Name: 生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶ ウェッジ型脳スライス法による神経回路の生体内接続を模倣したインビトロ実験。パッチクランプ電気生理学と組織学的検証により、前シナプス結合を保持しつつシナプス入力を測定する革新的な手法です。

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この研究は、NIHの壁内研究プログラム、NIDCD、Z01 DC00091(CJCW)によって支援されました。

すべての実験手順は、国立神経疾患研究所と脳卒中/国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所動物のケアと使用委員会によって承認されました。
1. 実験準備
注:スライス液、スライス温度、スライスインキュベーション温度、装置(など)を含むスライス調製物に関する詳細は、本実験で行う脳幹製剤に特有のものです。スライスインキュベーションの詳細は、実験室での経験ごとに変更することができます。
<ol><li>パッチクランプ用の内部ソリューションを準備します。<ol>
<li>(mM)76 Cs-メタンスルホン酸、56 Cs-メタンスルホン酸、56 CsCl、1 MgCl2、1CaCl2、10HEPES、10 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、5 Na2-ホスホクレアチン、5 QX-314、および0.01アレクサフルオール-48ヒドラズを含む準備用クランプ溶液。CsOH で pH を 7.2 に調整します。</li>
		<li>(mM)125 K-グルコン酸塩、5 KCl、1 MgCl 2、0.1 CaCl2、10HEPES、1 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、1 Na2-ホスホクレアチン、および0.01アレクサフッ素-4888ヒドラズ化を含む電流クランプ溶液を準備します。KOH で pH を 7.2 に調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>寒天4gを100mL熱い(沸騰寸前)水に加えて、4%寒天の100mLを準備します。加熱撹拌プレートに置き、温度を維持し、完全に溶解するまでかき混ぜます。約1センチの深さに100ミリメートルプラスチックペトリ皿に注ぎ、冷却してみましょう。必要になるまで冷蔵します。</li>
	<li>mMに含まれる1 L人工脳脊髄液(ACSF)を調製:124 NaCl、1.2 CaCl 2、1.3 MgSO4、5KCl、26 NaHCO3、1.25KH2PO4、および10デキストロース。カルボーゲン(5%CO2 / 95%O2)を10分以上のバブルで、必要に応じて1 M NaOHで最終pHを7.4に調整します。実験中にカルボーゲンと連続してバブリングすることにより、溶液の酸素化とpHを維持します。</li>
	<li>ACSFに1 mMキヌレン酸を加えて200 mLのスライス溶液を準備します。キヌレニック酸が溶解するまで10分間の超音波水浴中のソニッケート溶液。カルボゲンで連続して泡立ち、氷の上に置きます。 注意:キヌレン酸を取り扱う際には、適切な個人用保護具を使用してください。</li>
	<li>製造元の指示に従って、ビブラートの中に適切なブレードを取り付けます。氷で囲んでビブラートメスライスチャンバーを冷やします。</li>
</ol>2. 刺激のための無傷の聴覚神経根を伴う脳除去
注:これらの実験のためのマウスは、TdTomatoレポーターマウス(Ai14)とC57BL / 6JバックグラウンドでChAT-IRES-Creトランスジェニックマウスを横断することによって得られた。病態および電気生理学に用いられるマウスは、マウスのP12の周りにある聴聞後発症(P14-P23)であった。このマウスライン57では、トラベゾイド体の腹側核(VNTB)にtdTomatoを発現するニューロンがMOCニューロンとして以前に特徴付けられてきた。
<ol><li>安楽死(例えば、CO2 窒息)と承認された制度的処置を使用して動物の首を切る。</li>
	<li>カミソリの刃を使用して、頭蓋骨の中線の皮膚を鼻から首の後ろに切ります。皮をむいて頭蓋骨を露出させます。</li>
	<li>小さいはさみを使用して、頭蓋骨の基部(脊髄付近の尾端)から始まり、鼻に向かって続く中線を通して頭蓋骨の切開を行います。</li>
	<li>ラムダ縫合糸では、正中線から頭蓋骨を切り取り、両側の耳に向かって横方向に切り傷を付けます。頭蓋骨を剥がして脳を露出させる。</li>
	<li>ロストラルの端から始めて、小さなラボヘラまたは鈍い鉗子で頭蓋骨から脳をそっと持ち上げます。視神経を切り、脳を後方に穏やかに働き続け、腹側表面を露出させる。</li>
	<li>脳幹の腹側表面付近で細かい鉗子でつまんで三叉神経を切る。 注:前庭の神経はこのすぐ下にあり、最終的な刺激のためにそのままである必要がありますので、これを慎重に行ってください。</li>
	<li>冷たいスライス溶液で満たされたガラスペトリ皿に準備を入れます。皿を解剖顕微鏡の下に置きます。カルボーゲンでやさしく泡立つ。</li>
	<li>脳幹に近い顔面神経をトリミングし、前庭神経を露出させます.</li>
	<li>細かい鉗子を使用して、前庭神経が頭蓋骨を可能な限り出る前庭に先端を押し込み、神経をつまんでそれを切断し、神経根を脳幹に取り付けたままにします。反対側でこれを繰り返します。</li>
	<li>両方の神経根が解放されたら、台形の体の近くの脳幹の腹側表面から髄膜および血管系を取り除きます。</li>
	<li>残りの脳神経をつまみ、可能であれば残りの脊髄を維持するために注意を払って結合組織をつまんで頭蓋骨から脳を完全に解放する。</li>
</ol>3. ステージ上の脳をブロックし、マウント (磁気ディスク)
<ol><li>視性チアズムのレベルで脳をブロックすることによって、ステージに固定する脳の表面を準備します。<ol>
<li>腹側の表面を上にして、鈍いツールを使用して脳を安定させ、次のステップで脳が傾かないように脊髄を穏やかに固定化します。</li>
		<li>視性耳盛りのレベルでは、オープン鉗子を使用して、脳を通して皿の底まで挿入することによって脳を遮断するための平面を作成します。先端が脳の尾部の表面を視キアズムに出るように、垂直から約20°の角度で鉗子を挿入します。</li>
		<li>カミソリの刃を使用して鉗子に沿ってカットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステージの表面に脳を接着します。<ol>
<li>脳を支える小さなブロック(約1cm3)の4%寒天を準備します。</li>
		<li>ステージ上に接着剤の小さな滴を置き、脳と寒天ブロックの両方を接着できるように長方形に広げます。</li>
		<li>鉗子を使用して、慎重に脳を持ち上げ、ペーパータオルの端を使用して余分な液体を穏やかに手を出します。ブロックされた表面を接着剤の上に置くと、腹側の表面はスライス中にブレードの方になります。</li>
		<li>寒天ブロックを脳の後ろ面にそっと押し付けて、スライス中にそれを支え、適切な脳の位置(すなわち角度)を確保します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4.スライス脳は、ウェッジスライスを作成します
注:厚い側に内痛神経根があり、内側オリボコクレア(MOC)ニューロンと台形体の内側核(MNTB)が薄い側にあるビブラートームを使用して脳スライスを準備します。
<ol><li>脳を取り付けた磁気ディスクをステージベースに置き、ブレードに向けて脳の腹側表面を持つスライスチャンバーに置きます。</li>
	<li>チャンバーに氷冷スライス液と気泡をカルボゲンで充填します。</li>
	<li>ブレードを溶液に下げ、スライスが対称であることを確認するために、関心のある領域にスライスをカットします。スライスが非対称に見える場合は、ステージを少し傾けて対称性を得ます。 注:0.05〜0.10 mm/s間のブレード速度は、健康なスライスを切断するのに有効であり、動物の年齢や脳領域によって異なる場合があります。</li>
	<li>スライスが対称になったら、ステージを15°(ステージベースの約3つの同心円状リングに対応)を片側に移動します。 注:スライスに保存したい聴覚神経根からステージを離します。</li>
	<li>聴覚神経根が片側の表面に近づくまで慎重にスライスを続け、顔面神経が反対側の表面に見える。</li>
	<li>ステージを元の位置に 15° 戻します。</li>
	<li>ブレードをティッシュから離れ、ステージベースを90°回転させ、薄い側の横端がブレードに向かるようにします。ブレードを数百ミクロン下げし、ゆっくりと刃を組織の端に近づけます。刃が横端に触れるまでこれを繰り返します。ブレードをスライスの薄いエッジの所望の厚さに下げ、ここでさらに200ミクロンを下げます。 注:得られたスライスは、パッチクランプが行われる側の台形体(VNTB)の腹側核のレベルで300mmの厚さを理想的にしています。</li>
	<li>ブレードを組織から離して戻し、ステージベースを後ろに回転させ、腹側表面が向き合う。</li>
	<li>ウェッジスライスのロストラルサーフェスを指定するカットを行います。スライスをインターフェイスペーパー(1 cm2)の表面に移します。スライスをインキュベーションチャンバーまたは他の適切なインキュベーション装置に移動して回収(35°Cで30分) 注: 顔面神経は、鼻の表面のスライスの両半球に表示される必要があります( 図1Bを参照)。</li>
</ol>5. 電気生理学のセットアップと記録
<ol><li>ウェッジスライスを記録チャンバーに置き、ハープまたは安定化システムでスライスを固定します。7-10 mL/minの速度で組織を継続的に浸透させ、暖かい(35°C)のACSFをカルボーゲンで泡立たします。</li>
	<li>パッチクランプ記録用に561 nmのエミッションフィルタを使用して、VNTBの遺伝的に標識されたMOCニューロンを同定します。パッチ可能なセルがない場合は、スライスを反転します。</li>
	<li>DIC視を使用して、スライスの厚い側の聴覚神経根に焦点を当て、マイクロマニピュレータを使用して双極タングステン刺激電極を聴覚神経根に下に移動させ、組織の表面にそっと移動させます。 メモ:吸引電極は、他の研究室での聴覚神経刺激実験で使用されています。他の特定の製剤に適用可能であれば、Thetaガラス電極、または光学的刺激方法を採用することができる。</li>
	<li>ビューのフィールドを VNTB に戻して、パッチクランプ電気生理学の対象となる MOC ニューロンを選択します。</li>
	<li>提案された実験に適した内部溶液で記録ピペットを充填します。</li>
	<li>全細胞構成におけるMOCニューロンからのパッチおよび記録。必要に応じて、膜容量と直列抵抗を補償します。</li>
	<li>聴覚神経根の電気刺激振幅を調整して、MOCニューロン内で一貫した昼寝イベントを得る。 メモ:刺激電極を動かす必要があるかもしれません。</li>
	<li>MOC(電圧クランプ)またはアクション電位パターン(電流クランプ)で起こされるシナプス電流を観察するために適切な刺激プロトコルを実行します。 注:ウェッジスライスの調製は、緩いパッチ記録、薬理学、光遺伝学、カルシウムイメージング、神経伝達物質の非老化などの典型的なパッチクランプツールで使用することができます。</li>
</ol>6. 脳幹核の組織学的確認
注:これは固定された、再セクションのくさびのスライスで、クレシルバイオレット染色で行われます。この方法はスライスに含まれている核の視覚化を可能にする。
<ol><li>ウェッジスライスを調製した後、一晩固定剤(PBSで4%PFA)でスライスを水没させます。PBSでスライス3倍を10分間リンスし(シェーカーの室温)、PBSで一晩30%スクロースを4°Cでかけ、凍結保護します。</li>
	<li>凍結マイクロトーム(40-70 mm)でスライスを再切り離し、PBSの24ウェルプレートにシリアルセクションを収集します。</li>
	<li>ゼラチンコーティングスライドにセクションをマウントし、完全に乾燥させます。スライドをスライドキャリッジに配置します。</li>
	<li>クレシルバイオレット溶液を準備する<ol>
<li>500 mL dH2Oに5gのクレシルバイオレットアセテートを混合して1%クレシルバイオレットアセテートを調製</li>
		<li>まず90 mL溶液A(540 mL氷酢酸+ 89.46 mL dH2O)および10 mL溶液B(10 mLdH2Oで136mg酢酸ナトリウム)を調製して酢酸緩衝液を調製した。アセテートバッファーを生成する溶液 A と溶液 B を組み合わせます。</li>
		<li>酢酸緩衝液中に0.5%クレシルバイオレットの1%クレシルバイオレットを酢酸バッファーと1%クレシルバイオレットを組み合わせます。使用前にフィルタします。</li>
		<li>適切なdH2Oの100%エタノールを希釈することにより、95%と70%エタノールを調製</li>
	</ol>
</li>
	<li>クレシルバイオレット染色プロトコルを実行します。スライドキャリッジをソリューショントレイを通して移動し、ペーパータオルに余分な溶液を吸い込みます: xylene – 5分;95% エタノール – 3 分;70% エタノール – 3 分;dH2O – 3分;0.5% クレシルバイオレット溶液 – 8-14 分の頻繁に核染色が濃紫色になるまで監視;dH2O – 3分;70% エタノール – 3 分;95% エタノール – 1-2 分;100%エタノール - ディップスライド2回;キシレン – 5分;キシレン:取付が行われるまで25分。 注意:ヒュームフードの下でのみキシレンを使用してください。</li>
	<li>一度に1つずつキシレンからスライドを取り外し、すぐに取り付け媒体を使用してスライドにカバースリップを置きます。取り付け媒体を乾燥させます(一晩)。</li>
	<li>画像セクション。</li>
</ol>7. 生きている、固定されていない組織の軸索の前向きのトレースのためのバイオシチンの標識
<ol><li>上記のようにウェッジスライスを準備します(ステップ2-4)。</li>
	<li>スライスをインターフェイス用紙に転送します(〜1 cm2)。解剖顕微鏡の下で、スライスの厚い側にCNを見つけます。</li>
	<li>ティッシュペーパーの角をひねって、組織から ACSF を引き離して、スライスの周囲の領域から余分な ACSF を慎重に取り除きます。これは、CN外の細胞への取り込みにつながる可能性のあるスライスの周囲の領域に広がるバイオシチンを防ぎます.</li>
	<li>微細な鉗子で、バイオシチンの小さい結晶を選び、CNの表面に置く。水晶を組織にそっと押し込んで、ニューロンとの接触とその後のソマタへの取り込みを促進します。このステップを繰り返して、目的の領域(この場合はT-ステラートおよびGBCニューロンを含むCN領域)をカバーする。</li>
	<li>スライスをインキュベーションチャンバーに置きます。35°Cで2〜4時間インキュベートし、バイオシチンの取り込みと輸送を可能にします。インキュベーション後、ACSFでスライスをすすいで、バイオシチン粒子を除去します。</li>
	<li>スライスを固定剤(PBSで4%PFA)に一晩入れます。PBSで10分間3倍のリンス。</li>
	<li>PBSで一晩4°Cまたはスライスが沈むまで30%スクロースでスライスをクライオプロテクト。</li>
	<li>70-100 mmで凍結マイクロトーム上の横断切片を生成するために組織を切除します。</li>
	<li>蛍光結合ストレプトアビジンを用いた標準的な免疫組織化学的方法を用いたプロセス組織。 注:回路ビジュアライゼーションに重要なシナプス前細胞体、軸索、受容体、またはその他のシナプス分子の標識に役立つ場合は、追加の免疫組織化学をセクションで行うことができます(すなわち、一次抗体ステップはバイオシチン二次可視化に悪影響を及ぼすべきではありません)。</li>
	<li>組織を画像化します。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するスライス手順は、ウェッジスライスと呼ばれ、無傷のシナプス前神経回路を維持するために強力であるが、神経機能の分析のための脳スライス実験のアクセシビリティを有する。回路解析の準備の有用性を最大限に高めるためには、いくつかの初期ステップで細心の注意を払う必要があります。ウェッジの寸法は、シナプス前核とその軸索突起の両方が準備されたウェッジスライス内に含まれていることを確認するために不可欠である組織学的検査を使用して確認する必要があります。投影が切断された場合や、ターゲット核に到達する軸索の数が少ない場合、スライスジオメトリは修正を必要とする場合があります。より一般的には、ウェッジスライスのビブラートメの仕上げカットは非常に重要です。最適なウェッジスライスの準備は、既知の脳のランドマークに基づく設定の調整と共に、ステージベース上の同心円マーキングの使用を含むビブラートーム構成の一貫した使用の組み合わせを必要とします。スライス幾何学の最適化後、18個のウェッジスライスのうち8個で聴覚神経根を電気的に刺激することによって誘発されるMOCニューロンの一貫したPSCを記録した。これまでの研究では、MOCニューロン<sup class="x...

神経回路の活動の観察は、理想的には、生体内の脳領域間のネイティブ感覚入力とフィードバック、および無傷の接続性で行われます。しかし、神経回路の単一細胞分解能を与える実験を行うことは、無傷の脳における技術的な課題によって依然として制限されている。生体内の細胞外電気生理学または多光子イメージング法は、インタクト神経系の活動を調査するために使用できますが、異なる入力がどのように統合されるかの解釈や閾値以下のシナプス入力の測定は困難なままです。インビボ全細胞記録はこれらの制限を克服するが、容易にアクセスされる脳領域でさえ、実行することは困難である。単一細胞分解能実験の技術的課題は、脳の深部に位置する特定のニューロン集団、または生体内の細胞を見つけるために遺伝的ツールを必要とする空間的に拡散集団(例えば、オプトロード記録と組み合わせたチャネロドプシンの遺伝的発現)または標識を記録した後のポストホックの細胞化学的同定(例えば神経伝達特異的マーカーを有する)でさらに増幅される。脳幹の腹側表面の近くに拡散して位置している内側オリボコクリア(MOC)ニューロンは、上記の制限1に苦しんで、生体内実験のためにアクセスすることは非常に困難です。
脳のスライス(約100〜500μmの厚さ)は、同じスライス2、3、4、5、6、7、8、9に含まれる接続ニューロンの物理的な分離のために、聴覚脳幹回路を含む脳回路を研究するために長い間使用されてきました。より厚いスライス(>1 mm)を用いた実験は、内側優れたオリーブ10,11を含む優れたオリバリ複合体(SOC)の領域における二国間入力の統合方法を理解するために他の研究室で採用されている。これらのスライスは、聴覚神経(AN)の軸索がスライス内にそのまま残り、CNでシナプス神経伝達物質の放出を開始するために電気的に刺激されるように調製され、音に反応する第一次聴覚ニューロンの活性を模倣した。これらの厚いスライスの1つの大きな欠点は、パッチクランプ電気生理学的記録(「パッチング」)のためのニューロンの可視性です。この領域の多数の軸索が12歳、13歳、14歳、15歳でミリン化され、典型的で薄い脳スライスでも組織が光学的に密で隠れたニューロンを作り出すにつれて、パッチ適用はますます困難になります。私たちの目標は、インビボ録音の回路接続性に似ていますが、脳スライスの視覚的にガイドされたパッチクランプ電気生理学の高スループットと高解像度の記録能力を備えたインビトロ製剤を作成することです。
私たちの研究室では、MOCニューロンを含む聴覚系のニューロンの生理学を調査しています。これらのコリン作動性ニューロンは、外毛細胞(OHCs)16、17、18、19、20の活性を調節することによって、内毛にフィードバックを提供する。以前の研究では、この変調は、21、22、23、24、25、26および音響外傷から27、28、29、30、31、32、33からの保護における利得制御の役割を果たしていることを示している。マウスにおいて、MOCニューロンは、聴覚脳幹1の台形体(VNTB)の腹側核に拡散的に位置する。我々のグループは、TdTomatoレポーターマウスラインと交差するChAT-IRES-Creマウスラインを利用して、エピ蛍光照明下の脳幹スライス中のMOCニューロンを標的にしました。MOCニューロンは、立ち上がる台形体のイプシラテラ内側核(MNTB)から、逆側内頭核(CN)34、35、36、37、38の球状ふさふさ細胞(GBC)からの軸索によって、アッフェレント阻害性入力を受け取っていることを示した。さらに、MOCニューロンは、反側CN39、40、41のT-ステラート細胞から興奮性入力を受け取る可能性が高い。これらの研究は、MOCニューロンが同じ(対側)耳に由来する興奮性および阻害性入力の両方を受け取る。しかし、シナプス前ニューロンとMOCニューロンに収束する軸索は、典型的なコロナスライス調製物で完全に無傷であるほど互いに近くはない。MOCニューロンへのシナプス入力の統合が、新たに説明された阻害に焦点を当てて、その作用電位の発火パターンにどのような影響を与えるかを調べるため、可能な限り生理学的に現実的な方法で、インビトロ脳スライス実験の技術的利点を持つ、片耳からMOCニューロンに多様な異なるアファレントを刺激できる製剤を開発しました。
ウェッジスライスは、MOCニューロンの回路統合の調査のために設計された修正された厚いスライス調製物です(図1Aでスキーマ化)。スライスの厚い側には、末端の神経とシナプスから脳幹に入ると、内神経(以下「聴神経根」と呼ばれる)の切断された軸索が含まれています。聴覚神経根は、神経伝達物質放出を誘発し、完全に無傷のCN42、43、44、45、46の細胞のシナプス活性化を誘発するように電気的に刺激することができる。この刺激形式には、回路解析にはいくつかの利点があります。まず、MOCニューロンに対して発泡性の入力を提供するT-stellateおよびGBC軸索を直接刺激するのではなく、ANを刺激して、CNに豊富な固有回路の活性化を可能にします。これらの回路は、MOCニューロン46、47、48、49、50、51を含む脳全体の目標にCNニューロンの出力を調節する。第二に、ANからMOCニューロンのCN上流を通るアッフェラプス回路の多シナプス活性化は、聴覚刺激中に生体内で起こるように、より自然な活性化タイミングと可塑性がこれらのシナプスで起こることを可能にする。第三に、AN活動を模倣するために刺激パターンを変えることができます。最後に、MOCニューロンに対する興奮性および阻害的なモノラル投影は、ウェッジスライス内でそのままであり、その統合はパッチクランプ電気生理学の精度を有するMOCニューロンで測定することができる。全体として、この活性化スキームは、典型的な脳スライス調製物と比較してMOCニューロンに、より無傷の回路を提供する。この脳幹のくさびのスライスはまた、横方優れたオリーブ、優れたオリバリー核および内側優れたオリーブ10、11、52、53、54、55、56を含むイプシララルMNTBから阻害的な入力を受ける他の聴覚領域を調査するために使用することができる。当社の具体的な準備を超えて、このスライス法は、長距離入力の接続性を維持し、さまざまな単一細胞分解能電気生理学またはイメージング技術のためのニューロンの視覚化を改善するという利点を持つ他のシステムを評価するために使用または変更することができます。
このプロトコルは、約15°傾けることができるビブラートの段階またはプラットフォームの使用を必要とします。ここでは、市販の2ピース磁気ステージを使用し、「ステージ」は凹型磁気「ステージベース」に配置された湾曲した底を持つ金属ディスクです。ステージをシフトしてスライス角度を調整できます。ステージベースの同心円は、再現的に角度を推定するために使用されます。ステージとステージベースは、磁気ステージベースも回転させることができるスライスチャンバーに配置されます。

<table><tbody><tr><td>Experimental Preparations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, powder</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP1423500</td><td>ビブラトーム切片化中に脳組織を安定させるために使用される4%寒天ブロック</td></tr><tr><td>AlexaFluor Hydrazide 488</td><td>Invitrogen</td><td>A10436</td><td>MOCニューロンパッチの成功を確認するために内部溶液中で使用されたフルオロフォア</td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Genesesサイエンティフィック(Intramalls)</td><td>AV114</td><td>計量化学薬品</td></tr><tr><td>両刃カミソリ刃</td><td>テッドペラ</td><td>121-6</td><td>ビブレータカッティングブレード</td></tr><tr><td>キヌレン酸(5g)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>K3375-5G</td><td>スライス ACSF添加剤 解剖およびスライス中のニューロン活動を減らすために使用され、パッチクランプのための組織の健康を改善します</td></tr><tr><td>pHメーター</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック(イントラマルス)</td><td>13-620-451</td><td>溶液pHテスター</td></tr>プラスチックペ<tr><td>トリ皿100mm径X 20mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(イントラモール)</td><td>12-556-002</td><td>4%寒天準備</td></tr><tr><td>攪拌ホットプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(イントラモールズ)</td><td>11-500-150</td><td>4%寒天調製</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><強>解剖およびスライス</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオシチン</td><td>シグマのための加熱Aldrich</td><td>B4261-250MG</td><td>軸索トレースに使用される薬品(ストレプトアビジン488に結合)</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Amscope</td><td>SM-1BN</td><td>脳除去中の精密解剖用</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-20</td><td>ファイン鉗子解剖ツール</td></tr><tr><td>エコノミーピンセット #3</td><td>WPI</td><td>501976</td><td>鉗子解剖ツール</td></tr><tr><td>ガラス ペトリ皿 150mmdia x 15mm H</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>08-747E</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>インターフェースペーパー (203 X 254mm PCTE 膜 10um)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1220823</td><td>スライスインキュベーション/バイオシチンアプリケーション</td></tr><tr><td>ライカ VT1200S ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>1491200S001</td><td>ウェッジスライスセクショニング用バイブローム</td></tr><tr><td>メイヨーハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-6872</td><td>解剖ツール</td></tr><tr><td>片刃炭素鋼ブレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)</td><td>12-640</td><td>解剖用カミソリ刃</td></tr><tr><td>試料ディスク、ライ</td><td>カ</td><td>14048142068</td>向き 再現<td>可能な傾斜のための専用ビブラトームステージ</td></tr><tr><td>Spoonula</td><td>FisherSci</td><td>14-375-10</td><td>解剖ツール</td></tr><tr><td>スーパーグルー</td><td>Newegg</td><td>15187</td><td>ビブラトームステージ</td></tr><tr><td>に組織を接着するために使用されるVannasの春はさみ</td><td>のファインサイエンスツール</td><td>91500-09</td><td>解剖ツール</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気生理学</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1R 直立共焦点顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td></td><td>電気生理学およびイメージング顕微鏡は、電気生理学</td></tr><tr><td>と互換性のある任意の顕微鏡にすることができます電極ホウケイ酸ガラス、フィラメント外径1.5mm、内径1.1mm、長さ10cm</td>の<td>サッターインストゥルメント</td><td>BF150-110-10</td>パッチ<td>クランプピペットガラス</td></tr><tr><td>電極フィラーMicroFil</td><td>WPI</td><td>CMF20G</td><td>パッチ電極ピペットフィラー</td></tr><tr><td>インラインソリューションヒーター</td><td>ワーナーインスツルメンツ(GSAdvantage)</td><td>SH-27B</td><td>スライス灌流システムヒーター</td></tr><tr><td>マルチマイクロマニピュレーターシステム</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>MPC-200 MP285</td><td>パッチクランプ・刺激電極配置用マイクロマニピュレーター</td></tr>付き <tr><td>P-1000 ガラスマイクロピペット用横型ピペットプーラー</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td>FG-P1000</td><td>パッチクランプピペッタープーラー</td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ&ソフトウェア</td><td>HEKA</td><td>EPC-10 / Patchmaster Next</td><td>任意のアンプ・ソフトウェアが可能</td></tr><tr><td>レコーディングチャンバー</td><td>ワーナーインストゥルメンツ</td><td>RC26G</td><td>録音中のスライス「バス」</td></tr><tr><td>レコーディングチャンバー ハープ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>640253</td><td>電気生理学録音中にスライスを安定させます</td></tr><tr><td>スライスインキュベーションチャンバー</td><td>カスタムビルド</td><td></td><td>スライス後の回復中のスライス用の加熱された酸素化された保持チャンバー</td></tr><tr><td>刺激隔離ユニット</td><td>A.M.P.I.</td><td>電気生理学のための</td><td>Iso-Flex</td> 刺激隔離ユニット</tr><tr><td>シリンジ 60CC</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック (Intramalls)</td><td>14-820-11</td><td>電気生理学灌流流体処理</td></tr><tr><td>温度調節器</td><td>ワーナー・インスツルメンツ (GSAdvantage)</td><td>TC-324C</td><td>スライス灌流システム 温度調節器</td></tr><tr><td>チューブ 1/8 OD 1/16 ID</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック (絶縁体)</td><td>14-171-129</td><td>電気生理学灌流流体ハンドリング</td></tr><tr><td>タグステン同心円バイポーラマイクロ電極</td><td>WPI</td><td>TM33CCINS</td><td>電気生理学</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック (Intramalls)</td><td>12-556006</td><td>組織学スライス収集と免疫染色</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td><td>Jackson Immuno labs</td><td>016-540-084</td><td>バイオシチン可視化のための二次抗体</td></tr><tr><td>Corning Orbital Shaker</td><td>Sigma</td><td>CLS6780FP</td><td>免疫組織化学攪拌用シェーカー</td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td><td>C5042-10G</td><td>組織学用細胞染色</td></tr><tr><td>使い捨てミクロトームブレード</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-210-052</td><td>スライド式ミクロトームブレード</td></tr><tr><td>フィルターシリンジ Nalgene 4mm 酢酸セルロース 0.2um</td><td>フィッシャーサイエンティフィック (Intramalls)</td><td>09-740-34A</td><td>記録ピペットに内部溶液を充填するためのシリンジフィルター</td></tr><tr><td>フルオロマウント-G スライド取り付け媒体</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>OB100-01</td><td>免疫組織化学蛍光取り付け 中</td></tr><tr><td>ラック付きガラススライド染色皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック (Intramalls)</td><td>08-812</td><td>Cresyl Violet染色室</td></tr><tr><td>Microm HM450 スライド式ミクロトーム</td><td>ThermoFisher</td><td>910020</td><td>組織学用凍結ミクロトーム</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー ガラス 長方形 50mm X 24mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック社製 (Intramalls)</td><td>12-543D</td><td>組織化学スライドカバーガラス</td></tr><tr><td>パーマウント 封入剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP15-100</td><td>クレシルバイオレット切片 取付中</td></tr><tr><td>スーパーフロスト スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>22-034980</td><td>組織学スライド</td></tr></tbody></table>

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

インビトロスライスの電気生理学の技術は精密な電気および時間的決断の単細胞活動を測定する。脳スライスは、パッチクランプやイメージングのためにニューロンを適切に視覚化してアクセスするために比較的薄くする必要があり、脳回路のインビトロ検査は急性スライスに物理的に存在するものだけに限定されます。シナプス前核の大部分を維持しながらインビトロスライス実験の利点を維持するために、我々は新しいスライス調製物を開発した。この「ウェッジスライス」は、脳幹の内側オリボコクレア(MOC)ニューロンへの多様なモノラル、音駆動入力を特徴付けるために、パッチクランプ電気生理学の録音用に設計されました。これらのニューロンは、対側耳および対応する人工内核(CN)における刺激によって活性化されたニューロンから、その主要な刺激性および抑制性入力を受ける。非対称の脳スライスは、1つの半球の横端にあるロストロ・カウダル領域で最も厚く、反対側の半球の横端に向かって薄く設計されました。このスライスには、厚い側に、聴覚神経根が脳に聴覚刺激に関する情報を伝え、本質的なCN回路、および逆MOCニューロンに収束する不活性化および三シナプス阻害性の両方の経路が含まれている。記録は、スライスの薄い側のMOCニューロンから行われ、一般的なパッチクランプ実験のためにDIC光学を使用して視覚化されます。聴神経の直接刺激は、聴神経の脳幹に入る時に行われ、MOCニューロンのシナプス上流で本質的なCN回路活性およびシナプス可塑性が起こることを可能にする。この技術により、in vivo回路の活性化をスライス内で可能な限り近づけることができます。このウェッジスライス調製物は、インビトロスライス生理学の技術的利点と組み合わせて、回路分析が上流接続性と長距離入力の保存の恩恵を受ける他の脳回路に適用可能です。

ウェッジスライスの組織学的検査 聴覚脳幹ニューロン機能の調査のために、ウェッジスライス製剤は、記録対象のMOCニューロンに対する聴覚神経根およびCN反局面を含むように設計された(図1Bに示すスライスの例)。最初の組織学的検査は、スライスが回路活性化に必要な核を含み、軸索突起がそのままであることを確認するために重要である。CN内の2つの細胞タイプは、MOCニューロンに音情報を提供する。T-ステレート細胞は、MOCニューロン39、40、41、58に興奮性入力を提供するために仮説を立てる。球状ふさふさした細胞(GBC)は、逆半球のMNTBニューロンを励起する(保持シナプスの特殊なcalyxを介して)34、36、37、38、59、60であり、MOCニューロン...

ニューロンへの多様なシナプス入力の統合は、自然なタイミングと回路の可塑性のためにすべてのシナプス前核を保存する準備で最もよく測定されますが、脳スライスは通常、多くの接続を切断します。インビボ回路活性を模倣しながら、インビトロ実験能力を維持する修飾脳スライスを開発しました。

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

脳スライス実験は、高い電気的および時間的分解能を有する神経機能の尋問を可能にするが、これらのスライスは通常、多くのシナプス前接続を切断する。くさび状のスライスは、より無傷のシナプス前回路を維持します。この修飾された脳のスライスは、視覚誘導パッチクランプ記録、薬理学、および活動イメージングなどのインビトロ実験の利点を提供しながら、より完全な生体様神経回路を維持します。正確なウェッジスライス幾何学は、回路内のニューロンのアトラス位置に基づいて推定することができるが、シナプス前のスキーマと軸索の完全性は、構造学を使用して決定されるべきである。まず、カミソリの刃を使用して、頭蓋骨の正中線の皮膚を鼻から首の後ろに切り取ります。頭蓋骨を露出させるために皮膚を剥がし、頭蓋骨の基部から始まり、鼻に向かって続き、小さなはさみを使用して中線を通して頭蓋骨の切開を行います。ラムダ縫合糸では、正中線から両側の耳に向かって左右に頭蓋骨を切り取り、頭蓋骨を剥がして脳を露出させます。鼻孔の端から始めて、小さなラボのヘラを使用して頭蓋骨から脳を静かに持ち上げ、視神経を切断できるようにします。脳を穏やかに後方に働き続け、腹側表面を露出させ、細かい鉗子を使用して脳幹の腹側表面付近の三叉神経を慎重につまんで切断する。冷たいスライス溶液で満たされたガラスペトリ皿に準備を入れ、解剖顕微鏡の下に皿を置きます。脳幹に近い顔面神経をトリミングして、前庭神経を露出させます。痕跡神経が頭蓋骨を可能な限り出る前庭に先端を押し込むために細かい鉗子を使用してください。脳幹に取り付けられた神経根を残して、両側の神経を切断するためにピンチ。台形体近くの脳幹の腹側表面から髄膜と血管系を取り除きます。その後、残りの脳神経と結合組織をつまんで頭蓋骨から脳を完全に解放し、可能であれば残りの脊髄を維持するように注意します。ステージにフィクスチャのための脳の表面を準備するには、脳腹側を上に置き、脳組織を安定させるために脊髄を穏やかに固定化するための鈍いツールを使用します。脳を通して約20度の角度で開いた鉗子を皿の底に挿入し、先端が脳の背側表面を視チアズムに出て、カミソリの刃を使って鉗子に沿って切断するようにします。次に、4%寒天の1立方センチメートルブロックを準備し、ステージ上の長方形に接着剤の小さな滴を広げます。鉗子を使用して慎重に脳を持ち上げ、余分な液体をペーパータオルの端でそっと手を出します。次に、ブロックされた表面を接着剤の上に置き、腹側の表面がスライス中にブレードの方向に向くようにし、寒天ブロックを支持体として後側の表面にそっと押し付けます。厚い側の内腔神経根と内側のオリボコクレアニューロンと台形体の内側核を薄い側に置いてくさびのスライスを取得するには、取り付けられた脳を持つ磁気ディスクをステージホルダーに置き、脳の腹側

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明...

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

このビデオは、実験室の設定でくさび形の脳スライスを準備するプロセスを示しています。ビブラートームを使用して、マウスの脳からくさび形のスライスをさまざまな厚さで作成します。このスライスには、太い方の端にある聴覚神経根が含まれており、細い方の端には聴覚関連のニューロンが配置されています。...

聴覚ニューロンを可視化するためのくさび脳スライスの準備

このビデオでは、マウスの脳スライスにおけるレチノゲン酸シナプスとコルチコゲン酸シナプスの電気生理学的記録について説明しています。背側外側膝状核(dLGN)を含むスライスは、記録チャンバーに入れられます。刺激ピペットは、網膜神経節細胞(RGC)を刺激して網膜性シナプスを調査するための視路または皮質ニューロンを刺激して皮質性シナプスを調査するための視床網核のいずれかに配置されます。刺激を受けると、RGCと皮質ニューロンは興奮性神経伝達物質を放出し、LGNリレーニューロンにシナプス電流を生成します。これらの電流は、パッチクランプ記録ピペットを使用して記録されます。...

マウス脳切片における網膜形成型および皮質形成型シナプスの電気生理学的研究

このビデオは、マウス脳のくさびスライスの内側の乏蝸牛ニューロンの聴覚神経根を刺激し、シナプス後電流を記録するためのプロトコルを示しています。...

マウス脳ウェッジスライスにおける聴神経根刺激とシナプス後電流記録

ここでは、器官型スライス培養技術を用いて海馬の出生後の神経新生を研究するための技術が記載されている。この方法では、成人の神経新生のin vitro操作を可能にし、培養海馬への薬理学的薬剤の直接適用することができます。...

生後神経発生の研究のための器官型スライス培養

急性脳切片におけるシナプス結合ニューロンのパッチクランプ記録と同時細胞内バイオサイトン充填により、それらの構造的および機能的特性の相関分析が可能になります。このプロトコルの目的は、ニューロンのマイクロ回路からの電気生理学的記録とその後の形態学的分析の本質的な技術的ステップを説明することです。...

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。...

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

マウスの下-中間海馬からの急性スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この横断的な準備を、記録の質と記録されたニューロンの形態学的特徴の保存の観点からコロナスライスと比較する。...

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で...

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

学ぶ ウェッジ型脳スライス法による神経回路の生体内接続を模倣したインビトロ実験。パッチクランプ電気生理学と組織学的検証により、前シナプス結合を保持しつつシナプス入力を測定する革新的な手法です。

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

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