Name: ウシ卵巣皮質組織培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学ぶウシ卵巣皮質組織培養法。栄養階層ダイエットが卵巣微小環境とステロイド生成に与える影響をin vitroで評価し、7日間の培養で卵胞発達を解析する技術です。

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この研究は、米国国立食品農業研究所2013-67015-20965によって、ASCへのネブラスカ大学健康競争力のある助成金のための食品ASCに支援されました。米国農業ハッチ省は、ASC、ハッチ-NEB ANHL加盟#1002234 ASCにNEB26-202/W3112加盟#1011127を付与します。定量的ライフサイエンスイニシアチブ夏のポスドク学者のサポート - COVID-19 CMSのための夏の資金調達のための賞。
著者らは、この技術を検証する概念実証として現在の論文で使用された以前の出版物で卵巣を提供してくれたことに感謝するために、NE州クレイセンターの米国肉動物研究センターであるロバート・クッシュマン博士に感謝したいと考えています。

卵巣は米国肉動物研究センター16から得られた。16以前に述べたように、すべての手順は、農業研究と教育における農業動物のケアと使用のためのガイドに従って、米国肉動物研究センター(USMARC)動物のケアと使用委員会によって承認されました。卵巣はネブラスカ大学リンカーン生殖研究所に持ち込まれ、そこで処理され、培養されました。
1. 必要なメディアの準備
<ol><li>
ウェイマス MB 752/1 メディア
	<ol>
<li>1 L組織培養ボトルに900mLの滅菌水を充填します。水がかき混ぜる間、徐々に粉状の媒体を加えます。粉末化した培地が溶解したら、2.24gの重炭酸ナトリウムに続いて1.25gのウシ血清アルブミン(BSA)を加える。pHメーターを使用し、pHを7.25-7.35に調整します。滅菌水を追加して最終体積を1 Lにします。</li>
		<li>生物学的安全キャビネットに移動し、ペニシリンストレプトマイシン硫酸塩を培地の0.1%v/vの濃度で添加します。0.22 μmの細孔33.2 cm2 500 mLボトルトップフィルターで媒体をフィルターします。</li>
		<li>ろ過した媒体を複数の50 mL円錐形チューブに注ぎます。アリクォート培地の50mLあたり0.5 mLのインスリントランスフェリンセレンを加える。</li>
		<li>円錐形のチューブとミディアムのストックボトルをアルミホイルで包み、4°Cで保管します。 この媒体は光に敏感である。 注:ウェイマス培地は最大1ヶ月間保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ライボヴィッツのL-15(LB-15)培地 注:LB-15培地は、培養に備えて組織をきれいにするために使用されます。<ol>
<li>1 L組織培養ボトルに900mLの滅菌水を充填します。滅菌水が攪拌板で軽く撹拌されている間、徐々に調製した粉末培地を加える。pHメーターを使用し、pHを7.25-7.35に調整します。滅菌水を追加して最終体積を1 Lにします。</li>
		<li>生物安全キャビネットに移動します。0.1%の抗生物質でLB-15の1 Lを作ります( 材料表を参照)。0.22 μmの細孔33.2 cm2 500 mLボトルトップフィルターを使用して、培地を2本の500 mL組織培養ボトルにフィルターします。LB-15培地としてアルミ箔で包み込みボトルは光に敏感で、4°Cで保存します。 注:LB-15培地は、最大1ヶ月間保存することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
リン酸緩衝生理食塩分 (PBS)
	<ol>
<li>実験室でPBSを作るか、カルシウムやマグネシウムなしで滅菌PBSを購入する (材料の表).ラボでPBSを作るためには、蒸留水800mLから始め、それに8gの塩化ナトリウム(NaCl)を加えます。次に、0.2gの塩化カリウム(KCl)、1.44gのリン酸二塩基ナトリウム(Na2HPO4)、および0.24gのリン酸二塩基カリウム(KH2PO4)を加える。pHを~7.4に調整し、合計体積を1 Lに調整します。</li>
		<li>生物学的安全キャビネットで、0.1%の抗生物質( 材料表を参照)で1 L PBSを作ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 卵巣皮質培養プロトコル
注:卵巣は生後13ヶ月で春生まれのUSMARCハイファーから得られました。卵巣を十分にすすいだし、すべての血液および他の体液を抗生物質を含むPBS(0.1%)で除去し、37°C23でネブラスカ大学リンカーン再生研究所UNL(1.5時間離れた場所)に運んだ。 (輸送中の卵巣の温度に関するコメントについては、議論を参照してください)
<ol><li>きれいなベンチで卵巣組織を準備します(図1)。<ol>
<li>70%エタノールでクリーンベンチを消毒します。ベンチトップに新鮮な吸収パッドを置きます。紫外線と一緒に解剖の30分前にクリーンベンチブロワをオンにして、吸収パッドを含むクリーンベンチ内の何かを殺菌し、適切なPPEが使用されていることを確認してください。</li>
		<li>ペトリ皿(60 x 15mm)を組織洗いのために手配します。PBS洗浄には3つのペトリ皿、抗生物質を用いたPBS用に3つ、LB-15洗浄には3つ必要です。追加のLB-15含有ペトリ皿に付属の蓋が付いたペトリ皿は、洗剤後の作品の最終的な配置に利用されます。</li>
		<li>各ペトリ皿に、PBSまたはLB-15のいずれかの適切な液体の約10 mLを充填します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61668/61668fig01.jpg"> 図1:きれいなベンチで卵巣と皮質片を洗浄するためのプレートのレイアウト。(A)皮質の切片が除去されるので卵巣を洗浄するために使用されるPBS。(B) 皮質片が通過する抗生物質の打ち上がったPBS。(C)卵巣皮質片は、LB-15で最終洗浄のためにバイオセーフティキャビネットに移動する前にLB-15で4回洗浄される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61668/61668fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a> 
<ol start="2"><li>準備したウェイマスとLB-15培地を冷蔵庫から取り出し、室温まで温めます。</li>
	<li>使用前に殺菌を保障するためにすべての用具をオートクレーブ。</li>
	<li>卵巣皮質が採取される準備ができるまで、卵巣を 37°Cで維持する。</li>
	<li>鋸歯状の顎を持つ鉗子を使用して、卵巣を拾い、最初のPBSで満たされたペトリ皿で徹底的に洗います。卵巣を2回目のPBS洗浄に移し、もう一度完全に浄化します。 注:卵巣皮質ストリップが除去されている間、卵巣は2回目のPBS洗浄にとどまります。</li>
	<li>鋸歯状の顎鉗子を使用して、卵巣を固定し、半分にスライスします。このとき、卵巣皮質は髄質から切り離されます。定規を使用して、卵巣の表面の深さの1〜2mm以下が髄質16から離れて取り除かれないようにしてください。卵巣皮質の横切り部分を髄質から取り除き、メス(#11メスブレード;#3ハンドル)で卵巣皮質の3〜4薄いストリップ(図2)を切断し、3番目のPBSで満たされたペトリ皿にストリップを入れます。 注:この時点で、RNA抽出のために追加の卵巣皮質組織を収集するか、または最初の非培養皮質片の組織学のために固定して収集することができます。卵巣皮質のストリップを除去する場合は、目に見える角包または毛小胞体を有する領域を避ける。また、髄質組織の収集は避けてください。髄質の神学は、前に示したように非常に異なっています16.もし卵巣皮質が1~2mm以上の深さに切り込まなければ、髄質は得られないはずです。明確な神学は皮質と髄質の間のランドマークを可能にする。</li>
	<li>3番目のPBSで卵巣皮質ストリップを#21メスブレードで小さな正方形の部分(〜0.5〜1 mm3)に洗います。ペトリ皿の下の定規を使用して、一貫した卵巣皮質片を作るために、同じような大きさと厚さを確認します。メスで切り取りながら、ストリップを固定するために鉗子を使用してください。 注:切断された組織片の数は、実験に依存します。卵巣皮質の4つの部分は、培養に必要な組織の最小量である。適切な長さと深さを確保するための他の方法には、特別なスライサー26 またはプレカットプラスチック片をテンプレート27として使用する方法が含まれます。</li>
	<li>抗生物質で満たされたペトリ皿で3つのPBSすべてを通して卵巣皮質片を洗います。曲面の先端鉗子を使用して、打ち上げの間にピースを移動します。</li>
	<li>一連のLB-15洗い物を通して皮質片を動かし、最終的なLB-15で満たされたペトリ皿に入れます。ふたに動物IDと卵巣側(左または右)でラベルを付けます。 注:徹底的な洗浄のために、各洗浄に卵巣皮質片を完全に水没します。</li>
	<li>卵巣ごとに4つの卵巣皮質片を収集し、ゼロの神学を第一日の固定.追加の部分は、RNA用にフラッシュ冷凍することもできます。残りの組織片は培養に使用されます。各組織採取後に70%エタノールで解剖ツールを拭き取ります。</li>
	<li>最終的な組織洗浄および培養準備のための生物学的安全キャビネットを準備する。生物学的安全キャビネットに入れる前に70%エタノールで供給を消毒してください。生物学的安全キャビネットで作業する場合は、無菌技術を使用してください。</li>
	<li>培養用のすべての卵巣皮質を生物学的安全キャビネットに移動し、LB-15で満たされたペトリ皿でもう一度洗います。</li>
	<li>24ウェル組織培養プレートにおいて、ウェイマス培地のピペット350μLをウェルあたり。</li>
	<li>鉗子を使用して各井戸に塗られていない培養井戸を挿入します。これにより、組織が乾燥することとなるので、挿入物の基部の下に泡が形成されていないことを確認してください。培地は、培地が吸収され、卵巣皮質片を取り囲むことを可能にするために、挿入物に触れている必要があります。</li>
	<li>各インサートのメッシュ上に4つの卵巣皮質片を慎重に配置する(図2)。鉗子はティッシュの部分が敏感に置かれていない場合の網を穿刺することができる。組織片は、互いに、または挿入物の側面に触れてはならない。</li>
	<li>5%CO216で37°Cで組織をインキュベートする。 注:他の人は38.8°C28を使用しています。 しかし、組織の完全性や37°C組織で進行する卵胞の能力に違いは見られなかったが、他の39、30を有する。したがって、この時点でこれらの温度のいずれかが実験の成功を助長する必要があります。他の人は400 μLの媒体を使用した。どちらかの量は一貫性がある限り細かく、組織は部分的に沈み、組織の水和を可能にする十分な表面張力(卵巣皮質片を取り巻くメディア)を可能にする。空の井戸に500 μLの無菌水を充填して、他の井戸からの蒸発を減らします。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61668/61668fig02.jpg"> 図2:卵巣皮質片と培養プレート(A)卵巣の皮質から切り取られた卵巣ストリップ。(B)ルーラーと皮質の部分を並べて表示する。(C)プレート内の培養液中のインサート上に4つの皮質片(約0.5〜1mm3)を置く。(D)インサートを持ち上げて、ウェルから培養培地を収集する。毎日すべての培養培地(250μL)を収集して交換して適切なpHを維持し、毎日各ウェルから約250μLが得られます(初期培養培地の約70%)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61668/61668fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3. メディアコレクション 
<ol><li>卵巣皮質培養培地を毎日7日間変更する。中程度の変更は、大きなpHと色の変化を防ぐために、可能な限り24時間に近い値にする必要があります。温かいウェイマス培地を中程度に変更する前に37°Cにする。毎日約250μLが各ウェルから得られます(初期培養培地の約70%)。</li>
	<li>中程度の変更の際は、鉗子を使用して、インサートをウェルからそっと持ち上げます。培養したウェイマス培地を0.5 mLチューブ(約250μL/日)で回収してください。インサートをうまく戻し、インサートの側面とウェルの間に培地を分配して、350 μLの新鮮な培養培地を加えます。 注:すべてのステロイド、サイトカイン、および卵巣微小環境を決定するために必要なケモカインを測定するのに十分なメディアを得るために毎日メディアのほとんどを変更します。また、日次の培地の変化は、培地中で大きなpH変化(色の変化によって示される)を防ぐために重要である。培地の滴は、部分が濡れたままであることを確認するために、卵巣皮質片を取り囲む保持された。培地の70%の変化による培養組織では問題は認められなかった。</li>
	<li>組織培養から採取した培地を -20°Cで保存する。</li>
</ol>4. イメージングとダウンストリーム処理
<ol><li>5%CO2で37°Cで7日間培養した後、カメラを取り付けた解剖顕微鏡とコンピュータイメージングソフトウェアプログラムを用いて卵巣皮質片を画像化した。 注:暗い部屋は、通常、画像に最適な画質を実現するのに最適です。</li>
	<li>イメージングの後、構造学のためにブインの井戸あたり2つの卵巣皮質片を固定し、液体窒素中の2つの卵巣皮質片をフラッシュ凍結してcDNAのRNAを得る。組織を持つすべての井戸に対してこのステップを繰り返します。7日目から培地を回収し 、-20°Cで保存する。</li>
	<li>卵巣皮質片をブイン(ピクリン酸750 mL、氷酢酸50mL、ホルマリン250mL37%~40%)に浸し、70%エタノールで3回洗浄する前に約1.5時間浸漬します。組織は70%エタノールに残り、溶液が黄色でなくなるまで毎日クリアされます。 注:ブイン以外の固定剤とパラホルムアルデヒドを使用できます。この体験でブインは最適な形態を達成するために固定剤であるとして使用されます。他の分析のためにより多くの組織が必要な場合、各動物から培地および卵巣皮質の断片の追加の井戸を得ることができる。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この原稿に記載されているように、体外卵巣皮質培養の利点は、卵胞が卵胞を取り巻く隣接する間質を有する正常化された環境で発達することです。体細胞と卵母細胞はそのまま残っており、インビボモデルとして適切な細胞間通信がある。我々の研究室は、7日間の培養システムが卵巣皮質の治療のための代表的な卵胞形成およびステロイド生成データを提供することを発見した。他の卵巣組織培養プロトコルは、1〜6日、32または10〜15日5、6、10の長い培養期間が比較的短い培養期間を有する。しかし、我々は、7日を超える培養が組織の劣化、ステロイド生成の減少、および潜在的に汚染の可能性の増加につながることを観察した(データは示していない)。卵巣切除術後の卵巣皮質の培養は、その特定の動物内の卵巣微小環境に関する直接的な洞察も提供する。これは、栄養体制が引き続き発泡し、ハイフ...

卵巣皮質は、卵胞の発生が起こる卵巣の外層を表す1。初期卵胞は、最初に開発中に逮捕され、パラクリンおよびゴナドトロピン入力1、2、3、4に基づいて、一次、二次、および第三次卵胞になるために活性化される。卵巣内の生理学的プロセスをよりよく理解するために、組織培養をインビトロモデルとして使用することができ、それによって制御された環境が実験を行うことを可能にする。多くの研究は、生殖補助技術、生殖能力の保存、および卵巣癌5、6、7の研究のために卵巣組織培養を利用している。卵巣組織培養は、卵巣の健康にダメージを与える生殖毒素を調査するためのモデルとしても役立っており、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)8、9、10、11などの生殖障害の病因と卵巣の健康に損傷を与える。このように、この文化システムは、さまざまな専門分野に適用可能です。
げっ歯類では、胎児全体または周産期生殖腺が生殖生物学実験12、13、14、15で使用されている。しかし、大きな家畜の生殖腺は、その大きさと潜在的な変性のために臓器全体として培養することはできません。したがって、ウシ、および非ヒト霊長類卵巣皮質は、小片16、17、18に切断される。多くの研究は、国内の家畜および非ヒト霊長類1、17、18、19における原始卵胞開始における様々な成長因子を研究するために小さな卵巣皮質片を培養した。卵巣皮質培養の使用は、7日間培養されたウシおよび霊長類皮質片の血清が存在しない場合の原始卵胞開始を20日間も実証した。ヤンとフォーチュン 2006年に10日間にわたってテストステロン用量の範囲で胎児卵巣皮質培養培地を治療し、テストステロンの10-7 M濃度が卵胞の募集、生存、および初期段階の卵胞19の進行を増加することを観察した。2007年、牛胎児(妊娠5~8ヶ月)の卵巣皮質培養物を用いて、ヤンとフォーチュンは、一次から二次卵胞への移行21における血管内皮成長因子A(VEGFA)の役割を報告した。さらに、我々の研究室は、VEGFAアイソフォーム(血管形成、抗血管新生、および組み合わせ)が、VEGFAが結合する主なシグナル伝達受容体であるキナーゼドメイン受容体(KDR)を介して異なるシグナル伝達経路を調節する方法を実証するために卵巣皮質培養を利用した。この情報により、異なるVEGFAアイソフォームが卵胞の進行または逮捕を引き出すシグナル伝達経路にどのような影響を与えるかをよりよく理解することができました。まとめると、異なるステロイドまたは成長因子を用いたインビトロでの卵巣皮質片の培養は、卵胞形成を調節するメカニズムへの影響を決定する貴重なアッセイであり得る。同様に、異なる栄養体制で開発された動物は、卵巣微小環境を変化させ、女性の生殖成熟に影響を与える卵胞形成を促進または阻害する可能性がある。したがって、現在の原稿における我々の目標は、ウシ皮質培養技術を報告し、前述の13ヶ月齢に集められたコントロールまたは階段ステップの食事を与えられたハイファーからウシ皮質のインビトロ培養後に卵巣微小環境に違いがあるかどうかを判断することです。
したがって、我々の次のステップは、異なる栄養食で開発されたこれらのハイファーにおける卵巣微小環境を決定することであった。我々は、階段ステップまたはコントロールダイエットのいずれかで供給されたハイファーからの卵巣皮質を評価した。コントロールハイファーは、84日間97.9 g /kg0.75 のメンテナンスダイエットを提供されました。階段ステップダイエットは、84日間67.4 g /kg0.75 の制限された給餌食を含む8ヶ月で開始されました。最初の84日間、コントロールハイファーは97.9 g / kg0.75を受け取り続けましたが、階段牛ハイファーはさらに68日間118.9 g/kg0.75 を提供され、その後16歳の13 ヶ月で卵巣化され、濾胞期と培養前後の変化を研究しました。我々はまた、ステロイドの違いについてアッセイ, ステロイド代謝物, ケモカイン, 皮質培地に分泌サイトカイン.ステロイドおよび他の代謝物は、生体内および/または生体外で組織の生存率と生産性に対して行われた治療から直接の影響があるかどうかを判断するために測定されました。培養前後の卵巣微小環境の変化は、培養前の内分泌ミリューおよび卵胞形成のスナップショットを提供し、培養中の培養または治療が卵胞の進行または逮捕にどのように影響するかを提供した。
卵巣摘出術が米国で行われた後に卵巣が採取された。 肉動物研究センター(USMARC)は、16歳の13ヶ月でコントロールと階段ステップハイファーからのIACUC手順に従って、無菌リン酸緩衝塩水(PBS)で洗浄し、血液やその他の汚染物質を除去するために0.1%の抗生物質で洗浄し、過剰組織をトリミングし、ネブラスカ大学リンカーン大学(UNL)生殖生理学研究所UNLに運ばれました。.UNLでは、卵巣皮質片を小さな正方形に切断した(〜0.5-1 mm3;図1)7日間培養して(図2)。組織学は、培養前後の皮質培養スライドで行われ、卵胞ステージ16、24(図3および図4)、および線維症を示す細胞外マトリックスタンパク質(ピクロシルスレッド、PSR;図 5.これにより、卵胞ステージに対するインビボ栄養レジームの効果の決定が可能となり、卵胞ステージおよび卵胞進行に対する卵巣皮質の7日間の比較が可能となった。培養を通じて、培地は毎日収集され、変化し(毎日約70%の培地が収集され、250 μL/well)、毎日のホルモン/サイトカイン/ケモカインのいずれかを評価またはプールして平均濃度を得ることができます。アンドロステンジオン(A4)やエストロゲン(E2)などのステロイドは、3日間にわたってプールすることができ、放射性免疫アッセイ(RIA;;図 6)1匹の動物につき4日間にわたってプールし、高性能液体クロマトグラフィー質量分析(HPLC-MS)24、25(表1)を介してアッセイした。サイトカインアレイは、卵巣皮質培養培地26におけるサイトカインおよびケモカイン濃度を評価するために利用した(表2)。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイプレートを実施し、前述の16に示した特定のシグナル伝達経路に対する遺伝子発現を決定した。ステロイド、サイトカイン、卵胞ステージおよび組織学的マーカーのすべては、卵巣微小環境のスナップショットを提供し、その微小環境が「正常」または「異常な」卵胞形成を促進する能力に関する手がかりを提供する。

<table><tbody><tr><td>#11 スケーペルブレード</td><td>スワン・モートン&nbsp;</td><td>303</td><td>スカプルブレード</td></tr><tr><td>#21 スケーペルブレード</td><td>スワン・モートン&nbsp;</td><td>307</td><td>スカプルブレード</td></tr><tr><td>500mL ボトルトップフィルター</td><td>コーニング</td><td>430514</td><td>ボトルトップフィルター 0.22 &micro;ろ過媒体のためのmの細孔</td></tr><tr><td>AbsoluteIDQ Sterol17 Assay</td><td>Biocrates</td><td>Sterol17 Kit</td><td>サンプルはBiocratesに送られ、ステロイドパネルが実行され、結果が返されます&nbsp;</td></tr><tr><td>アンドロステンジオン二重抗体RIAキット</td><td>MPBio</td><td>7109202</td><td>RIAで、培養培地ベルギーA4アッセイキットからアンドロステンジオンを測定&</td></tr><tr><td>nbsp;</td><td>DIAソース&nbsp;</td><td>KIP0451</td><td>RIA 培地からアンドロステンジオンを測定する</td></tr><tr><td>ウシサイトカインアレイ Q3</td><td>RayBiotech</td><td>QAB-CYT-3-1</td><td>サイトカインキット 培地からサイトカインを測定する</td></tr><tr><td>cellSens ソフトウェア標準 1.3</td><td>オリンパス</td><td>7790</td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-X</td><td>Gibco サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>5150056</td><td>培地</td></tr><tr><td>への添加物LeibovitzのL-15ミディアム</td><td>Gibcoサーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4130039</td><td>クリーンベンチでのティッシュ洗浄、およびバイオセーフティキャビネット&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス</td><td>SZX16</td><td>組織培養片のイメージングに用いる分切顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ&nbsp;</td><td>オリンパス</td><td>DP71</td><td>顕微鏡カメラ組織培養片のイメージングに使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート0.4&micro;m、12,mm直径</td>ミリ<td>ポアシグマPICM01250</td><td></td>インサートは<td>、組織がそれに沈むことなく媒体に対して休むことができます</td></tr><tr><td>マルチウェル24ウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td>353047</td><td>プレート メドゥイム、インサート、およびティッシュを保持するために使用される</td></tr><tr><td>プレート ペトリ皿 60 x 15 mm</td><td>ファルコン</td><td>351007</td><td>培養前の洗浄ステップに使用されるペトリ皿</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS 1X)</td><td>コーニング21-040</td><td>-履歴書</td><td>ティッシュ洗濯に使用</td></tr><tr><td>SAS Version 9.3</td><td>SAS Institute&nbsp;</td><td>9.3 TS1M2</td><td>統計解析ソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>トーマス・スタディ・リッグス ティッシュスライサー</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>6727C10</td><td>フレッシュティッシュの薄い均一切片を調製するための組織スライサー</td></tr><tr><td>ウェイマウス MB 752/1 メディウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>W1625</td><td>組織培養に使用されるメディウム</td></tr></tbody></table>

ウシ卵巣皮質組織培養

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

原始から角質段階までの卵胞の発達は、体細胞および積雲細胞卵母細胞コミュニケーションからの内分泌およびパラクリン因子を含む卵巣皮質内の動的プロセスである。卵巣微小環境についてはほとんど知られていないし、周囲のミリューで産生されるサイトカインとステロイドが卵胞の進行または逮捕に影響を与える方法.卵巣皮質のインビトロ培養は、隣接する間質によって支えられているままの正常化された環境で卵胞を発達させることができます。我々の目的は、牛の卵巣皮質のインビトロ培養を通じて、卵巣微小環境(卵胞の発達、ステロイド、およびサイトカイン産生)に対する栄養ステアステップ食の効果を決定することであった。これを達成するために、卵巣皮質片は、思春期前に2つの異なる栄養開発スキームを受けているハイファーから取り除かれました:コントロール(伝統的な栄養開発)と階段ステップ(開発中の給餌と制限)は約0.5〜1mm3 個に切断されました。これらの部分は、その後、一連のウォッシュを通過し、ウェイマスの培養培地を含む井戸に設定された組織培養インサートに配置された。卵巣皮質は、毎日の培養培地交換で7日間培養した。組織学的切除は、追加の治療なしに栄養と文化の影響を決定するために、培養前後の卵胞ステージの変化を決定するために行われました。ステロイドを測定するために皮質培養培地を数日間プール, ステロイド代謝物, サイトカイン.ステアステップ対コントロール卵巣皮質培養で卵胞の進行を可能にする卵巣微小環境でステロイドホルモンの増加の傾向があった.卵巣皮質培養技術は、卵巣微小環境のより良い理解を可能にし、内分泌の変化が生体内およびインビボ治療の両方からの卵胞の進行および成長にどのような影響を与えるかを可能にする。この培養法は、不妊治療を促進するために女性の卵胞の進行を改善する可能性のある潜在的な治療薬をテストするために有益であることが証明されるかもしれません.

この牛皮質培養法は、卵巣の小片から多種多様なホルモン、サイトカイン、および組織学データを決定するために使用することができる。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)のような染色は、卵胞のステージング16、23、31を通して卵巣形態を決定するために使用することができる(図3)。簡単に言えば、卵胞は、扁平上皮前顆粒球細胞の単層に囲まれた卵母細胞である原始子に分類された(0);過渡卵性卵胞または初期の初代は、主に扁平上皮前顆粒球細胞といくつかの立方腺顆粒球細胞に囲まれた卵母細胞である(1);1-1.5層の立方体顆粒球(2)に囲まれた卵子である原発卵胞。二次卵胞は、2つ以上の立方体顆粒球細胞に囲まれた卵母細胞である(3);直径1mm以下のアンタル卵胞は、それぞれ異なるアントルム(4)16、23を含む顆粒球細胞の2層以上<sup...

ウシ卵巣皮質のインビトロ培養と卵巣微小環境に対する栄養ステアステップ食の効果が提示される。卵巣皮質片を7日間培養し、ステロイド、サイトカイン、および卵胞ステージを評価した。ステアステップダイエット治療は、培養中の卵胞の進行をもたらすステロイド発生を増加させました.

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

このプロトコルは卵巣のマイクロ環境の深い検査のイン・バイ・イン・イン・バイ・ガン・ビユーザーが卵胞の成長と発達を決定することを可能にします, ステロイド生成と免疫分子の豊富さだけでなく、.この技術の1つの利点は、卵巣微小環境および新たな卵胞の変化を直接評価し、特定のホルモンの添加によって引き起こされるユニークな相互作用を評価する能力である。この技術は、濾胞の逮捕を引き起こす様々な生殖障害を研究するために使用することができます。例えば、多嚢胞性卵巣症候群。私たちはインビトロで卵巣マイクロ環境を直接評価することができるので、この手順を実証することは、私の研究室の学部研究者ブルック・ベルです。セリングされた顎の鉗子を使用して、卵巣を固定し、半分にスライスし、外側のスライスを取り除き始めます。1~2ミリメートルの表面深さを切り取って、髄質が採取されないようにします。メスで卵巣皮質の3〜4つの薄いストリップをカットし、3番目のPBS充填ペトリ皿にストリップを置きます。スカルデルブレードで0.5〜1立方ミリメートルの小さな正方形の部分にストリップをカットします。ペトリ皿の下の定規を使用して、一貫した卵巣皮質片を作るために、同じような大きさと厚さを確認します。3つのPBSと抗生物質フィールドペトリ皿のすべてで卵巣皮質片を洗浄し、湾曲した先端鉗子を使用して洗浄間のピースを移動させます。一連のLB-15洗い物を通して皮質片を動かし、最後のLB-15で満たされたペトリ皿に入れます。ふたに動物IDと卵巣側のラベルを付けます。卵巣ごとに4つの卵巣皮質片を収集し、日ゼロの神学のためにそれらを修正し、RNA精製のための追加の部分を凍結します。残りの組織片を培養に使用する。最終的な組織洗浄および培養準備のための生物学的安全キャビネットを準備する。生物安全キャビネットに入れる前に70%エタノールで供給を消毒してください。培養用のすべての卵巣皮質片を生物学的安全キャビネットに移動し、LB-15で満たされたペトリ皿でもう一度洗います。24ウェル組織培養プレートにウェイマス培地のピペット350マイクロリットル。コーティングされていない培養をよく挿入する鉗子を使用して、挿入物の基部の下に泡が形成されないようにする。慎重かつ繊細にメッシュを穿刺することなく、各インサートのメッシュ上に4つの卵巣皮質片を配置します。5%の二酸化炭素で37°Cで組織をインキュベートします。卵巣皮質培養培地を7日間毎日変更し、事前に温めたウェイマス培地を使用するようにします。中程度の変更の間、鉗子を使用してインサートをウェルからそっと持ち上げ、培養したウェイマス培地を0.5ミリリットルのチューブで回収します。インサートをウェルに戻し、挿入物の側面とウェルの間に分配することによって、新鮮な培養培地の350マイクロリットルを追加します。採取した培地を組織培養からマイナス20°Cで保存します。7日間培養した後、カメラを取り付けた解剖顕微鏡とコンピュータイメージングソフトウェアプログラムを使用して卵巣皮質片を画像化します。図表に含まれるブインの溶液で1つの卵巣皮質片を修正し、液体窒素中の卵巣皮質片にフラッシュフリーズしてcDNAのRNAを得る。組織とすべての井戸のためにこのステップを繰り返し、7日目から培地を収集し、マイナス20度保存します。卵巣皮質片を約1.5時間ブインの溶液に浸したままにしてから、70%エタノールで3回洗浄し、組織を70%エタノールに保ち、溶液が黄色でなくなるまで毎日それをクリアします。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、原胞卵胞、初期の一次卵胞、一次卵胞、二次卵胞および骨根嚢に対して行われた。卵胞ステージングは、卵胞形成を評価するために培養前および次の培養物に対して固定された卵巣皮質に対して行われた。コラーゲン沈着によって決定される形態の違いは、階段ステップまたはコントロールハイファーからの卵巣皮質における線維症を示すことができる。コントロールと階段ステップハイファーの間で満たされた卵巣皮質あたりのピクロシリウス赤陽性染色の平均領域の比較がここに示されています。毎日の培養培地の収集は、様々なステロイドホルモン産生を評価するために3日間にわたってプールし、放射性免疫アッセイを用いた。ステロイド代謝物およびサイトカイン産生はまた、4日間にわたって培養物をプールした動物ごとに1つのウェルから卵巣皮質培養培地で測定した。組織が座っている時間が長ければ長いほど、一緒に作業するのが難しくなります。正確なカットを練習する必要があるかもしれません。この技術は、過剰なステロイド生成を救助するシグナル伝達経路への影響を理解し、過剰なステロイドがサイトカインおよびケモカイン産生に及ぼす影響を決定し、卵巣組織内の卵胞の進行または逮捕に及ぼす影響を決定するために使用される。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

それらの三次元コンテキストで正常な細胞の培養は、細胞の形質転換および腫瘍形成に必要な初期の事象を研究するための代替メソッドを表します。このメソッドは、卵巣癌の形成の初期イベントを研究するために、通常の卵巣と卵管の細胞を成長させるために使用されます。...

卵巣と卵管の三次元器官培養用アルギン酸ゲル

このプロトコルは、新生児マウスと思春期前のマウスからの個々の卵胞から卵巣を使って、マウスの卵巣組織の初代培養/共培養を説明しています。培養技術は、卵巣上の外因性薬剤の効果の研究を可能にする、高度に生理的な方法で開発を支援し、卵胞の間の相互作用の。...

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

卵巣の組織培養卵胞開発、排卵や卵胞閉鎖のモデルとして使用することができ、卵巣の動的過程の制御機構を示します。...

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

無血清条件下でウシ顆粒膜細胞の長期培養モデルを説明します。このモデルにより、エストロゲン産生特性の異なるめっき密度として多様な因子と条件の効果を研究に研究をウシ顆粒膜細胞。...

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牛の初期のアンタル卵胞からの卵母細胞のための体外培養戦略

前胞形成の研究を進めるには、単一の卵巣から卵胞を分離する効率的な方法が必要です。ここに提示されているのは、組織チョッパーとホモジナイザーを使用してウシの卵巣から卵胞を分離するための合理化された機械的プロトコルです。この方法は、単一の卵巣から多数の生存可能な前胞卵胞の収集を可能にする。...

フラグメンテーション、ホモジナイズ、および連続ろ過の組み合わせを使用したウシ卵巣からの小さな前胞卵胞の分離

このプロトコルは、さまざまな病期からの卵巣がんオルガノイドを確立するための体系的なフレームワークを提供し、患者固有の変動性の課題に対処して、収量を増やし、その後のアプリケーションのための堅牢な長期拡張を可能にします。これには、組織処理、播種、培地要件の調整、および免疫蛍光染色の詳細な手順が含まれています。...

卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

卵巣組織のガラス化のためのプロトコルは、広く使用されているゆっくりと凍結プロトコルに代わる凍結保存方法として、提示されます。...

ガラス質の凝集状態を達成するための卵巣皮質組織のガラス化

この記事では、ウシテカ細胞と顆粒膜細胞の共培養モデルを紹介します。この方法は、卵胞内の体細胞間のパラクリンコミュニケーションと基質輸送の研究に焦点を当てた分析の信頼できる基盤として機能する可能性があります。...

ウシ卵巣における顆粒膜‐テカ細胞相互作用を理解するための改良共培養システム

タンパク質は、異なるアクチン結合モジュールを介して繊維状アクチン（F -アクチン）に結合する。このビデオでは、in vitroアッセイで日常的にF...

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

学ぶウシ卵巣皮質組織培養法。栄養階層ダイエットが卵巣微小環境とステロイド生成に与える影響をin vitroで評価し、7日間の培養で卵胞発達を解析する技術です。

ウシ卵巣皮質組織培養

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