免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット

ウェスタンブロッティングは、転写された膜上の抗原を検出する確立された方法であり、生物医学研究で一般的に使用されていますが、手順全体を完了するには数時間から数日かかります。免疫増強技術と周期的なドレナージおよび補充の組み合わせにより、ブロック膜ができたら、感度を犠牲にすることなく、わずか20分ですべての手順を完了することができます。ウェスタンブロッティングは多くの異なる研究分野に共通しているため、研究をスピードアップするための幅広い適用性があります。

このプロトコールが成功するかどうかは、免疫反応増強試薬による抗体希釈の最適化とインキュベーション時間にかかっています。まず、PVDFメンブレンを適切なブロッキングバッファーで1時間インキュベートし、室温で攪拌します。メンブレンをインキュベートしている間に、10%免疫反応増強剤1溶液またはIRE1を蒸留水で調製し、よくボルテックスした後、一次抗体を10%IRE1で希釈し、穏やかかつ十分に混合します。

ピンセットでPVDFメンブレンをつまみ、ブロッキング溶液を短時間排出します。メンブレンを一次抗体の入った円錐形のチューブに挿入し、メンブレン全体がチューブの壁に密着し、もともとゲルと接触していたメンブレンの側が内側を向いていることを確認します。チューブをしっかりとキャップします。

チューブをハイブリダイゼーションオーブン用のガラス瓶に挿入し、オーブンの電源を入れます。メンブレンを6回転回転させて少なくとも5分間インキュベートします。回転を停止し、ピンセットでチューブからPVDFメンブレンを慎重に取り外します。

メンブレンを50ミリリットルのPBSTの入った容器に入れてすすぎ、蒸留水を入れた容器で泡が出なくなるまですすいで、抗体の大部分を除去します。メンブレンを250ミリリットルのPBSTを含むサラダスピナーに移します。ストレーナバスケットをスピナーに置き、蓋がしっかりと取り付けられていることを確認してから、スピナーを作動させて20〜30秒間実行します。

溶液を捨て、蒸留水でスピナーの内側を短時間すすいでください。スピナーに250ミリリットルのPBSTを加えてスピンを繰り返し、メンブレンを二次抗体とインキュベートし、テキスト原稿に記載されているように再度洗浄します。半透明のフレキシブルフィルムを平らな面に置きます。

化学発光基質の2つの成分を5ミリリットルのチューブで混合し、すぐに1.5ミリリットルの混合基質を半透明フィルムに移します。PVDFメンブレンを溶液の上に置き、残りの基質溶液をメンブレンに移します。PVDFメンブレンを混合基質と1分間インキュベートします。

ピンセットでPVDFメンブレンをつまみ、基質溶液を短時間排出します。膜を一対の透明フィルムで挟み込み、化学発光モードで画像化します。ここでは、ウェスタンブロットの化学発光検出に必要な抗原と抗体の量をそれぞれ示しています。

スタティックインキュベーションとCDRインキュベーションの両方で、IRE溶液を使用すると感度が向上しました。同様に、抗6s Hisタグ抗体の最小濃度は、静的条件下では100ナノグラム/ミリリットルから50ナノグラム/リットルに、CDR条件下では100ナノグラム/ミリリットルから12.5ナノグラムに低下しました。CDRを5分または10分間インキュベーションすると、静的インキュベーションと比較して検出限界が劇的に低下しました。

さらに、CDRとIREの組み合わせにより、非常に短いインキュベーション期間内でも、ウェスタンブロットに対する優れた感度が明らかになりました。ここでは、蛍光検出を用いたウェスタンブロットへのこの分析法の適用の成功例を実証しています。蛍光検出は、化学発光検出とは対照的に、抗体をストリッピングしたりリプロービングしたりすることなく、同じブロット上の複数のターゲットを同時に検出する独自の能力を持っています。

細胞溶解物中のHisタグ付きアルカリホスファターゼとβ-アクチンを、2色の蛍光色素を用いて同時に検出しました。IREによるCDRインキュベーションは、検出を加速するだけでなく、感度も向上させました。インキュベーション中、メンブレンはチューブの壁に付着したままにする必要があります。

溶液が膜表面上で絶えず洗浄されるように、チューブを水平に回転させる必要があります。このプロトコールにより、ウェスタンブロッティング法に大きく依存する研究の生産性が大幅に向上しました。