Name: スプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いたゴルジレジデントIII型膜タンパク質によって形成される異種複合体の実証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 学ぶスプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いて、ゴルジレジデントIII型膜タンパク質SLC35A2とSLC35A3の異種複合体形成をHEK293T細胞で実証する方法。低発現レベルで細胞傷害を最小限に抑えながら、膜タンパク質間相互作用を高感度に検出できます。

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この研究は、ポーランドのクラクフにある国立科学センター(NCN)からの助成金番号2016/23/D/NZ3/01314によって支援されました。

発現プラスミドの作製
<ol><li>トポロジー予測ツールを使用して、目的のタンパク質の膜トポロジーを調べます。</li>
	<li>融合タンパク質がゴルジ膜に挿入されると、大きい断片と小さい断片が細胞質に面するようにクローニング戦略を設計します。ここで提示する場合のように、目的のタンパク質のN末端とC末端の両方が細胞質的に配向している場合は、8つの可能な方法でタンパク質にタグを付けます( 図1Bを参照)。目的のタンパク質の一方または両方のN末端またはC末端が光度配向している場合は、タグ付けから除外します。</li>
	<li>標準的なクローニングプロトコールに従って、目的の遺伝子を適切な発現ベクター( 材料表を参照)にサブクローニングします。 メモ: 近接性の欠如、最適でない方向、または空間的制約のために、一部のタグ付けオプションが機能しない可能性があるため、考えられるすべての向きをテストすることをお勧めします。</li>
</ol>2. 発現プラスミドの細胞への一過性トランスフェクション
<ol><li>トリプシン処理によって付着したHEK293T細胞培養物を回収し、専用の完全増殖培地に細胞を再懸濁する。細胞(2 x 104/100 μL/ウェル)を透明な底の白い側面96ウェルプレートにプレートします。ウェルの総数を調整して、反復を含むすべての試験済みの組み合わせと対照に対応します。 メモ: プレートの内側の 60 ウェルのみを使用して、熱シフトを最小限に抑え、一晩の蒸発を回避してください。 材料表に示されているようなポリD-リジンコーティングプレートを使用することを強く推奨し、そうしないとその後の洗浄ステップ中に細胞が剥離する可能性がある。</li>
	<li>細胞を標準条件(37°C、5%CO2)で一晩培養する。</li>
	<li>翌日、ポイント1.1で得られた発現プラスミドの所望の組み合わせで細胞をトランスフェクトする。<ol>
<li>発現プラスミドを無血清培地( 材料表を参照)で希釈し、各構築物について6.25 ng/μLに希釈する。</li>
		<li>脂質ベースのトランスフェクション試薬を適切な脂質対DNA比で添加し、メーカーの指示に従ってインキュベートします。</li>
		<li>8 μL の脂質:DNA混合物を指定されたウェルに加える。プレートの内容物を緩やかな回転で混ぜる。これにより、両方の発現構築物を50ng/ウェルでトランスフェクションする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞を標準条件(37°C、5%CO2)で20〜24時間培養する。 注:細胞をより長い時間培養すると、融合タンパク質発現のレベルが高くなり、断片間の非特異的な会合が促進される可能性があります。</li>
</ol>3. 媒体交換
<ol><li>翌日、馴化培地を各ウェル内の無血清培地100 μLと交換する。培地交換時に細胞が剥離していないことを確認してください。 注:このステップは、フリマジン作動溶液を添加する2〜3時間前に行う必要があります。血清離脱は、フリマジンの自律発光によって引き起こされるバックグラウンドを最小限に抑える。</li>
</ol>4.フリマジン作業溶液の調製
<ol><li>測定の直前に、1容量のフリマジンを19容量の希釈バッファー(20倍希釈)と混合する。 注:調製されるフリマジン作動溶液の総量は、分析される個々のウェルの数に依存する(フリマジン作動溶液は1:5の比率で細胞培養培地に添加されるので、100μLの無血清培地で以前に充填された各ウェルに25μLのフリマジン作動溶液を添加するべきである)。</li>
	<li>フリマジン作業溶液を指定されたウェル(25 μL/ウェル)に加えます。プレートを手で、またはオービタルシェーカー(例えば、300〜500rpmで15秒)を使用して静かに混合する。</li>
</ol>5. 発光の測定
<ol><li>プレートをルミネッセンスマイクロプレートリーダーに挿入します。<ol>
<li>37°Cで行われる実験については、示された温度でプレートを10〜15分間平衡化する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分析する井戸を選択します。</li>
	<li>積分時間0.3秒で発光を読み取る。必要に応じて、発光を最大2時間監視し続けます。</li>
</ol>6. データ解析
<ol><li>試験済みと対照のすべての組み合わせの平均値と標準偏差を計算します。</li>
	<li>多重比較を伴う一元配置分散分析を使用してデータを分析します。</li>
	<li>目的の組合せについて得られた平均発光を、対応する陰性対照について得られた平均発光で割ることによって、フォールド変化値を計算する。結果を評価します。 注:ここで提案するデータ分析へのアプローチは、試験された組み合わせについて得られた発光が、対応する対照の組み合わせについて得られた発光よりも統計的に有意に高く、同時に、これら2つの値の比が10を超える場合に、相互作用を主張できると仮定する。</li>
</ol>

<ol><li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters%3A+Current+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li>
<li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution%2C+identification%2C+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li>
<li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li>
<li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li>
<li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li>
<li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li>
<li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).</li>
<li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1%2C4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).</li>
<li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous%2C+multi-specific%2C+hexameric+complex+of+LPG2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li>
<li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li>
<li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose%3Aceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+%28SLC35A2%29+and+UDP-N-acetylglucosamine+%28SLC35A3%29+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+%28Mgats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li>
<li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li>
<li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li>
<li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+%28TUBEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li>
<li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li>
<li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+%28NanoBiT%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275(2020).</li>
<li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイを使用して、NSTなどのゴルジ常駐III型膜タンパク質間に形成される異種複合体の実証を可能にする詳細なプロトコルを提供します。データ解析および解釈への提案されたアプローチは、目的のタンパク質の組み合わせについて得られた発光を、より大きな断片と融合した目的のタンパク質の1つおよびより小さい断片と融合した細菌起源の制御タンパク質からなる対応する対照の組み合わせについて得られた発光に関連付けることを含む。後者は哺乳動物細胞の細胞質で発現される。したがって、それを基準として使用するには、相互作用を分析するタンパク質のN末端および/またはC末端がゴルジ膜の細胞質側にある必要があります。
プロトコールの重要なステップは、プラスミド設計、トランスフェクションする細胞のプレーティング、トランスフェクション自体、培地交換、フリマジン作業溶液の調製および細胞への添加です。プラスミド設計は、両方のルシフェラーゼ断片が細胞質に面するように行う必要があり、そうしないと、制御の組み合わせが機能せず、参照RLU値が欠落します。トランスフェクションされる細胞は、プロトコール...

この原稿では、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新のバリアントを使用して、一過性にトランスフェクトされたヒト細胞におけるゴルジ体常駐III型膜タンパク質間の異種相互作用の存在をチェックするための段階的なプロトコルについて説明しています。この手順は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)に対して最も広範囲に試験されていますが、N末端および/またはC末端が細胞質に面している他のゴルジ常駐III型膜タンパク質についても肯定的な結果を得ることができました。
我々の研究グループは、巨大分子のグリコシル化におけるNSTの役割を探究している。NSTはゴルジ体および/またはER常駐III型膜タンパク質であり、N末端およびC末端はオルガネラー膜の細胞質側を向いています1。NSTは、糖転移酵素に基質を供給するために、オルガネラ膜を横切ってヌクレオチド活性化糖を運ぶと考えられている。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマー2、3、4、5、6、7、8、9、10を形成する。さらに、異なるNST間の異種相互作用も報告されている6,11。NSTはまた、機能的に関連するグリコシル化酵素との複合体を形成することが実証された12、13、14。私たちは、NSTと機能的に関連するゴルジ体常駐タンパク質の相互作用を研究するために、現在使用されている蛍光寿命イメージング(FLIM)ベースのFRETアプローチに代わるものを探し、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイをテストすることに決めました。これにより、NSTと機能的に関連するグリコシル化酵素との間の新しい相互作用を同定することができました9。
スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の改変であるNanoBiTは、ここで提示されたプロトコルで使用されています15。これは、2つの断片からのルシフェラーゼ酵素(例えば、NanoLuc)の再構成に依存している - 大きなBiTまたはLgBiTと呼ばれる大きなもの、17.6kDaのタンパク質、および小さなBiTまたはSmBiTと呼ばれる11個のアミノ酸のみで構成される小さなもの。目的の2つのタンパク質を相補的断片と融合させ、ヒト細胞株中で一過性に発現させる。2つの融合タンパク質が相互作用する場合、細胞透過性基質の添加時にその場で発光が生成される。これら2つの断片は、それらが融合している目的のタンパク質間の相互作用によって一緒にされない限り、それらが最小の親和性で会合するように最適化されている。
一般に、生物発光ベースの方法は、蛍光に基づく方法よりもいくつかの利点を有する。生物発光シグナルは、バックグラウンド発光がルシフェラーゼ由来のシグナルと比較して無視できる程度であるため、より高いシグナル対ノイズ比を有する16。対照的に、蛍光ベースのアプローチは、通常、自己蛍光の現象によって引き起こされる比較的高いバックグラウンドに苦しむ。その上、生物発光は蛍光よりも分析された細胞にとって有害性が低く、前者の場合のように試料を励起する必要はない。これらの理由から、インビボでPPIを研究するための生物発光アプローチは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)や二分子蛍光相補(BiFC)などの一般的に使用される蛍光法よりも競合します。
我々のプロトコールは、目的のタンパク質組み合わせについて得られた発光を、対照の組み合わせについて得られた発光に参照することに依存している。後者は、より大きな断片と融合された試験されたタンパク質の1つと、より小さな断片と融合された対照タンパク質(例えば、HaloTag)とを含む。後者は、哺乳類のタンパク質のいずれとも相互作用するとは予想されない細菌起源のタンパク質である。このタンパク質を対照として使用すると、分析されるゴルジ常駐タンパク質の対のトポロジーに制限が生じる。哺乳動物細胞ではこのタンパク質は細胞質内で合成されるので、目的の両方のタンパク質は少なくとも1つの細胞質尾部を有するべきである。
このアプローチは、PPIの初期スクリーニングに特に有用であり得る。これは、目的の融合タンパク質が、他のアプローチを適用するには単に不十分なレベルで発現される場合に、選択の方法となり得る。同様に、分割ルシフェラーゼ相補アッセイは、目的のタンパク質が高レベルで発現している場合に最良の選択肢となり得るが、これはそれらの細胞内局在化に悪影響を及ぼすか、または非特異的相互作用を強制することが知られている。より小さい断片は11個のアミノ酸しか有さないので、より大きなタグを使用するのが不可能である場合に分割ルシフェラーゼ相補アッセイを適用することができる。最後に、ここで提示する場合のように、他の技術を用いて得られたデータをさらに確認するために採用することができる。

<table><tbody><tr><td>0.25%トリプシン-EDTA溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接着性哺乳類細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysine 96ウェルホワイト/クリアフラットボトムTC処理マイクロプレート、蓋付き</td><td>コーニング</td><td>356651</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養サプリメント(熱不活化ウシ胎児血清、L-グルタミン、ペニシリン、ストレプタマイシン)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiTフラグメント</td><td></td><td></td><td></td>でタグ付けされていない目的のタンパク質をコードする発現プラスミド</tr><tr><td>FuGENE HDトランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover Microplate Reader(または別の発光マイクロプレートリーダー)</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr>使用する<td></td><td></td><td></td><td>細胞株専用の増殖培地</td></tr><tr><td>標準的な分子クローニング用材料・試薬(細菌、耐熱性ポリメラーゼ、制限酵素、DNAリガーゼ、核酸精製用材料・試薬)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT MCS スターターシステム</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>このキットには、目的のタンパク質をさまざまな配向のNanoBiTフラグメントでタグ付けできるベクターと、SmBiTと融合したHaloTagタンパク質をコードするコントロールプラスミドとポジティブコントロールプラスミドペアが含まれています。</td></tr><tr><td>Nano-Glo Live Cell Assay System</td><td>Promega</td><td>N2011</td><td>本キットには、生細胞中のNanoLuc活性を検出できる基質であるフリマジンと専用の希釈バッファーが含まれています。</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Oribital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ解析用ソフトウェア(例:GraphPad Prism)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

スプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いたゴルジレジデントiii型膜タンパク質によって形成される異種複合体の実証

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

このプロトコルの目的は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)によって形成される異種複合体を実証するためのスプリットルシフェラーゼ相補の最新の変異体の適用可能性を探索することである。これらのERおよびゴルジ常駐多膜貫通タンパク質は、細胞質的に合成されたヌクレオチド糖を細胞小器官膜全体に運び、グリコシル化を媒介する酵素を基質とともに供給する。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマーとして存在する。異なるNST間の異種相互作用も報告されている。この技術がNSTヘテロマー化の現象の研究に適しているかどうかを検証するために、我々は以前にいくつかの他の手段によって会合することが示された2つのゴルジに常駐するNSTの組み合わせに対してそれを試験した。ルシフェラーゼ相補アッセイは、高い発現レベルを必要とせず、しばしばタンパク質の誤局在化を引き起こし、偽陽性のリスクを高めるため、ゴルジ体常在性膜タンパク質間の相互作用の研究に特に適しているようである。

このアプローチで最も信頼性の高いデータを取得するには、考えられるすべての組み合わせをテストする必要があります ( 図 1 参照)。並行して、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含める必要があります。ポジティブコントロールは、相互作用することが知られている2つのタンパク質からなるべきであり、そのうちの1つは大きなフラグメントと融合し、もう1つは小さなフラグメントと融合する。陰性対照は、理想的には、同様にタグ付けされた2つの非相互作用III型膜タンパク質からなるべきである。しかし、このような制御を確立することは、2つの対照タンパク質の相互作用の欠如がいくつかの代替アプローチを用いて徹底的に確認されるべきであるため、困難な場合がある。したがって、相互作用が決定されるタンパク質のN末端および/またはC末端が、ここで提示される場合のように細胞質的に露出している場合、いかなるヒトタンパク質(例えば、HaloTag)とも相互作用するとは予想されない非ヒト起源の細胞質ゾルタンパク質を陰性対照として採用することができる。このタイプのコントロールを使用して得られた結果のさらなる検証を、...

ここで提示されたプロトコルは、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の変異体を用いて、生きた哺乳動物細胞におけるゴルジ常駐III型膜タンパク質と細胞質的に露出したN末端および/またはC末端との間の異種相互作用の発生を実証することを意図している。

スプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いたゴルジレジデントIII型膜タンパク質によって形成される異種複合体の実証

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

私たちのプロトコルは、低発現レベルでの生細胞内の小胞体とゴルジ複合体の多膜貫通タンパク質との間の相互作用を特定し、分析することを可能にします。この技術の主な利点は、特別な感度に対するものであり、これにより、細胞の健康にしばしば有害であり、タンパク質の細胞内局在を乱す可能性のある高い過剰発現レベルを回避できます。接着性HEK293 T細胞培養液をトリプシン処理により回収し、細胞を専用の完全増殖培地に再懸濁します。透明な底面の白い96ウェルプレートに細胞をプレートします。ウェルの総数を調整して、テストしたすべての組み合わせとコントロール(反復を含む)に対応します。次に、細胞を標準条件で一晩培養します。翌日、目的の発現プラスミドの組み合わせで細胞をトランスフェクションします。プラスミドを無血清培地で各コンストラクトごとに1マイクロリットルあたり6.25ナノグラムに希釈し、脂質ベースのトランスフェクション試薬を添加します。適切な脂質とDNAの比率を添加します。メーカーの指示に従ってプラスミドをインキュベートします。次に、8マイクロリットルの脂質DNA混合物を指定されたウェルに加えます。プレートの内容物を穏やかな回転で混合し、細胞を標準条件で20〜24時間培養します。翌日、各ウェルの馴染培地を100マイクロリットルの無血清培地と交換し、培地交換時に細胞が剥離しないようにします。発光を測定する直前に、1容量のフリマジンと19容量の希釈バッファーを混合します。25マイクロリットルのフリマジン作業溶液を各ウェルに加え、プレートを手作業またはオービタルシェーカーで穏やかに混合します。プレートを発光マイクロプレートリーダーに挿入し、プレートを摂氏37度で10〜15分間平衡化します。分析するウェルを選択し、0.3秒の積分時間で発光を読み取ります。必要に応じて、最大2時間ルミネッセンスを監視し続けます。このプロトコールは、細胞質に面したN末端とC末端を持つゴルジ体常在型3膜タンパク質であるSLC35A2とSLC35A3の2つのヌクレオチド糖トランスポーターで試験されました。8つの可能なタグ付けオプションがあり、得られた融合タンパク質は8つの可能な方法で組み合わせることができました。ここには、テストされたすべての組み合わせと制御の組み合わせに対応する平均相対発光ユニットまたはRLU値が示されています。3つの組み合わせで得られたRLU値は、対応するコントロールの組み合わせで得られたRLU値よりも有意に高かった。対象の組み合わせの比値を得るために、RLU値をそれぞれのコントロールについて得られたRLU値で除算した。10 から 1000 の間の比率は、特定の交互作用を強く示しています。SLC35A2とSLC35A3が相互作用するという考えを裏付ける2つの組み合わせがありました。このデータを

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここで、我々はプロメガからデュアルGloTMルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子のアプローチで貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。...

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。...

二分子蛍光相補

一回膜貫通ドメイン（TMDS）のオリゴマー化の傾向を評価するための効率的な手順が説明されています。 ToxRに融合されたTMDからなるキメラタンパク質は、大腸菌のレポーター株に発現されています。...

ToxRアッセイによって決定される膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向

我々は、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介膜融合事象を定量化細胞融合アッセイを開発した。...

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

このビデオでは、タンパク質間相互作用を検出するための分割ルシフェラーゼ相補アッセイを実演しています。このアッセイでは、目的のタンパク質がルシフェラーゼ酵素の小さなフラグメントと大きなフラグメントにタグ付けされます。タンパク質が相互作用すると、大小の断片が結合して活性酵素複合体を形成し、特定の基質の存在下で測定可能な明るい発光を放出します。...

特異的なタンパク質間相互作用を同定するためのスプリットルシフェラーゼ相補アッセイ

ゴルジの住民の正確な局在はゴルジ体の細胞の機能を理解するために不可欠です。しかし、従来の光学顕微鏡ではサブ ゴルジ構造を解決できません。ここで定量的蛋白質のサブ...

そのセンターの蛍光質量イメージングによるゴルジ体タンパク質の量的なローカリゼーション

ここでは、近接結紮の試金 (PLA) を使用して感度が高い固定細胞における MST1/MST2 heterodimerization...

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) のキナーゼ活動を定量化するルシフェラーゼを用いたバイオ センサーの紹介-中央キナーゼ シグナル伝達経路カバで。このバイオ センサーには、カバ経路レギュレータの in vitroとin...

信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視

ここでは、スクリーニングフォーマットにおけるeIF4F複合ダイナミクスの薬物誘発摂動を評価することを可能にする生細胞におけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定するプロトコルを提示する。...

ライブセルにおけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定してeIF4Fアセンブリをモニタリング

このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

私たちは、生細胞の小胞体-ミトコンドリア接触をモニターするためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを確立しました。このアッセイを用いて、化学処理の条件下で、HEK293T細胞内のこれらのオルガネラ間カップリングのレベルを定量的に測定するプロトコールを記載します。...

生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ

学ぶスプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いて、ゴルジレジデントIII型膜タンパク質SLC35A2とSLC35A3の異種複合体形成をHEK293T細胞で実証する方法。低発現レベルで細胞傷害を最小限に抑えながら、膜タンパク質間相互作用を高感度に検出できます。

スプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いたゴルジレジデントIII型膜タンパク質によって形成される異種複合体の実証

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