Name: バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学ぶ、バイオレット励起DNA結合色素とFACSを用いてマウス精子細胞を高純度に分離する方法。減数分裂と精子形成の分子メカニズムを研究するための低毒性プロトコルです。

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名川、吉田、前沢の研究室のメンバーの皆さんに、ご協力いただき、ありがとうございました。原稿を編集するためのケイティ・ゲルハルト;H1T抗体を共有するためのメアリー・アン・ヘンデル、シンシナティ小児病院医療センター(CCHMC)研究フローサイトメトリーコアは、NIH S10OD023410がサポートするFACS機器を共有するための。科学研究のための助成(KAKENHI;17K07424)からT.N.へ。ラロール財団A.S.へのポスドクフェローシップ;アメド・クレスト(JP17gm1110005h00001)からS.Y.へ;麻布大学研究サービス部、文部科学省(MEXT)支援の私立大学研究ブランディング事業(2016~2019年)支援プログラム、研究活動立ち上げ助成(19K21196)、武田科学財団(2019年)、上原記念財団研究奨励助成(20.M 18)による研究プロジェクト助成金国立衛生研究所 R01 GM122776 to S.H.N.

このプロトコルは、制度的動物の世話と使用委員会のガイドラインに従います(プロトコルいいえ。IACUC2018-0040)シンシナティ小児病院医療センターで。
精巣細胞懸濁液の調製のための装置および試薬のセットアップ
<ol><li>各酵素ストックを1xハンクスバランスソルト溶液(HBSS)で準備し、-20°C(表1)に保管する。 注: 実験の前にいつでも準備してください。</li>
	<li>実験の1日前:一晩4°Cで胎児ウシ血清(FBS)を用いたチューブ(1.5mLチューブ)をコーティングします。</li>
	<li>実験当日:水浴を37°Cに設定します。</li>
	<li>37 °Cでプレウォームダルベックの修正イーグルミディアム(DMEM)を調製し、使用前に各サンプルに対して2mLの1x解離バッファーを調製します(表1)を15 mL遠心管に入れます。 注: 2 つの mL 解離バッファーは、2 つのテスト用に用意されています。解離バッファのレシピについては、 表1を参照してください。</li>
</ol>2. 動物の解剖と精巣細胞懸濁液の調製
<ol><li>生後8週間の雄マウスを、二酸化炭素室に少なくとも10分間放置して犠牲にします。</li>
	<li>両方の精巣を取り除き、2 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む60 mmのペトリ皿に置きます。</li>
	<li>精巣からチュニカアルブギネアを取り除く。鉗子で穏やかに分離することによって、半生管をわずかに分散させます。</li>
	<li>半細管を100mmペトリ皿に移し、氷冷PBSを新たに滴下し、半生卵管を鉗子で優しく解き放つ。この洗浄を3回繰り返して、できるだけ間質細胞を取り除きます。</li>
	<li>2 mLの解離緩衝液を含む15 mLチューブ内の非タングされた半細管を37°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>1000 μL マイクロピペットを使用して、チューブを 20 回軽くピペットします。</li>
	<li>6分間インキュベートします。穏やかなピペットを20回繰り返します。</li>
	<li>3分間インキュベートします。目に見えるチャンクが残らないまで、穏やかなピペットを10回繰り返します。</li>
	<li>10 mL の FACS バッファをサスペンションに追加します。室温で5分間 300×g の遠心分離機を使用し、上清を捨てます。</li>
	<li>ステップ2.9を2回繰り返して、精子とできるだけ多くの破片を取り除く。</li>
</ol>3. 細胞染色
<ol><li>FACSバッファーの3 mLでセルペレットを再懸濁し(表1)、70 μmナイロンセルストレーナーを通して50 mLチューブにセル懸濁液をフィルターします。 注:予想される細胞収量は、2つの睾丸あたり約1億個の細胞(8週齢のB6野生型マウス由来)です。</li>
	<li>細胞数を数え、細胞の10%を新しいチューブに分割し、染色されていない陰性対照として氷の上に残します。</li>
	<li>DCV染色の6 μL(元の濃度は5mM)を残りの細胞懸濁液に加え、よく混ぜます。最終濃度は10μMで、容量は約1億個の細胞です。</li>
	<li>暗闇の中で30分間37°Cでインキュベートします。10分ごとに細胞懸濁液を軽く振ります。</li>
	<li>インキュベーション後、洗浄工程を行わずに、5 μL の DNase I (ストック濃度は 10 mg/mL)をセルサスペンションに直接加え、35 μm ナイロン メッシュ キャップを通して 5 mL FACS チューブにセルをフィルターします。サンプルは、ソートまで氷の上に保管してください。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーと実験ゲート
<ol><li>FACS セルソーターを準備します。FACS細胞選別機が励起光学を装備していることを確認してください: バイオレット (405 nm) レーザー;検出光学:450/50バンドパスのフィルターの組み合わせ[DCV-青検出のための4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)の同じフィルタセット]と665/30バンドパス[DCV-赤色検出のためのアロフィコシアニン(APC)の同じフィルタセット]。ここでは、例としてソニーSH800Sセルソーターを使用しています。</li>
	<li>新しい実験を作成し、最適化するパラメータを表示する作業プロットを設定します: "ワークシートツール" メニューバーの 「新しい密度」 をクリックして、前方散布 - 面積 (FSC-A) と背面散布 - 領域 (BSC-A) 密度プロットを直線スケールで作成します。[新しいヒストグラム] をクリックして、対数スケールの DCV-blue ヒストグラム プロットを作成します。</li>
	<li>(ステップ3.2から)未染色の陰性コントロールを簡単に渦を出し、サンプルをロードします。</li>
	<li>[開始] と [レコード] をクリックして、未染色サンプルの処理を開始します。サンプルの実行中に「検出器としきい値の設定」をクリックして、光増倍管(PMT)電圧を上下に調整してFSCとBSCの電圧を最適化し、未染色セルをFSC/BSCプロットのスケールに配置します。</li>
	<li>サンプルが実行されている間にPMT電圧を上下に調整して、DCV-blue ヒストグラム対数プロットの最初の 10 年間の DCV 負母集団の位置を特定します (図 2A)。PMT 電圧調整が完了したら、"Stop"をクリックして、染色されていないサンプルをアンロードします。</li>
	<li>サンプルを簡単に渦(ステップ3.5から)、サンプルをロードします。</li>
	<li>DCV染色サンプル用の新しいワークシートを作成するには、「次のチューブ」をクリックします。DCV染色サンプルを取得するには、「開始」と「レコード」をクリックして、1 x 106のイベント≥記録します。次の作業プロットを追加する:「ワークシートツール」メニューバーの「新しい密度」をクリックして、直線スケールでFSC-H(高さ)とFSC-W(幅)密度プロットを作成します。線形スケールで DCV-blue と DCV-赤色の密度プロットを作成するには、「新しい密度」をクリックします。1 × 106個≥イベントを記録した後、[停止] をクリックしてサンプルをアンロードします。</li>
	<li>FSC-A と BSC-A 密度プロットで、[ "プロット ツール" メニュー バーの "ポリゴン" をクリックして、大きなゲート "セル" を描画して、ほとんどのセルを含め、小さな破片を除外します (図 2B)。ゲート "セル" を FSC-H と FSC-W 密度プロットに適用します。単一セル以外のセルを除外するには、[四角形] をクリックして "単一セル" のゲートを描画します (図 2C)。</li>
	<li>「単一セル」のゲートをDCV-blueとDCV-赤色の密度プロットに適用し、図2Dに示すように拡張プロファイルをキャプチャするようにスケールを調整します。[ プロットツール] メニュー バーの[ ポリゴン] をクリックして 、 "DCV" ゲートを描画し、染色されていないセルとサイドの母集団を除外します (図 2D)。</li>
	<li>線形スケールで DCV-青ヒストグラムプロットに"DCV"ゲートを適用します。3つの主要なピークは、異なるDNA含有量を指します: 1C, 2C, 4C (図2E)。</li>
	<li>線形スケールで DCV-blue と DCV-赤色の密度プロットを作成し、図2Eからバックゲートを実行して 1C および 4C の母集団を見つけるためにDCVゲートを適用するには、「新しい密度」 をクリックします (図 2F)。「楕円」をクリックして、凝縮されたエリア(ゲート1C)内にある1C集団にゲートを描画します。「ポリゴン」をクリックして、連続した曲線(ゲート4C)である4C集団にゲートを描画します。</li>
	<li>線形スケールで DCV-blue と DCV-赤色の密度プロットを作成し、「4C」ゲートを適用するには、「新しい密度」をクリックします。拡大する縮尺を調整し、より正確な選択のために "4C_1" ゲートを描画するには[ポリゴン] をクリックします (図 2G) 。</li>
	<li>「新しい密度」をクリックして、新しいFSC-AとBSC-A密度プロットを線形スケールで作成し、「4C_1」ゲートを適用します。レプトテン(L)/ジゴテン(Z)、パキテン(P)、ジプロテン(D)精子に対応するサイズで分離された3つの濃縮集団があります。「多角形」または「楕円」をクリックして、拡大するサイズに基づいて「L/Z」、「P」、および「D」の3つのゲートを描画します(図2H)。</li>
	<li>「新しいドットプロット」をクリックして、DCV-blueとDCV-赤色のカラードットプロットを線形スケールで作成してゲートを適用し、3つの母集団が「4C_1」ゲート内の連続した順序であることを確認します(図2I)。</li>
	<li>同様に、1C の人口に対しては、新しいFSC-Aと BSC-A 密度プロットを線形スケールで作成し、"1C" ゲートを適用し、細胞の統一されたサイズを純粋な円形の精子集団として選択し、"楕円" をクリックして "RS" ゲート ( 図2J) を描画します。</li>
</ol>5. 男性生殖細胞の亜集団を並べ替える
<ol><li>500 μL 50% FBS を含む 1.5 mL チューブをセルコレクション用に準備し、コレクションチューブをコレクターにロードし、「負荷収集」をクリックします。</li>
	<li>"次のチューブ" をクリックします, " 開始 "レコード" と "並べ替え開始" をクリックします。コレクションデバイスに同時に関心のある2つの集団をソートできる双方向システムを使用する場合は、L/ZおよびPバックゲートに基づくレプトテン(L)/ジゴテン(Z)とパキテン(P)精子細胞のペアワイズの組み合わせに従ってください。RSおよびDバックゲートに基づく円形精子(RS)およびジプロテン(D)精子。</li>
	<li>サンプルの実行中に、最も効率的な並べ替えを行うために、流量を ~3000 イベント/s に調整します。</li>
</ol>6. 並べ替え細胞の純度分析
<ol><li>10,000個のセル/各集団≥収集します。細胞免疫染色を行い、サブステージを確認する。</li>
	<li>4°Cで5分間300 x g の遠心分離機を使用し、チューブの底部に約110μLの液体を入れ、上清を慎重に捨てます。</li>
	<li>細胞懸濁液を10μL滴で取り、顕微鏡下で観察し、概略細胞の形態と数を評価します。</li>
	<li>100 μLのセル懸濁液を各サンプルチャンバースライド( 材料表参照)に塗布し、チャンバーをCytospinにロードします。</li>
	<li>室温で5分間、30 x g でサンプルを回転させます。疎水性ペンでセルの周りに円を描きます。実験室のベンチの乾いたスライドは、室温で数分間行います。</li>
	<li>スライドの円の中にPBSの50 μLをドロップし、タップオフします。</li>
	<li>スライドの円に一次抗体溶液(PBSに5%ロバ血清を含む希薄な一次抗体、0.02%ポリソルベート20)を加え、一晩4°Cでインキュベートします。 注:大細胞精子細胞のサブステージを判断するために、SYCP3は、大尾染色体軸のマーカーである、およびDNA損傷応答のマーカーであるγH2AXを検出した。(抗体の働き濃度については、 材料表を参照してください。</li>
	<li>スライドから一次抗体溶液をタップします。</li>
	<li>スライドの円の中にPBSの50 μLをドロップし、タップオフします。1 回繰り返します。</li>
	<li>二次抗体溶液(0.02%ポリソルベート20のPBSで希薄二次抗体)をスライドの円に加え、暗い1時間室温でインキュベートします。</li>
	<li>スライドの円の中にPBSの50 μLをドロップし、タップオフします。1 回繰り返します。</li>
	<li>50 μL の DAPI(ストック濃度は 0.1 μg/mL)の染色を 5 分間追加し、タップオフします。</li>
	<li>スライドに1~2滴の取り付けメディアを追加します。取り付けメディアをカバーガラスで慎重に覆い、カバーガラスを軽く押して、余分な取り付けメディアと気泡を取り除きます。スライドは顕微鏡評価の準備ができています。</li>
</ol>

<ol><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+The+Commitment+to+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li>
<li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186(2020).</li>
<li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li>
<li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125(2018).</li>
<li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li>
<li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648(2013).</li>
<li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li>
<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experimments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602(2011).</li>
<li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li>
<li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization%2C+staging%2C+and+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li>
<li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821(2019).</li>
<li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li>
<li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations%3A+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294(2016).</li>
<li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li>
<li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li>
<li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li>
<li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li>
<li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81(2016).</li>
<li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami%3A+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18%2C446%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40(2013).</li>
<li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li>
<li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233(2018).</li>
<li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+premature+G2%2FM-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

ここでは、単一の成人男性マウスから精子と精子の亜集団を分離するための実用的で簡単なプロトコルを提示する。このプロトコルの再現性を確保するために、注意が必要な重要な手順がいくつかあります。酵素消化の前に、洗浄ステップは間質細胞を除去することを目的としている。消化後、このステップは精子や破片を除去するのに役立ちます。洗浄/遠心分離3回が重要です。当社の解離バッファーレシピでは、いくつかの異なる酵素の組み合わせは、過剰な細胞損傷を伴わない単細胞懸濁液への精巣の解離を促進します。気泡を引き起こさないように穏やかにピペット化することもまた細胞の完全性を保護するのに役立ちます。解離後の細胞懸濁液を顕微鏡で確認し、懸濁液が単細胞レベルを達成していることを確認してください。不完全な解離または過剰な消化からの破片汚染は、ソートされた細胞の純度に影響を与えます。 図S2に示すように、直立集団には精子の破片および四量体が含まれている。DCV染色は暗闇の中でインキュベーションを必要とし、その後は洗濯を行いません。
精子亜集団の格下および逆行の潜在的な困難をトラブルシューテ...

精子形成は、精子幹細胞の小集団が成人期を通じて多数の精子の連続的産生を1,2に持続する複雑なプロセスである。精子形成の間に、動的クロマチンリモデリングは、精子原性細胞が子宮内膜を産生するために、3、4、5を産生するために、ミオサシスを受けたときに起こる。メオティック精子細胞の単離は分子学的調査に不可欠であり、沈め込みベースの分離6、7、蛍光活性化細胞選別(FACS)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17を含む、複数の異なるアプローチが確立されている。ただし、これらの方法には技術的な制限があります。沈下法による分離は、5、6、7の細胞を多数生成する一方で、労働集約的である。確立されたFACSベースの方法は、DNA含有量および光散乱特性に基づいて微量精子細胞を分離するためにHoechst 33342(Ho342)を使用し、紫外線(UV)レーザー8、9、10、11を備えたFACS細胞選別機を必要とする。代替FACSベースの方法は、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスライン、精子形成12の同期、または生細胞13の単離と互換性のない細胞固定および抗体標識を必要とする。細胞透過性DNA結合色素を用いた別の方法があるが、DyeCycleグリーン染色14、15、16、17のこの方法は、若年精巣から精子細胞を単離するために推奨される。したがって、任意の年齢の任意のマウス株に適用することができ、任意のFACS細胞選別機を使用して実行することができる生きている病変精子細胞のための単純で堅牢な分離方法を開発することが重要な必要性があります。
ここでは、DyeCycleバイオレット(DCV)染色を用いた、このような長い間求められていた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは、低細胞毒性、細胞透過性DNA結合色素はHo342に構造的に類似しているが、励起スペクトルが紫範囲18に向かってシフトしている。さらに、DCVはDCGに比べて広い発光スペクトルを有する。したがって、UVと紫の両方のレーザーで励起することができ、それは、UVレーザーを装備していないFACSセルソーターの使用を可能にする、機器の柔軟性を向上させます。ここで示すDCVプロトコルは、DCVブルーとDCVレッドとの2次元分離を使用し、Ho342プロトコルの利点を模倣しています。この利点により、当社のDCVプロトコルは、成人精巣から高度に濃縮された生殖細胞を分離することを可能にします。我々は、1匹のマウスの成体マウス精巣(2つの精巣から)から生きた精子細胞を分離するための詳細な格言プロトコルを提供する。また、この細胞分離に使用できるマウスのテストからの単一細胞の中断を準備するための効率的かつ迅速なプロトコルについても説明します。手順は、完了する短い時間を必要とします (単一細胞の懸濁液の調製 - 1時間、染料染色 - 30分、および細胞のソート - 2-3時間:合計 - 必要な細胞の数に応じて4〜5時間; 図 1)。細胞分離後、RNA-セク、ATAC-セク、ChIP-セク、および細胞培養を含む広範な下流アプリケーションを完了することができます。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml チューブ</td><td>Watson</td><td>131-7155C</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ペトリ皿</td><td>Corning, Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離チューブ</td><td>Watson</td><td>1332-015S</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ポリスチレンチューブ セルストレーナー スナップキャップ付き (35 & micro;m ナイロンメッシュ)</td><td>コーニング、ファルコン</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離管</td><td>ワトソン</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>60 mm ペトリ皿</td><td>コーニング、ファルコン</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>70 & マイクロ;m ナイロンメッシュ</td><td>コーニング ファルコン</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>セルソーター</td><td>ソニー</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 組換え 動物由来フリー</td><td>富士フイルム和光純薬</td><td>036-23141</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 1型</td><td>ワージントン</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャー</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>Fisher</td><td>D1306</td><td>使用濃度: 0.1 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Σ</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>Σ</td><td>S30-M</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885076</td><td></td></tr><tr><td>Fetal usvine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Histone H1t antibody</td><td>gift from Mary Ann Handel</td><td></td><td>1/2000 diluted</td></tr><tr><td>Hank'平衡塩溶液(HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma</td><td>H3506-1G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-4L</td><td></td></tr><tr><td>ピペットメン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止封入剤</td><td>Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>rH2AX 抗体</td><td>ミリポア</td><td>05-635</td><td>作業濃度:2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>精子受精タンパク質 56 (Sp56) 抗体</td><td>QED Bioscience</td><td>55101</td><td>使用濃度: 0.5 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>滅菌された鉗子およびはさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus 顕微鏡スライド</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>SYCP3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab205846</td><td>作動濃度: 5 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>TWEEN 20 (ポリソルベート 20)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DyeCycle バイオレットステイン (DCV)</td><td>Invitrogen</td><td>V35003</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

バイオレット励起細胞透過性dna結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

メオティック精子細胞の単離は、疾患の根底にある分子メカニズムと精子形成を調べる上で不可欠である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてHoechst 33342染色を使用して確立された細胞分離プロトコルがありますが、紫外線レーザーを装備した細胞選別機が必要です。ここでは、ヘヒスト33342と構造的に類似した低細胞毒性DNA結合色素であるDyeCycle Violet(DCV)染色を用いた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは紫外線レーザーと紫レーザーの両方で励起することができ、紫外線レーザーを搭載していないセルソーターを含む機器の選択の柔軟性を向上させます。このプロトコルを使用すると、レプトテン/ジゴテン、パキテン、ジプロテン精子細胞、およびポストマイオティックラウンド精子を含む、マイオティックプロフェイズIの3つの生細胞亜集団を分離することができます。また、マウスの精巣からの単細胞の中断を準備するプロトコルについても述べた。全体的に見て、この手順は、多くの下流のアプリケーションを容易にする(必要な細胞の数に応じて4〜5時間)完了するまでに短い時間を必要とします。

この分類プロトコルの代表的な結果を図 3に示します。2つの精巣(1つのマウス)の総選別時間は、通常、細胞懸濁液の濃度と並べ替え速度に依存する約3時間である。選別後、SYCP3およびγH2AXの免疫染色により精子細胞の純度が確認される(図3A)。並べ替えられたL/Z、P、D精子の分画の代表純度は、それぞれ約80.4%、90.6%、および87.6%である(図3C)。我々は、我々は以前に公開した基準に基づいて、サブステージを決定しました19.簡単に言えば、レプトテンとジゴテンの段階では、相同染色体間のシナプスは不完全であり、これはSYCP3染色の薄い糸によって示される。広範囲γH2AXドメインは、プログラムされたDNA二本鎖切断のために核クロマチン全体で観察される。パキテインステージでは、相同染色体は完全にシナプスされ、γH2AXは特に性染色体に蓄積する。二プロテン期において、相同染色体は徐々に脱ジナプシスを受ける。R...

ここでは、成人マウス精巣から生の大腸および後の大動脈芽細胞を分離する簡単で効率的な方法を提示する。低細胞毒性、バイオレット励起DNA結合色素および蛍光活性化細胞選別を使用して、多くの下流用途に対して非常に富んだ精子細胞集団を単離することができる。

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

この新しい効率的な方法は、成人マウスから精子細胞および精子の亜集団を単離するために使用され、明腫および精子形成の根底にある分子メカニズムを調べることができる。この方法は、現在使用されているFACSオーダーのほとんどに適用できる広い励起スペクトルを有する低細胞毒性DNA結合色素を使用する。この方法は非常に簡単です。最も困難な側面はフローサイトメトリー格子測定ですが、詳細な格子戦略は、プロトコルを他の細胞選別機に適応させるのに役立つはずです。この手順のデモンストレーションは、名川聡研究室の研究助手、ユハン・イェです。生後8週間の雄マウスから両方の精巣を採取した後、2ミリリットルの氷冷PBSを含む60ミリメートルのペトリ皿に組織を入れ、チュニカアルブギネアを取り除きます。精巣を鉗子でそっと分離し、半細管をわずかに分散させます。そして、100ミリメートルペトリ皿で新鮮な氷冷PBSの滴に尿細管を転送します。鉗子を使用して管状をそっと解き、ちょうど実証したようにPBSの3つの追加の液滴で管を洗います。最後の洗浄の後、37°Cで20分のインキュベーションのために解離緩衝液の2ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに解離されていない半細管を置きます。インキュベーションの最後に、1000マイクロリットルのピペットを使用して細管を20回軽くピペットし、チューブをインキュベーターにさらに6分間戻します。インキュベートの終わりに、チューブをインキュベーターに戻す前に、さらに20回組織をピペットする。3分後、10ミリリットルのFACSバッファーとの解離を停止する前に、尿細管を10回、または目に見えない組織片が残らないまで静かにピペットします。次いで、2回目の洗浄のために新しいFACSバッファーに対して追加の10ミリリットルを使用して組織懸濁液に遠心分離し、精子およびできるだけ多くの破片を除去する。フローサイトメトリック解析のために細胞を染色するには、ペレットをFACSバッファーの3ミリリットルに再懸濁します。そして、70ミクロンのナイロンセルストレーナーを通して、50ミリリットルのチューブに細胞懸濁液をろ過します。カウント後、細胞の10%を氷上の新しいチューブに移し、染色されていない陰性対照として。そして、DCV染色の6マイクロリットルを残りの細胞懸濁液に十分に混合する。暗闇の中で摂氏37度で30分のインキュベーションを行い、10分ごとに穏やかな揺れを起わせた後、5マイクロリットルのDNase Iを細胞に加えます。そして、氷の上の5ミリリットルのFACSチューブに35ミクロンのナイロンメッシュストレーナーを通して細胞をフィルタリングします。セルのフローサイトメトリック解析では、フロー解析ソフトウェアで新しい実験を作成し、ワークシート ツール メニューで新しい密度をクリックして、線形スケールで前方散乱領域と後方散乱領域密度プロットを作成します。新しいヒストグラムをクリックして、対数スケール上に DCV ブルーヒストグラム プロットを作成します。そして、開始と記録をクリックして、染色されていないサンプルの処理を開始します。サンプルの実行中に、検出器としきい値の設定をクリックして、前方散乱と側面の両方の散乱PMT電圧を調整して、未染色セルを前方および背面散乱プロットのスケールに配置します。DCVブルーヒストグラム対数プロットの最初の10年間にDCV負母集団の位置を見つけるには、ジャッピーチャンネルのPMT電圧を調整します。次に、[停止] をクリックして、染色されていないサンプルをアンロードします。染色したサンプルを短時間でボルテックスしてロードした後、次のチューブをクリックして、サンプル用の新しいワークシートを作成します。6つのイベントに対して少なくとも10回取得するようにサイトメーターを設定し、[開始]と[記録]をクリックします。次に、[新しい密度] をクリックして、前方スキャッタの高さと前方のスキャッタ幅を作成します。そして、線形スケールでDCVブルー対DCV赤色密度プロット。前方散乱領域と後方散乱領域密度プロットでは、ポリゴンツールを使用してセルと呼ばれるゲートを描画し、ほとんどのセルを含め、小さな破片を除外します。このゲートを前方散乱高さプロットと前方散乱幅プロットに適用し、長方形ツールを使用して単一セルのゲートを描画し、単一セル以外のセルを除外します。単一セルのゲートをDCVブルーとDCVの赤色密度プロットに適用し、拡張プロファイルをキャプチャするようにスケールを調整します。ポリゴン ツールを使用して DCV ゲートを描画し、染色されていないセルとサイドの母集団を除外し、ゲートを線形スケールで DCV ブルーヒストグラム プロットに適用します。3つの主要なピークは、異なる1C、2Cおよび4C DNA内容物を指す。線形スケールで、第2のDCVブルーとDCV赤色密度プロットを作成します。そして、1Cと4Cの集団を見つけるためにプロットにDCVゲートをバックゲートします。線形スケールで別のDCVブルーとDCV赤色密度プロットを作成します。楕円ツールを使用して、1C の人口にゲートを描画します。ポリゴン ツールを使用して、4C の人口を連続曲線でゲートします。そして線形スケールで別のDCVブルー対DCV赤色密度プロットを作成します。ポリゴン ツールを使用して、4C の 1 つのゲートを作成します。新しい前方散布図では、楕円ツールを使用して、パキテン、ジプロテン、レプトテン、ジゴテン精子細胞のゲートを作成します。すべてのゲートが描画されたら、線形スケールで新しい DCV ブルーと DCV の赤色のカラー ドット プロットを作成し、4C ゲートを適用して、3 つの母集団がゲート内で連続した順序になるようにします。次に、線形スケールで新しい前方散乱面積対後散乱面積密度プロットを作成し、純粋な円形の精子集団として細胞の統一サイズを選択します。選別後、分離されたレプトテン、ジゴテン、パキテンおよびジプロテン精子細胞画の代表的な純粋度は、典型的には、SYCP3およびΓH2AX免疫染色によって確認されるように80%〜90%の間である。丸い精子の固さを確認するには、Sp56およびH1t染色と組み合わせてDCVによる核染色を行い、また、通常90%程度であり、単離細胞集団の生存率は通常95%を超えており、一つの成体マウスからの各分画の平均総収量は、通常、様々な下流分析に十分である。ソートされた細胞は、精子形成中の遺伝子発現および調節をよりよく探求するために、様々な次世代シーケンシング分析に使用することができる。

isolation-murine-spermatogenic-cells-using-violet-excited-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

マウス精巣から高度に精製された実行可能な減数分裂分画を得るために効率的な方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）による洗練された細胞解離のプロトコルを組み合わせています、説明されています。このメソッドは、離散的な減数分裂画分のDNA含量の違いと核密度を利用しています。...

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

酵素および洗剤を回避するげっ歯類の材料から精巣細胞懸濁液を機械的に調製するための新規なプロトコルは、記載されている。この方法は非常に簡単、迅速、再現性があり、フローソーティングおよびRNA抽出のために適している良質の細胞懸濁液を、レンダリングする。...

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

単離および位相コントラストおよび蛍光顕微鏡によって撮像するためのショウジョウバエ精巣サンプル（ライブおよび固定）の製造方法は、本明細書に記載されている。...

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

フローサイトメトリーを用いたマウス精子細胞の選別戦略を記述します。精子細胞は、円形(精子形成ステップ1-9)、早期伸長(精子形成ステップ10-12)、後期伸長(精子形成ステップ13-14)、細長い精子細胞(精子形成ステップ15-16)の4つの高純度集団に分類されます。DNAの染色、サイズ、および顆粒度が選択パラメータとして使用されます。...

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

減数分裂は、DNA 複製の単一の円形および染色体の 2...

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

この研究は、異なる哺乳動物種の精巣組織から精製された生殖細胞集団を得るための方法の標準化を記載している。 Hoechst-33342とヨウ化プロピジウムで染色し、FACSソーティングを組み合わせた単純なプロトコールで、男性の生殖生物学の比較研究に幅広く使用されています。...

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

ここでは、標準的な実験装置を用いて不連続な牛血清アルブミン密度勾配を用いて、成人マウス精巣からパチテン精子細胞、円形精子細胞、および細長い精子を濃縮するためのプロトコルを提示する。...

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエの精細細胞を用いた細胞顕微鏡と固定細胞顕微鏡法により、無傷組織における細胞分裂を解析することである。このプロトコルは、ショウジョウバエ幼虫と初期の子犬から全体の無傷の精巣を分離する方法と、顕微鏡検査のためにそれらを処理し、マウントする方法を示しています。...

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ...

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

本プロトコルは、半日本円上皮周期の特定段階を表す成体マウス半細管の断面微小切除法、およびその中の細胞タイプ、および後にスカッシュ製剤および無傷の管状セグメントの免疫染色を記述する。...

下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離

ここでは、マウスにラウンド精子細胞注入法(ROSI)を行う方法を紹介します。これは、臨床応用が期待され、胚発生のメカニズムを調べるための有用性を持つ技術です。...

マウスラウンド精子細胞注射

学ぶ、バイオレット励起DNA結合色素とFACSを用いてマウス精子細胞を高純度に分離する方法。減数分裂と精子形成の分子メカニズムを研究するための低毒性プロトコルです。

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

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