Name: 自由に振る舞うマウスの扁桃体の頭部小型顕微鏡による生体内カルシウムイメージングに成功 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ 自由に動くマウスの扁桃体における生体内カルシウムイメージングの手法。小型顕微鏡を用いて遺伝的に定義された細胞集団の神経活動をリアルタイムで可視化し、感情行動の神経基盤を解明するための効率的なプロトコルを提供します。

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この研究は、サムスン科学技術財団(プロジェクト番号SSTF-BA1801-10)からの助成金によって支えられました。

<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Burgoyne, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+sensor+proteins%3A+generating+diversity+in+neuronal+Ca2%2B+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).</li>
<li>Miyakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+activated+increases+in+Ca2%2B+concentration+in+hippocampal+CA1+pyramidal+cells+are+primarily+due+to+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels.</a> Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).</li>
<li>Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
</ol>

著者は開示するものが何もない

ここで述べたような扁桃体のような深部脳領域における頭部取付小型顕微鏡による生体内光学的カルシウムイメージングの成功を達成するためには、巧みな手術技術が不可欠である。したがって、このプロトコルは、ベースプレートアタッチメントとGRINレンズの移植の最適化された外科プロセスのためのガイドラインを提供しますが、重要なステップのために追加の最適化プロセスが必要な場合があります。プロトコルセクションで述べたように、手術における扁桃体座標、ベースプレート接続ステップにおける気流速度、画像取得設定(フレームレート、LEDパワーなど)をカルシウム記録及び変数(ICA時間重量、イベント最小減衰時間など)で最適化する必要がある。
ベースプレートのアタッチステップは変更できます。ヘッドプレートは、モバイルホームケージで行われたベースプレートアタッチメント中に目を覚ますマウスの頭部を固定するのに役立つため、必要です。しかし、移動式家庭用ケージが実験室で準備されていない場合、イソフルランガス麻酔システムは代替オプションです。この代替方法では、イソフルランガスの濃度が重要で...

カルシウムはユビキタスな第二のメッセンジャーであり、ほぼすべての細胞機能8において重要な役割を果たしている。ニューロンにおいて、作用電位焼成およびシナプス入力は、細胞内遊離の急速な変化を引き起こす [Ca2+]9,10.したがって、カルシウム過渡性を追跡することは、神経活動を監視する機会を提供する。GEC は、定義された細胞集団および細胞内区画11,12で [Ca2+] を監視できる強力なツールです。タンパク質ベースのカルシウム指標の多くの異なるタイプの中で、GCaMPは、単一のGFP分子13に基づくCa2+プローブで、最も最適化され、広く使用されているGECIです。複数のエンジニアリングを通じて、GCaMPの多くのバリエーションが12、14、15、16で開発されました。我々は、このプロトコル16で最近開発されたGCaMPの1、GCaMP7bを使用しています。GCaMPセンサは、開発中のCa2+過渡現象のイメージング、特定皮質層18における生体内イメージング、運動タスク学習19における回路ダイナミクスの測定、海馬および扁桃体20、20の連想恐怖記憶に関連する細胞アンサンブル活動のイメージングなど、多くのモデル生物における神経回路機能の研究に大きく貢献してきた。
GECI の光学イメージングには、いくつかの利点があります。遺伝的コード化により、GECは、遺伝的プロファイルまたは解剖学的接続性の特定のパターンによって定義される特定のサブセットの細胞において、長期間安定して発現することが可能になります。光学イメージングは、生きている動物のニューロンの数百から数千の生体内の慢性同時監視を可能にします。脳内でのGECのイメージングおよび解析のために、ヘッドマウント小型蛍光顕微鏡21、23、24、25を用いて、マウスを自由に振る舞う光学イメージングシステムがいくつか開発されている。GECを用いたin vivo光学イメージング技術、GRINレンズ、およびヘッドマウント小型顕微鏡は神経回路活動と行動との関連を研究する強力なツールであるにもかかわらず、この技術を扁桃体に適用することは、扁桃体でGECを発現する細胞に対するいくつかの技術的な問題により困難であった。このプロトコルは、扁桃体における生体内光学カルシウムイメージングを成功させるための重要なステップであるベースプレート付着およびGRINレンズ注入の外科的処置に役立つガイドラインを提供することを目的としている。このプロトコルは扁桃体を標的としますが、ここで説明するほとんどの手順は、一般的に他のより深い脳領域に適用されます。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、他の代替システムでも同じ目的が容易に達成され得る。

<table><tbody><tr><td>26Gニードル</td><td>BD</td><td>302002</td><td>手術</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td></td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td></tr>手術<tr><td>AAV2 / 1-CaMKii&alpha;-GFP</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>手術</td></tr><tr><td>アクリル歯科用セメント(オルソジェットアクリルピンク)</td><td>Lang</td><td>1334-ピンク</td><td>手術&ベースプレートアタッチメント</td></tr><tr><td>エアフローマニピュレーター</td><td>ニューロター</td><td>NTR000253-04</td><td>ベースプレートアタッチメント</td></tr><tr><td>アモキシシリン</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>手術</td></tr><tr><td>用ベースプレート</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>ベースプレートアタッチメント</td></tr><tr><td>ベースプレートカバー</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>ベースプレートアタッチメント</td></tr><tr><td>行動装置(チャンバー)</td><td>Coulbournインスツルメント</td><td>テストケージ</td><td>ビヘイ</td></tr>ビア<tr><td>テスト ビヘイビア機器(ソフトウェア)</td><td>コールボーン インストゥルメント</td><td>フリーズフレーム</td><td>ビヘイビアテスト</td></tr><tr><td>カーボンケージ</td><td>ニューロター</td><td>180mm×70mm</td><td>ベースプレート アタッチメント</td></tr><tr><td>カルプロフェン</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>手術</td></tr><tr><td>データ処理ソフト</td><td>INSCOPIX</td><td>データ処理ソフト</td><td>ベースプレートアタッチメント&行動試験</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>手術</td></tr><tr><td>用ドリル</td><td>セヤン</td><td>マラソン-4</td><td>手術</td></tr><tr><td>用ドリルバー</td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td></td></tr><tr><td>手術用ガラス針</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>手術</td></tr><tr><td>用 GRINレンズ (INSCOPIX Proview レンズプローブ)</td> <td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>手術</td></tr><tr><td>用ハミルトンシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>84875</td><td>手術</td></tr><tr><td>ヘッドプレート</td><td>神経腫瘍</td><td>モデル5</td><td>手術</td></tr><tr><td>六角レンチ</td><td>INSCOPIX1050-004195</td><td>ベースプレートアタッチメント</td><td></td></tr><tr><td>ラップトップコンピュータ</td><td>サムスン</td><td>NT950XBV</td><td>手術&ベースプレートアタッチメント</td></tr><tr><td>レンズホルダー、脳定位固定装置ロッド(INSCOPIX proviewインプラントキット)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>手術</td></tr><tr><td>顕微鏡グリッパー</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>ベースプレートアタッチメント</td></tr><tr><td>顕微鏡、DAQソフトウェア、ハードウェア</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>ベースプレートアタッチメント &行動テスト</td></tr><tr><td>モバイルホームケージ</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>ベースプレートアタッチメント</td></tr><tr><td>Moterized arm</td><td>Neurostar</td><td>カスタマイズ</td><td>手術</td></tr><tr><td>Moterized アームソフトウェア</td><td>Neurostar</td><td>カスタマイズ</td><td>手術</td></tr><tr><td>NIボード</td><td>国立楽器</td><td></td><td>行動テスト</td></tr><tr><td>取り外し可能なエポキシボンド</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>手術</td></tr><tr><td>レジンセメント(スーパーボンド)</td><td>サンメディカル</td><td>スーパーボンド C&B</td><td>手術</td></tr><tr><td>頭蓋骨ねじ</td><td>ストールティング</td><td>51457</td><td>手術</td></tr><tr><td>脳定位固定装置用電極ホルダー</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>手術</td></tr><tr><td>脳定位固定装置フレーム</td><td>ストールティング</td><td>51600</td><td>手術</td></tr><tr><td>脳定位固定装置マニピュレーター</td><td>ストールティング</td><td>51600</td><td>ベースプレートアタッチメント</td></tr></tbody></table>

自由に振る舞うマウスの扁桃体の頭部小型顕微鏡による生体内カルシウムイメージングに成功

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

自由に動く動物の神経活動のリアルタイムモニタリングは、神経活動を行動に結びつける重要なアプローチの1つです。このため、遺伝子組み換えカルシウム指標(GEC)、蛍光顕微鏡の微細化、および勾配屈折率(GRIN)レンズを用いてニューロンのカルシウム過渡症を検出するinvivoイメージング技術が開発され、多くの脳構造1、2、3、4、5、6に応用することに成功しました。このイメージング技術は、遺伝的に定義された細胞集団の長期にわたる数週間の慢性同時イメージングを可能にするため、特に強力です。有用であるが、このイメージング技術は、扁桃体、感情処理および連想恐怖記憶7に不可欠な脳構造である扁桃体などの脳内の深部に位置する脳構造に容易に適用されていない。扁桃体にイメージング技術を適用することが困難になるいくつかの要因があります。例えば、運動アーチファクトは、通常、脳の深部に移植されたヘッドマウント顕微鏡が比較的不安定であるため、より深い脳領域で行われるイメージング中により頻繁に発生する。もう一つの問題は、横心室が埋め込まれたGRINレンズの近くに位置し、呼吸中のその動きが、容易に矯正できない非常に不規則な運動アーチファクトを引き起こし、安定したイメージングビューを形成することが困難になることです。さらに、扁桃体の細胞は通常安静状態または麻酔状態で静かであるため、後のイメージングのための基固め手順の間に扁桃体中のGECIを発現する標的細胞を見つけて焦点を合わせるのは難しい。このプロトコルは、扁桃体でGECIを発現する細胞を頭部小型化顕微鏡で効率的に標的化し、このようなより深い脳領域で生体内カルシウムイメージングを成功させる方法に関する有用なガイドラインを提供する。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、それに限定されないことに留意された。

GRINレンズ注入の検証 セメンテーションによってベースプレートを脳に慢性的に取り付ける前に、GRINレンズの注入を検証する必要があります。レンズの移植に成功した動物では、GCaMP発現細胞と血管の両方が、顕微鏡の対物レンズと埋め込まれたGRINレンズとの距離によって決定される焦点面範囲内で明確に観察された(図2AおよびB)。対照的に、オフターゲット移植を有する動物では、GCaMP発現細胞の鮮明な画像は、焦点外または視野外の範囲内で観察されなかった。焦点が合っていない場合、焦点が合った血管は観察できたが、焦点面範囲内の細胞に対してぼやけた画像しか観察できなかった(図2CおよびD)。視界外の場合、ほとんどの場合血管は観察されず、焦点面範囲内で蛍光シグナルは検出されなかった(図2E)。また、他の場合とは異なり、埋め込まれ...

生体内の微小内視鏡的カルシウムイメージングは、動物の行動を自由に行う神経活動をリアルタイムで監視できる貴重なツールです。しかし、扁桃体にこの技術を適用することは困難であった。このプロトコルは、マウスの顕微鏡を小型化した扁桃体細胞を標的にするための有用なガイドラインを提供することを目的としています。

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

小型顕微鏡を扁桃体のin vivoカルシウムイメージングに使用すると、多くの課題が生じる可能性があります。このプロトコールは、in vivoカルシウムイメージングを成功させるための時間節約ガイドラインを提供します。In vivo カルシウムイメージングは、遺伝的に定義された細胞集団を最大数週間にわたって連続的に同時にイメージングすることを可能にしますが、これはこれまで不可能だったプロセスです。AAV注射の場合、麻酔をかけたマウスを定位固定装置フレームに固定し、ブレグマとラムダの高さをピンに合わせ、開頭術のために露出して消毒した頭蓋骨の特定の位置を特定します。0.6ミリメートルビットを装備したドリルを使用して、毎分18, 000回転のドリル速度で1.6ミリメートルの開頭術を慎重に行い、滅菌PBSで頭蓋骨を洗浄します。4.2ミリメートルからブレグマと露出した脳表面との間の背腹差を差し引き、ブレグマに基づくレンズ移植の背腹座標を値A距離を算出し、AAV溶液の1ミリリットルあたり10〜13番目のウイルスゲノムの1倍を超える3マイクロリットルの鉱油と0.7マイクロリットルをガラスピペットにロードします。定位固定装置プローブホルダーからピンを取り外して、ピペットをフレームに固定し、準備した注射部位にピペットを合わせます。出血が完全に止まったら、ガラス製のピペットチップを背腹側ブレグマ座標から脳組織に4.3mm挿入し、注入ポンプでウイルスの全量を送達してから、ゆっくりとピペットを取り出します。すべてのウイルスが注入されたら、実証されているように頭蓋骨をさらに2回ドリルして、2つの頭蓋骨ネジを埋め込み、頭蓋骨の画分をPBSで洗浄します。次に、70%エタノール滅菌ネジをできるだけ深く埋め込み、定位固定装置フレームに電動手術アームを取り付けます。制御ソフトウェアがインストールされているラップトップコンピューターに必要なハードウェアを接続し、カニューレホルダーを使用して26ゲージの針を定位フレームに安定して固定します。針挿入部位の座標を計算した後、脳の露出面に定位固定装置を使用して針先を配置し、PBSを2〜3滴滴で脳組織に水和します。適切な背腹側と外側の扁桃体座標をソフトウェアに入力し、[GoTo]をクリックして針を下ろします。針が完全に止まったら、開始位置ボックスに45ミリメートルを入力し、[GoTo]をクリックして針を持ち上げます。針の動きが止まったら、脳表面からPBSを取り外し、針とカニューレホルダーを脳定位固定フレームから取り外します。レンズホルダーを脳定位固定装置ロッドに取り付け、GRINレンズをレンズホルダーに固定します。レンズを70%エタノールで滅菌し、脳定位固定装置ロッドを脳定位固定装置フレームに取り付けます。GRINレンズの先端を脳表面の指定部位に置き、脳表面の背腹座標からAの絶対値を差し引くことで、レンズ移植用の背腹座標を決定します。PBSの付加的な2つから3滴の脳ティッシュを水和させ、モーターを備えられた腕を使用して1、000マイクロメートルに下降の深さをおよび300マイクロメートルに上がる高さをセットします。GRINレンズが目的の部位に到達したら、PBSを取り外し、GRINレンズ、ネジ、ネジ側壁の周りに樹脂デンタルセメントを慎重に塗布します。デンタルセメントが固まったら、レンズホルダーをレンズから取り外し、頭蓋骨の表面にアクリルセメントを塗布します。次に、レンズホルダーをロッドの先端に水平方向にテープで固定されたヘッドプレートと交換します。ヘッドプレートがレンズカフの上部に配置されるまでロッドをゆっくりと下げてから、レンズがヘッドプレートの内部リングの右端に位置するまでヘッドプレート1、000マイクロメートルを下げます。アクリルセメントを使用してヘッドプレートをセメント層に取り付け、パラフィンフィルムを使用して埋め込まれたGRINレンズ表面をほこりから保護し、パラフィンフィルムに取り外し可能なエポキシボンドを塗布してフィルムをレンズ表面に固定し、動物を完全に横臥するまで監視しながらケージに戻します。GRINレンズの埋め込みの品質を評価するには、モバイルホームケージシステムのヘッドバー上の麻酔マウスの下にカーボンケージを置き、ケージが摩擦なく自由に動くように空気の流れをオンにします。顕微鏡グリッパーと脳定位固定装置マニピュレーターを使用して、小型化された顕微鏡をフレームに垂直に位置合わせしてから、埋め込まれたGRINレンズの表面がソフトウェア内の画像視野に現れるまで顕微鏡を下げます。埋め込み型GRINレンズの中心を視野の中心に合わせ、埋め込み型GRINレンズ表面の画像を撮影した後、GCaMP発現細胞の姿を画像観察しながら顕微鏡の対物レンズをゆっくりと持ち上げます。レンズの埋め込みに成功した動物では、GCaMPを発現する細胞と血管の両方を単一の焦点面範囲内ではっきりと観察できます。一方、オフターゲット移植を行った動物では、GCaMPを発現する細胞の鮮明な画像は焦点面範囲内では観察されませんが、血管は多少の困難を伴います。アウトオブビューレンズの場合、血管もGCaMPを発現する細胞も可視化できず、埋め込まれたGRINレンズに明るいエッジが観察されます。GRINレンズの移植が成功した動物では、約50〜150個の自発的に活性な細胞が、トーンがなくても外側扁桃体の視野内で有意な蛍光変化を示すのが一般的です。トーン提示時に、デルタF画像解析によって決定されたGCaMPシグナルのトーン特異的な変化を示す細胞はごくわずかです。GFP発現AAVをコントロールとしてマウスに注入したマウスで同様の解析を行ったところ、GFP発現細胞は焦点面範囲内で検出され、トーンの有無にかかわらず有意な蛍光変化を示す細胞はありませんでした。GCaMPの発現とGRINレンズの標的化の組織学的検証では、GRINレンズ周辺の脳組織の炎症による組織損傷の兆候は見られませんでした。針やレンズの速度が一定でないと、モーションアーチファクトや画質の低下を引き起こす可能性があります。電動手術アームを使用すると効果的です。ベースプレートの取り付けステップでモバイルホームケアシステムの準備ができていない場合は、ベースプレートの取り付け中にマウスに麻酔をかけるために低濃度のイソフルランガスを使用することができます。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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自由に動くマウスにおけるリアルタイム微小内視鏡的カルシウムイメージング

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匂いプルームをナビゲートするマウスの海馬でのカルシウム信号を記録するミニスコープ

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インビボ マウスの社会的行動を理解するための視床下部での微型顕微鏡によるカルシウムイメージング

学ぶ 自由に動くマウスの扁桃体における生体内カルシウムイメージングの手法。小型顕微鏡を用いて遺伝的に定義された細胞集団の神経活動をリアルタイムで可視化し、感情行動の神経基盤を解明するための効率的なプロトコルを提供します。

自由に振る舞うマウスの扁桃体の頭部小型顕微鏡による生体内カルシウムイメージングに成功

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