マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション
2020年10月6日
ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。
遺伝子トランスフェクションは、神経生物学研究に不可欠なアプローチです。私たちのエレクトロポレーション技術により、有機型海馬スライス培養における目的遺伝子介在ニューロンを検出可能な副作用なしにトランスフェクションすることができます。このプロトコルは、他のシングルセルプロトコルと比較してトランスフェクション効率がはるかに高いですが、それでも比較的安価で簡単に実行できます。
この手法は、細胞の自律メカニズムや経シナプスタンパク質相互作用など、ニューロンの特定の分子的および生理学的機能の理解に関心のある研究者にとって有用です。エレクトロポレーション用のスライス培養物を調製するには、目的の培養インサートを900マイクロリットルの培養液を充填した個々の3cmシャーレに移し、培養物を卓上型二酸化炭素インキュベーターに入れます。次に、3.5 cmのシャーレで、インサート1枚につき1 milliliterのスライス培養培地を含む新鮮な培養インサートを少なくとも30分間インキュベートし、エレクトロポレーションリグのラインを10%漂白剤で5分間滅菌します。
灌流の最後に、イオン化オートクレーブ水でラインを少なくとも30分間すすいでから、0.001ミリモルのテトロドトキシンを含むフィルター滅菌ACSFで灌流します。エレクトロポレーターのパルスをマイナス 5 ボルトの振幅、方形パルス、500 ミリ秒の列、50 ヘルツの周波数、500 マイクロ秒のパルス幅に設定します。ガラスピペットに5マイクロリットルのプラスミド含有内部溶液を入れ、先端を数回軽くフリックして軽くたたいて、閉じ込められた気泡を取り除きます。
解剖顕微鏡を使用してチップが損傷していないことを確認し、ピペットチップを電極にしっかりと取り付けます。チップがACSFに接触したら、エレクトロポレーターのピペット抵抗読み出しを記録します。スライス培養物を単離するには、鋭利な刃で培養インサートメンブレンを切断し、鋭角の鉗子を使用してスライス培養物を慎重にエレクトロポレーションチャンバーに移します。
次に、スライスアンカーで培養位置を固定します。目的の細胞のエレクトロポレーションには、口からピペットに陽圧を加え、3次元ノブコントロールを使用してピペットの先端をスライス培養物の表面近くまで操作します。顕微鏡で培養物を観察し、先端で標的細胞に近づき、細胞表面にくぼみが形成されるまで陽圧をかけ続けます。
ディンプルが可視化されたら、ピペットチップと原形質膜の間に緩いシールが形成されるように、口から軽度の陰圧をすばやく加えます。メンブレンはピペットにわずかに入ります。ピペットの初期抵抗が約2.5倍に増加し、スピーカーからのトーンの増加によって示されます。
ディンプルが再形成されるように、すぐに陽圧を再適用します。次に、一時停止せずに、先ほど示したように、少なくともさらに2回の圧力サイクルをすぐに完了します。最後の圧力パルスの後、負圧を1秒間保持します。
スピーカーからのトーンがピッチの安定した頂点に達したら、フットペダルを使用してエレクトロポレーターをすばやくパルスします。エレクトロポレーション後、圧力をかけずにピペットを細胞から約100ミクロン静かに引っ込め、正圧を再度加えて、抵抗がベースラインの読み取り値と同様であることを確認してから、次の細胞に近づきます。目的の細胞をすべてエレクトロポレーションしたら、スライス培養物を準備した新鮮な培養インサートの1つに移し、インサートを摂氏35度で最大3日間置きます。
この代表的な実験では、EGFPを海馬CA1領域の5〜20個の錐体ニューロンに、7日、14日、21日のin vitroスライス培養年齢にわたってトランスフェクションしました。パルブアルブミンと小胞性グルタミン酸3型介在ニューロンも、海馬CA1領域内でエレクトロポレーションに成功します。興味深いことに、トランスフェクションはin vitroスライス培養年代の影響を大きく受けず、CA1錐体ニューロンで観察されるトランスフェクション効率と差はありません。
ニューロンは非常に壊れやすいです。細胞に近づいて圧力サイクルし、ピペットの先端を引っ込めて深刻な損傷を引き起こすときは、非常に慎重かつ穏やかでなければなりません。エレクトロポレーション後、細胞は電気生理学やイメージングなど、さまざまな実験的分析を行うことができます。
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概要
本論文では、器官培養海馬スライス培養における興奮性および抑制性ニューロンの両方への遺伝子導入を可能にする、シングルセル電極法（単一細胞エレクトロポレーション）のプロトコルを提示します。この手法により、遺伝子発現の精密な制御が可能となり、さまざまな発達段階における細胞自律的なメカニズムと細胞間相互作用の両方の研究が促進されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 遺伝子導入
- 電気生理学
背景
- 遺伝子導入は、神経生物学的研究において極めて重要です。
- エレクトロポレーションは、副作用を最小限に抑えつつ、高い導入効率を実現します。
- この手法は、他の手法と比較して比較的簡便かつ低コストです。
- ニューロンにおける分子機能および生理的機能を理解することは、神経生物学において不可欠です。
研究目的
- 神経細胞集団において効率的な遺伝子導入法を確立すること。
- 興奮性ニューロンおよび抑制性ニューロンの両方における特異的な分子機能とメカニズムを解析すること。
- スライス培養の異なる齢における導入効率を評価すること。
使用した手法
- 器官培養海馬スライスにおいてエレクトロポレーションを実施した。
- 主要な生物学的モデルとして、錐体ニューロンおよび介在ニューロンを用いた。
- さまざまな培養期間（in vitroで7日、14日、21日）のスライスを用いてトランスフェクションを評価した。
- 詳細な手順には、準備、ピペッティング技術、および抵抗値の変化のモニタリングが含まれる。
- 慎重な操作により、プロセス中の細胞損傷を最小限に抑えた。
主要な結果
- スライス培養の期間による有意な差はなく、標的ニューロンにおいて高い遺伝子導入効率が達成されました。
- エレクトロポレーションは生存率に悪影響を及ぼさず、導入後の細胞の完全性が維持されました。
- 本手法により、生理学的反応およびニューロン間の潜在的な相互作用メカニズムに関する詳細な研究が可能となりました。
- parvalbumin（PV）陽性ニューロンおよび小胞性グルタミン酸型3（VGluT3）インターニューロンへの導入成功も実証されました。
結論
- 本研究では、神経細胞培養における遺伝子導入の堅牢なプロトコルを提示し、神経生物学の研究能力を向上させます。
- この手法は、神経細胞のメカニズムおよび細胞間機能に関するさらなる研究の基礎を築くものです。
- これらのプロセスを理解することは、神経可塑性への洞察や潜在的な治療への応用において極めて重要です。
よくある質問
産業界における重要性
器官培養海馬スライスにおける単一細胞エレクトロポレーションにより、興奮性および抑制性ニューロンへの精密な遺伝子導入が可能となり、神経科学研究におけるターゲットの検証およびメカニズムのデリスキングを支援します。この手法は、発生段階を通じて高い導入効率（約80%）を実現し、パスウェイ解析のための整合性のある表現型スクリーニングおよびアッセイ開発を可能にします。本アプローチは、疾患に関連するニューロン系において再現性のある定量的な遺伝子発現研究を可能にすることで、初期のターゲット仮説検証における生物学的不確実性を低減します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：海馬の興奮性ニューロンおよびクラス特異的な抑制性ニューロンにおける治療仮説の検証が可能になります。
- 科学的価値：無傷の微小回路において遺伝子発現を生理学的指標に結びつけることで、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
- 運用的価値：検出可能な副作用なく高い導入効率を達成し、実験的なばらつきを低減します。
- 運用的価値：スライス培養のさまざまな期間（in vitroで7～21日）で適用可能であり、ターゲットへの作用の経時的な研究が可能です。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 下流の電気生理学およびイメージングアッセイに向けて、バリデートされた神経系を調製する。
- 科学的価値： 遺伝子機能およびタンパク質相互作用に関する定量的で単一細胞解像度のデータを提供する。
- 運用的価値： 標準的な電気生理学機器を使用するため、既存のワークフローへの拡張可能な統合が可能である。
- 運用的価値： 長期の培養期間にわたってトランスフェクション効率を維持し、縦断的なスクリーニングキャンペーンをサポートする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：病態生理学的背景における標的メカニズムを研究するための、疾患に関連した海馬回路を提供する。
- 科学的価値：シナプス間タンパク質相互作用および細胞自律的メカニズムの評価を可能にする。
- 運用的価値：トランスフェクション後のニューロンの健全性を維持することで、発見から前臨床検証までの継続性を促進する。
- 運用的価値：初代ニューロン培養における信頼性と再現性のある遺伝子導入により、リスクを調整した進展決定を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、標的仮説の検証からリード化合物の同定に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、化合物スクリーニング前にメカニズム面でのリスク低減を可能にします。
- 探索生物学：海馬ニューロン集団における仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：化合物評価のために、再現性のあるトランスフェクションと定量的な出力を持つ、アッセイ可能なシステムを提供します。
- 分析：耐性に基づくモニタリングと電気生理学的読み取りを可能にし、遺伝子発現と機能的表現型を相関させます。
- トランスレーショナルリサーチ：器官型スライスへの安定的なトランスフェクションを通じて、遺伝子機能研究を前臨床への継続性に結びつけます。
- 企業の再利用：既存の電気生理学インフラを活用し、本手法をニューロン標的バリデーションのための再利用可能なプラットフォームとして位置づけます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：一次ニューロンにおける高効率かつ低毒性の遺伝子導入により、標的バリデーションにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用の価値：パルスパラメータと圧力サイクルプロトコルの一定化による、標準化と再現性の確保。
- 戦略的価値：ニューロンの標的エンゲージメントにおけるメカニズム的な曖昧さを排除し、より精緻なgo/no-go判断を可能にする。
- ポートフォリオへの影響：様々なニューロンクラスおよび発達段階における遺伝子機能の信頼性の高い評価を通じた、リスク調整後の優先順位付け。
実施上の検討事項
- 単一細胞のターゲット指定には、電気生理学およびマイクロピペット操作の専門知識が必要です。
- ガラス電極、エレクトロポレーター、およびニューロンの生存率を維持するためのテトロドトキシン含有滅菌ACSFに依存します。
- ユーザー間での圧力パルスシーケンスの標準化および抵抗値のモニタリングが必要です。
- 最適化の検討事項として、異なるニューロンの種類や遺伝子サイズに応じたプラスミド濃度およびパルス幅の調整が挙げられます。
- 実際的な制限：ニューロンは脆弱であるため、圧力サイクル中の細胞膜破裂を避けるために細心の技術が求められます。
