Name: 免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 学ぶ、免疫反応向上剤とCDR技術を組み合わせた超高速ウェスタンブロット法。20分で高感度の抗原検出が可能となり、生物医学研究の効率化に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の壁内研究部門によって支援されました。S.H.は日本の官民パートナーシップ学生留学プログラムの支援を受け、H.N.とK.Y.は武勇とVドラッグ海外研修奨学金を受けた。

1. SDS-ページとPVDF膜への転送
<ol><li>相対サイズに基づいてタンパク質を分離するためにSDS-PAGEを行います。 注:商用または自家製のゲルシステムは問題ありません。製造元のプロトコルに従ってください。</li>
	<li>分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に移す。 注:一般的な転送方法(半乾式または湿式転送)が適しています。製造元のプロトコルに従ってください。</li>
</ol>2. PVDF膜の遮断
<ol><li>膜を室温で撹拌して1時間適切なブロッキングバッファーにインキュベートします。 注:一次抗体および検出システムに応じて、適切なブロッキングバッファを選択する必要があります。例えば、最も典型的なブロッカーはBSA、非脂肪乾燥乳、カゼイン、および市販の合成ポリマーである。Tween20 が 0.1% の PBS および TBS は、最も一般的に使用されるバッファーです。このブロッキング工程は、4°Cで一晩行なわれてもよい。</li>
</ol>3. 一次抗体によるインキュベーション
<ol><li>蒸留水で10%免疫反応増強剤-1溶液(IRE-1)を調製する。渦はよく。</li>
	<li>10%IRE-1で希釈された一次抗体を調製します。やさしく、十分に混ぜます。</li>
	<li>より大きな膜(4 cm x 8 cm - 8 cm x 8 cm)を使用する場合は、抗体溶液の8 mLを50 mL円錐形遠心分離管に加えます。より小さい膜(2 cm x 8 cm - 4 cm x 8 cm)を使用する場合、抗体溶液の3 mLを14 mLの丸底ポリプロピレンチューブ(材料表)に加える。</li>
	<li>ピンセットでPVDF膜を拾い、ブロッキング溶液を簡単に排出します。PVDF膜を手袋をした指でこのチューブに挿入し、膜全体がチューブの壁に付着していることを確認します。PVDF膜をチューブに挿入すると、もともとゲルに接触していた膜の「タンパク質側」に向かって、内側に向かいます。キャップをしっかりと閉じます。</li>
	<li>50 mLチューブをガラス瓶に入れます。 注:このインキュベーションに14 mLチューブを使用する場合は、50 mLチューブの中央にインナーチューブを保持するためにプラスチックリングホルダーのペアを使用して、50 mLチューブに14 mLチューブを挿入します。</li>
	<li>ハイブリダイゼーションオーブンをオンにします。</li>
	<li>少なくとも5分間、6rpm回転で膜をインキュベートする。 注:膜が常に壁に付着していること、および(内側の)チューブが抗体溶液で膜を均等に覆うために水平であることを確認してください。実際の実験の前に抗体の希釈とインキュベーション時間を較正します。</li>
</ol>4. 膜洗浄
<ol><li>回転を停止します。</li>
	<li>ピンセットでチューブからPVDF膜を慎重に取り出し、50 mLのPBS-Tの容器に入れます。</li>
	<li>膜をPBS-Tで短時間すすいでください。</li>
	<li>気泡が出なくなるまで、蒸留水で容器内の膜をすすいでください。これは抗体の大部分を除去する。</li>
	<li>PVDF膜を容器から250 mLのPBS-Tを含むサラダスピナーに移します。</li>
	<li>ストレーナーバスケットをスピナーに入れます。蓋がしっかりと付けられていたことを確認します。</li>
	<li>スピナーをアクティブにし、約20〜30 sでそれを実行します。</li>
	<li>溶液を捨て、蒸留水でスピナーの内側を簡単にすすきます。</li>
	<li>250 mL の PBS-T を再度スピナーに加えます。</li>
	<li>手順 4.6 と 4.7 を繰り返します。</li>
</ol>5. 二次抗体を用いてインキュベーション
<ol><li>蒸留水で10%免疫反応増強剤-2溶液(IRE-2)を調製する。渦はよく。</li>
	<li>10%IRE-2で希釈された二次抗体を調製します。やさしく、十分に混ぜます。</li>
	<li>ステップ3.3に記載されている抗体溶液およびチューブの体積を選択します。</li>
	<li>ピンセットでPVDF膜を拾い、溶液を簡単に排出します。手順 3.4 に記載されているように、PVDF 膜をチューブに挿入します。</li>
	<li>50 mLチューブをガラス瓶に入れます。</li>
	<li>ハイブリダイゼーションオーブンをオンにします。</li>
	<li>少なくとも5分間、6rpm回転で膜をインキュベートする。膜が常に壁に付着していること、および(内側の)チューブが抗体溶液で膜を均等に覆うために水平であることを確認してください。 注: 実際の実験の前にインキュベーション時間を調整します。二次抗体が蛍光結合されると、暗所でインキュベーションを行う。</li>
</ol>6. 膜洗浄
<ol><li>手順 4.1 ~ 4.10 に従います。</li>
</ol>7. 画像の取得
<ol><li>化学発光検出<ol>
<li>半移植柔軟フィルム(10 cm x 15 cm)を平らな表面に置きます。</li>
		<li>5 mL チューブに化学発光基材の 2 つの成分を混合します。</li>
		<li>混合基材の1.5mLを半移植柔軟なフィルムに直ちに移し、PVDF膜をその上に置きます。次いで、残りの基質溶液を膜上に移す。</li>
		<li>半透明のフレキシブルフィルム上に混合基材を用いてPVDF膜を1分間インキュベートします。</li>
		<li>ピンセットでPVDF膜をピックアップし、基質溶液を簡単に排出します。</li>
		<li>透明フィルムのペアの間に膜を挟みます。</li>
		<li>化学発光モードで画像を取得します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光検出<ol>
<li>ピンセットでPVDF膜を拾い、溶液を簡単に排出します。</li>
		<li>透明フィルムのペアの間に膜を挟みます。</li>
		<li>蛍光モードで画像を取得します。 メモ:ステップ7.1と7.2は、最大感度を確保するために、イメージングマシンに近接して実行する必要があります。</li>
		<li>バックグラウンドシグナルが高い場合、PBS-Tの80〜100 mLの容器内で洗浄工程を行い、10分リンスを一次抗体に対して3回、2次抗体に対して5分リンスを6回行う。 注:10%のIRE溶液で希釈された一次抗体と二次抗体の両方を、感度6を失うことなく最大8〜10回使用できます。溶液は、最大1ヶ月間4°Cに保つ必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacol+Toxicology+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li>
<li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li>
<li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li>
<li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li>
<li>Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html">http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html</a> (2020).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+but+not+Obsolete%3A+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li>
<li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852(2016).</li>
<li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li>
<li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li>
</ol>

著者らは、この記事の内容に直接関係する競合する利益を宣言していません。

ウェスタンブロットは、約40年前に開発された特定のタンパク質を検出するために広く使用されている分析技術です7,8.それ以来、技術は進化し続けており、その後の技術革新により、技術2、9、10、11、12、13の感度、速度、定量性が向上しています。ここで紹介する強化された超高速ウェスタンブロッティングプロトコルは、既存の技術にいくつかの大幅な強化を行います。IREによる検出閾値を下げることにより、感度を犠牲にすることなくインキュベーション時間を短縮します。特別なまたは高価な機器は必要ありません:ハイブリダイゼーションオーブンでチューブ...

ウェスタンブロット(イムノブロットとも呼ばれる)は、幅広い科学的および臨床的分野にわたる強力で基本的な技術です。この技術は、タンパク質1の存在、相対的存在量、相対分子質量、および翻訳後修飾を調べるために使用される。デジタル画像解析と組み合わせることで、この方法はタンパク質およびタンパク質修飾の豊富さを確実に分析することができます2.ウェスタンブロットは日常的に行われますが、時間と労力を要する方法です。膜を有する抗体の長いインキュベーションが必要です。ここでは、感度を犠牲にすることなくこの制限を克服するインキュベーション法の改変について述べる。
膜のインキュベーション中、抗体は溶液中に浮遊し、抗原は膜上に固定化される。その高い親和性のために、抗体が抗原に結合する速度は、バルク溶液から膜への抗体の拡散よりも速い。これにより、低濃度の「枯渇層」が作成されます(図1)。この技術では、より遠い抗体が受動的拡散によって膜に到達するまでに数時間かかることがあります。この効果は、大量輸送制限(MTL)3と呼ばれます。抗体含有溶液の繰り返しの排水と補充は、枯渇層を破壊し、MTL4を克服する可能性が提案されている。ここでは、従来のウェスタンブロッティングプロトコルにおけるMTLの効果を減少させ、必要な潜伏期間を顕著に短縮するために、この循環ドレインおよび補充(CDR)概念を実装する独自の技術を考案しました。
短時間で検出感度を維持するために、抗原抗体反応を加速する免疫反応増強技術を用いて、シグナル対ノイズ比5を向上させた。市販の免疫反応増強剤(IRE)の多くは2成分から構成されている(溶液1および2、表の材料表参照)。IREの独自の組成または作用機序は明らかにされていないが、固相結合アッセイにおいてIREが抗原と抗体との間の解離定数を低下させることを以前に発見したが、少なくとも部分的には、IRE6の増強効果を担う親和性の増加を示す。CDRとIREの組み合わせは、感度を犠牲にすることなく、手順全体の時間を短縮する超高速ウェスタンブロッティングプロトコルを生み出します。

<table><tbody><tr><td>14 mL丸底高透明度PP試験管、目盛り付き、スナップキャップ</td><td>付き、ファルコン</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>アポロ透明フィルム、レーザープリンター用</td><td>N/A</td><td>N/A</td> あらゆる種類の<td>レーザープリンター透明フィルムは問題ありません。</td></tr><tr><td>Azure Imaging System 600</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure 600</td><td>化学発光および/または蛍光検出には、あらゆる種類の画像取得システムに適しています。</td></tr><tr><td>シグナル免疫反応増強剤溶液</td><td>東洋紡</td><td>NKB-101</td><td></td></tr><tr><td>CARNATION インスタント無脂肪ドライミルク</td><td>カーネーション</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ECL 抗マウス IgG、西洋わさびペルオキシダーゼ リンク F(ab')ヒツジからの2つの断片</td>GE <td>Healthcare</td><td>NA9310V</td><td></td></tr><tr><td>ECL抗ウサギIgG、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合F(ab')ロバからの2つのフラグメント</td>GE<td>ヘルスケア</td><td>NA9340V</td><td></td></tr><tr><td>HYBAID Micro-4</td><td>N/A</td><td>N/A チューブ</td><td>が水平位置で均等に回転している限り、任意のハイブリダイゼーションオーブンで問題ありません。</td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDFメンブレン、0.45 &micro;m 細孔サイズ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD ヤギ抗マウスIgG二次抗体</td><td>LICOR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ抗ウサギIgG二次抗体</td><td>LICOR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td><td>seracare</td><td>5430-0049</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗-szlig;アクチン抗体</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>オデッセイ ブロッキングバッファー (PBS)</td><td>LICOR</td><td>927-40100</td><td>蛍光検出用ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>OXO サラダスピナー</td><td>OXO</td><td>32480V2B</td><td>PVDF 膜が破れることなく激しくすすがれている限り、どんなサラダスピナーでも問題ありません。</td></tr><tr><td>パラフィルムシーリングフィルム</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M PM996</td><td>半透明フレキシブルフィルム</td></tr><tr><td>ポリエチレン フラットトップスクリューキャップ 50 mL 円錐底遠心分離チューブ用</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>リング 50 ml チューブの中心に 14 ml チューブを保持するリング</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>機械工場で準備</td></tr><tr><td>ウサギ anti-6X 彼のタグ抗体</td><td>Abcam</td><td>ab9108</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

ウェスタンブロット(免疫ブロットとも呼ばれる)は、生物医学研究のための正規の方法です。これは、特定のタンパク質の相対的なサイズと存在量だけでなく、翻訳後のタンパク質修飾を決定するために一般的に使用されます。この技術は豊かな歴史を持ち、そのシンプルさのために広く使用されています。しかし、ウェスタンブロッティング手順は、スループットを制限する長いインキュベーション時間であるという重大なボトルネックで、完了までに数時間、さらには数日かかることで有名です。これらのインキュベーションステップは、バルク溶液から膜上の固定化された抗原への抗体の拡散が遅いために必要とされる:膜付近の抗体濃度はバルク濃度よりもはるかに低い。ここでは、抗体溶液の循環ドレインおよび補充(CDR)による抗原結合を改善することにより、これらのインキュベーション間隔を劇的に短縮するイノベーションを提示する。また、免疫反応増強技術を用いて、アッセイの感度を維持しました。市販の免疫反応増強剤とのCDR法の組合せは、出力シグナルを高め、抗体インキュベーション時間を実質的に短縮した。得られた超高速のウェスタンブロットは感受性の損失なしで20分で達成することができる。この方法は、化学発光と蛍光検出の両方を使用してウェスタンブロットに適用することができます。この簡単なプロトコルにより、研究者は多くのサンプルでタンパク質発現の分析をよりよく探求することができます。

この例は、ウェスタンブロット上の免疫増強技術と共にCDR法の有効性を示す。スタティックインキュベーションは、PVDF膜を抗体溶液と共にインキュベートした半透明のフレキシブルフィルムに対して行ったのに対し、CDRインキュベーションは膜および抗体溶液を含む回転チューブによるハイブリダイゼーションオーブン中であった(Movie)。 図2 は、ウェスタンブロット上の化学発光検出に必要な抗原量および抗体をそれぞれ示した。静的およびCDRインキュベーションの両方で、IRE溶液の使用は感度を高めました:IREは、静的条件下でß-アクチンを検出するために必要な細胞溶解物(抗原)の最小量を2.2μgから1.1μgに減少させ、CDRを使用して1.1 μgから0.275 μgにさらに減少しました(図2A)。同様に、抗6x Hisタグ抗体の最小濃度は、静的条件下では100 ng/mLから50ng/mLに、CDR条件下では100 ng/mLから12.5ng/mLに低下した(図2B)。5...

超高速ウェスタンブロッティング技術は、免疫反応促進剤と組み合わせて、環状ドレインおよび補充(CDR)技術を介して抗原抗体結合の運動を改善することによって開発される。

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

ウェスタンブロッティングは、転写された膜上の抗原を検出する確立された方法であり、生物医学研究で一般的に使用されていますが、手順全体を完了するには数時間から数日かかります。免疫増強技術と周期的なドレナージおよび補充の組み合わせにより、ブロック膜ができたら、感度を犠牲にすることなく、わずか20分ですべての手順を完了することができます。ウェスタンブロッティングは多くの異なる研究分野に共通しているため、研究をスピードアップするための幅広い適用性があります。このプロトコールが成功するかどうかは、免疫反応増強試薬による抗体希釈の最適化とインキュベーション時間にかかっています。まず、PVDFメンブレンを適切なブロッキングバッファーで1時間インキュベートし、室温で攪拌します。メンブレンをインキュベートしている間に、10%免疫反応増強剤1溶液またはIRE1を蒸留水で調製し、よくボルテックスした後、一次抗体を10%IRE1で希釈し、穏やかかつ十分に混合します。ピンセットでPVDFメンブレンをつまみ、ブロッキング溶液を短時間排出します。メンブレンを一次抗体の入った円錐形のチューブに挿入し、メンブレン全体がチューブの壁に密着し、もともとゲルと接触していたメンブレンの側が内側を向いていることを確認します。チューブをしっかりとキャップします。チューブをハイブリダイゼーションオーブン用のガラス瓶に挿入し、オーブンの電源を入れます。メンブレンを6回転回転させて少なくとも5分間インキュベートします。回転を停止し、ピンセットでチューブからPVDFメンブレンを慎重に取り外します。メンブレンを50ミリリットルのPBSTの入った容器に入れてすすぎ、蒸留水を入れた容器で泡が出なくなるまですすいで、抗体の大部分を除去します。メンブレンを250ミリリットルのPBSTを含むサラダスピナーに移します。ストレーナバスケットをスピナーに置き、蓋がしっかりと取り付けられていることを確認してから、スピナーを作動させて20〜30秒間実行します。溶液を捨て、蒸留水でスピナーの内側を短時間すすいでください。スピナーに250ミリリットルのPBSTを加えてスピンを繰り返し、メンブレンを二次抗体とインキュベートし、テキスト原稿に記載されているように再度洗浄します。半透明のフレキシブルフィルムを平らな面に置きます。化学発光基質の2つの成分を5ミリリットルのチューブで混合し、すぐに1.5ミリリットルの混合基質を半透明フィルムに移します。PVDFメンブレンを溶液の上に置き、残りの基質溶液をメンブレンに移します。PVDFメンブレンを混合基質と1分間インキュベートします。ピンセットでPVDFメンブレンをつまみ、基質溶液を短時間排出します。膜を一対の透明フィルムで挟み込み、化学発光モードで画像化します。ここでは、ウェスタンブロットの化学発光検出に必要な抗原と抗体の量をそれぞれ示しています。スタティックインキュベーションとCDRインキュベーションの両方で、IRE溶液を使用すると感度が向上しました。同様に、抗6s Hisタグ抗体の最小濃度は、静的条件下では100ナノグラム/ミリリットルから50ナノグラム/リットルに、CDR条件下では100ナノグラム/ミリリットルから12.5ナノグラムに低下しました。CDRを5分または10分間インキュベーションすると、静的インキュベーションと比較して検出限界が劇的に低下しました。さらに、CDRとIREの組み合わせにより、非常に短いインキュベーション期間内でも、ウェスタンブロットに対する優れた感度が明らかになりました。ここでは、蛍光検出を用いたウェスタンブロットへのこの分析法の適用の成功例を実証しています。蛍光検出は、化学発光検出とは対照的に、抗体をストリッピングしたりリプロービングしたりすることなく、同じブロット上の複数のターゲットを同時に検出する独自の能力を持っています。細胞溶解物中のHisタグ付きアルカリホスファターゼとβ-アクチンを、2色の蛍光色素を用いて同時に検出しました。IREによるCDRインキュベーションは、検出を加速するだけでなく、感度も向上させました。インキュベーション中、メンブレンはチューブの壁に付着したままにする必要があります。溶液が膜表面上で絶えず洗浄されるように、チューブを水平に回転させる必要があります。このプロトコールにより、ウェスタンブロッティング法に大きく依存する研究の生産性が大幅に向上しました。

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この技術記事では、Invitrogen社から市販されてNuPAGE電気ミニゲルシステムを使用して標準的なウェスタンブロッティング手順を説明します。...

西洋は、Invitrogen NuPage NOVEXビストリスミニゲルを用いたウェスタンブロット

（ウェスタンブロット）免疫ブロッティングは、抗原抗体認識に内在する特異性を悪用することによって機能するタンパク質の検出と特性評価のための迅速かつ高感度ア​​ッセイである。このビデオでは、タンパク質分離のためのプロトコール、メンブレン上にブロッティングタンパク質、immunoprobing、および発色または化学発光基質を用いて可視化を提供します。...

イムノブロット解析

ウエスタンブロット法は、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析手法です。...

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

このビデオでは、免疫沈降したライセートの化学発光に基づくウェスタンブロッティングについて説明しています。この技術は、タンパク質のプロセシングと活性化を決定するのに役立ちます。検出される化学発光シグナルは、その活性化中のタンパク質プロセシングのレベルに比例します。...

タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

V3ワークフローは、染色フリーゲルを使用したウェスタンブロット手順です。この染色フリー技術により、研究者はタンパク質分離の質を可視化し、転写効率を検証し、最も重要なのは、信頼性の高いローディングコントロールとしてタンパク質の総定量を使用して目的のタンパク質の変化を検証することが可能です。...

ウェスタンブロッティングにおける実用的で便利で信頼性の高い全タンパク質ローディング制御のためのV3染色不要のワークフロー

このプロトコルは、ウエスタンブロット分析を行う上での最新の進歩を探る。これらの新規な修飾は、35分間の電気泳動の実行時間を7分乾燥ブロッティング転送システムのBis-Trisゲルシステムを採用して、高解像度、品質、感度、およびウエスタンのデータの精度向上を発生する赤外蛍光タンパク質検出およびイメージング。...

町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

ここで重要な生物学的質問に取り組むためのケーススタディとして、赤外蛍光色素標識DNAプローブと一緒に精製されたSOX-2タンパク質を用いた蛍光電気泳動移動度シフトアッセイ（FEMSA）の最適化されたプロトコルを記述します。...

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

キャピラリー等電集中はタンパク質と非常に小さい試料からアイソ フォームの詳細な特性解析を有効に、抗体を用いた、超高感度、高スループット手法です。次に、自動化・ ロボット化の方法で特定の蛋白質とアイソ...

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

しみが付くプロトコル標準ウエスタンとして 500 造血幹前駆細胞の数を分析するため最適化を行った。最適化を含むセルのサンプルの処理、管の転送を制限して塩化物イオンとサンプル...

西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない

学ぶ、免疫反応向上剤とCDR技術を組み合わせた超高速ウェスタンブロット法。20分で高感度の抗原検出が可能となり、生物医学研究の効率化に貢献します。

免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット

さらに動画を探す