして、安定させます。

次に、マイクロバイオリアクターをペトリ皿から96ウェルプレートに移します。ウェルの縁から100マイクロリットルのメディアをゆっくりと加えます。マイクロバイオリアクターは、培地の上に浮かぶ必要があります。

液体大理石マイクロバイオリアクターを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で18時間インキュベートします。インキュベーション後、1000マイクロリットルのピペットチップを使用して液体大理石マイクロバイオリアクターを回収し、新しい35ミリメートル細菌学ペトリ皿に入れます。針を使って液体大理石に穴を開け、壊します。

形成されたスフェロイドを、実体顕微鏡で端部を切断した200マイクロリットルのピペットチップで回収します。5-aza-CRの残留物を洗い流すには、オルガノイドをESC培地を含むシャーレに移します。PTFE粉末床を含む新しい35mmシャーレを準備し、200マイクロリットルのカットピペットチップを使用して、30マイクロリットルのESC培養培地液の液滴中の単一のオルガノイドを粉末に分注します。

ディッシュを円を描くようにゆっくりと回転させて、新しい液体大理石マイクロバイオリアクターを形成し、96ウェルプレートのウェルに移します。ウェルの縁から100マイクロリットルのメディアを追加して、大理石をゆっくりと浸します。液体大理石のマイクロバイオリアクターを摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。

形態学的解析によると、脱メチル化剤5-aza-CRと18時間インキュベートした後、PTFEマイクロバイオリアクターにカプセル化された3種の哺乳類由来の線維芽細胞が凝集し、均一なサイズ形状の3D球状構造を形成しました。3D条件下では、カプセル化された細胞の86.31%が表現型を著しく変更しました。対照的に、2D標準条件で培養されたポスト5-aza-CR細胞は、粒状核を持ち、単層分布を保持したサイズがかなり小さくなりました。

形態学的変化は、3Dおよび2Dのポスト5-aza-CR細胞の両方で、多能性関連遺伝子発現の開始を伴いました。転写は、未処理の線維芽細胞には存在しないPOUクラス5ホメオボックス1、NANOGホメオボックス、ZFP42ジンクフィンガータンパク質、および性決定領域Ybox2で観察されました。10-11転座2上皮細胞接着分子とカドヘリン1遺伝子の有意なアップレギュレーションも、2D標準プラスチック皿で培養された細胞と比較して、3Dポスト5-aza-CR細胞で観察されました。

並行して、線維芽細胞特異的マーカーであるThy1細胞表面抗原のダウンレギュレーションが、3Dおよび2Dのpost-5-aza-CR細胞の両方で検出されました。ELISAでは、3Dおよび2Dのポスト5-aza-CR細胞の両方でメチル化レベルの有意な低下が確認されました。DNAメチル化レベルは、2D条件で培養された細胞と比較して、3Dポスト5-aza-CR細胞で有意に低かった。

さらに、3Dポスト5-aza-CR細胞は、獲得した3D球状構造、多能性関連遺伝子の高発現レベル、および低いDNAメチル化レベルを28日間保持し、その時点で培養が停止しました。マイクロバイオリアクターは、前駆細胞培養に最適な条件を維持したり、最終分化効率を高めたりするためにも使用できます。