Name: マウスにおける結膜経月の分離と同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学ぶマウス結膜常在菌の分離・同定法。綿棒採取と培養濃縮、MALDI-TOF質量分析を用いて生存細菌のみを検出し、眼疾患診断の微生物シグネチャー解析に応用可能です。

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P30 DK034854からの資金は、マサチューセッツ州ホストマイクロバイオームセンターでのVY、LBおよび研究を支援し、NIH/ NEI R01 EY022054からの資金提供はMGをサポートしました。

マウスを含むすべての手順は、制度的動物ケアと使用委員会のガイドラインに従います。微生物や汚染される可能性のある材料を扱う際には、(お客様の機関環境安全衛生部門が指示する)実験室の安全ガイドラインに従ってください。バイオハザード汚染材料の廃棄前に、適切な廃棄物容器と除染手順を使用してください。
1.アイスワブの準備、作業場のセットアップ、マウスの目のスワッピングとサンプル濃縮
<ol><li>滅菌眼綿棒を準備する 注:滅菌眼綿棒は、綿のバッティングの繊維薄い層で薄くコーティングされた木製のつまようじで、家で作られています。<ol>
<li>綿棒と爪楊枝の適切な量を切り取るマウスの数を振り回します。</li>
		<li>親指と人差し指で綿のバッティングの半分のセンチメートルの部分をつまみます。親指と人差し指で端を引っ張ってバッティングをいじめて平らな単一の多孔質層を形成し、バッティングがばらばらになる直前に停止します(伸びたバッティング全体に分散した綿の小さなビットは許容されます)。</li>
		<li>爪楊枝の鋭い端の1つの周りにバッティングを回し、爪楊枝の先端に伸ばした部分をねじったまま軽く持ち続けて、 図1を参照してください。「完成した」アイ綿棒は、先端の上に伸ばされた綿の非常に薄い層を持ち、先端から約半分から1センチメートル離れています。</li>
		<li>小さなビーカー、綿棒側を下にしてカバーに「完了」綿棒を挿入します。オートクレーブ。</li>
	</ol></li>
	<li>ワークスペースを設定する
	<ol>
<li>2 mLのケタミン(100 mg/mL)、400 μLのキシラジン(100 mg/ml)、滅菌生理食い(0.9% NaCl in dH2O)を無菌50 mLの無菌遠心分離チューブに含む麻酔を調製します。フィルター滅菌とアリコート麻酔を即時使用(4°Cで1ヶ月間保存してもよいが、常に使用前に室温に平衡化可能)</li>
		<li>汚染を最小限に抑えるために、消毒剤で作業領域をクリアして清掃してください。</li>
		<li>アリコート 0.5 mL の無菌脳心臓注入培地 (BHI) ラベル付け 1.5 mL 無菌マイクロ遠心チューブ (1 本のマウスおよびコントロール);マイクロ遠心分離ラックに配置します。ラックを氷の上に置く。</li>
		<li>作業フローを次のように設定する(左から右へ):マウス麻酔ステーション(実験マウス、空の滅菌ケージ、室温麻酔、25G針、1mLシリンジを含むケージ)、アイスワッピングステーション(氷上のBHI、滅菌されたアイ綿棒、きれいなペーパータオル、70%イソプロパノール)とメッキステーション(室温10、10 μLの無菌使い捨てチップ、バイオハザード廃棄物容器)。</li>
	</ol></li>
	<li>目のスワッピング
	<ol>
<li>ケタミンおよびキシラジンのマウス重量投与量1g当たり10μLの麻酔を各成体マウスにそれぞれ腹腔内投与し、オートクレーブケージに入れる。後足パッドを絞ることによって麻酔をテストする;動きがない場合、適切な麻酔を示さない。</li>
		<li>一方の手は麻酔付きマウスのみを扱い、もう一方の手は目の綿棒と培養のみを処理するように割り当てます。スワッピングの場合は、完全に麻酔をしたマウスをケージから取り出します。左目を露出させた状態で、その側面に配置されたきれいな作業面の上に置きます。手袋をした手にイソプロパノールをスプレーし、清潔なペーパータオルで乾かします。</li>
		<li>アンキャップは専用の媒体処理手が付いているBHIマイクロ遠心分離管を特にラベル付けした。チューブを氷の上のマイクロ遠心分離器ラックに戻します。 BHIで目の綿状の先端を浸し、余分な液体を取り除くために、内側のチューブに対して2回旋回するチューブから目の綿棒を引き出す。</li>
		<li>マウスハンドで、首の擦り傷でマウスをそっと握りしめる。一方、左目の内側結膜領域に対して、目の先端の綿棒を置いて、 図2Aを参照してください。眼球を軽く押し下げ、窓の洗浄動作(図2B)でスワブを上下に、下まぶたと目の間で10回動かす。一定の圧力を維持します。</li>
		<li>毛皮に触れることなく、綿棒の先端を挿入した場所に垂直にそっと取り除き、BHI培地を含むラベル付きのマイクロ遠心分離チューブに綿綿を直接下に置きます。スワッピングアイに潤滑アイドロップを適用します。</li>
		<li>マウスをケージに戻します。</li>
		<li>綿棒を氷の上に10〜15分間放置し、10回転のためにメディアに先端を混合することによって、滅菌された手袋をした手で目の綿棒を取り除きます。5回転のためのマイクロ遠心分離管の内壁に対して渦巻く先端によって綿棒を引き出す。バイオハザード容器に綿棒を処分する。</li>
		<li>各マウスとコントロールサンプル(スキンまたはファースワブ)に対して、手順1.3.2~1.3.7を繰り返します。各綿棒の間に手袋を適切に殺菌する。</li>
	</ol></li>
	<li>濃縮
	<ol>
<li>37°Cで1時間静かにチューブをインキュベートしてサンプルを濃縮</li>
		<li>インキュベーション中に、1匹のマウスにつき5%の羊の血寒天プレート(TSAプレート)で1つの室温トリプティケース大豆をラベル付けし、半分に分けます。</li>
		<li>目の綿棒培養後、濃縮サンプルをインキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。</li>
		<li>図3Aの回路図に従って混合およびプレートする渦サンプルを簡単に説明します。サンプルのアリコート10μLをTSAプレートに傾け、プレートを傾けてストリップを形成し、2回繰り返します。</li>
		<li>プレートの分割線の反対側に、寒天上のサンプルのドット10 μL、9回繰り返します。</li>
		<li>37°Cでプレートを18時間、2日間、4日間インキュベートします(寒天プレートの乾燥を防ぐクリーンチャンバー内)。ストリップ内のコロニーを数え、形態に注意し、形態学的に類似した分離物のための綿棒当たりのコロニー形成単位(CFUs)を計算する。ストリップで捕獲されていないユニークな生物のためのドットを見てください。</li>
	</ol></li>
</ol>2. マスタープレート、特徴付け、および眼内微生物の同定
<ol><li>
マスタープレート
	<ol>
<li>TSA プレートの背面にグリッドを描画します (図 3B)。各マウスの目の綿棒プレートから滅菌爪楊枝でコロニーを選び、マスタープレートスクエア(グリッド)、コロニー番号とマウス情報を持つラベルグリッドをストリーク。各形態学的に異なるコロニーのための3つの異なるコロニーを選んでプレートします。</li>
		<li>プレートを一晩37°Cでインキュベートする。 新しい分離物の出現を毎日チェックし、96時間インキュベーションを続けます。 注:コメンサルの人口は、マウスの年齢、栄養、病気の状態およびケージの慣行に基づいて異なります。分離特性は、当研究室で見られる優勢な有酸素性および栄養性嫌気性細菌に基づいています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
評価
	<ol>
<li>マンニトール塩寒天(MSA)およびマッコンキー(MAC)プレートに13 プレートの微生物を複製し、37°Cで一晩インキュベートします。 MSA上のハローを有するワックス状のコロニーまたは黄色のコロニーの各単離および存在に対する成長に注意してください。</li>
		<li>グラム陽性コッチの場合、カタラーゼ試験13,14で試験を行う。きれいなガラススライドに過酸化水素3%の低下を置きます。無菌爪楊枝を使用して、目の綿棒プレートから対応する微生物を選びます。泡形成はストレプトコッカスsppを示さないが、わずかな気泡形成はコリネバクテリウム属のppを示し、おそらくアエロコッカス属を示し、急速な気泡形成はブドウ球菌sppを示す。
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
識別: マルディ-トフ MS 分析 メモ: 細菌の識別は、MALDI-TOFおよびソフトウェアデータベースを使用して行われます。このシステムは、同定のために既知の細菌スペクトルと比較されるスペクトルプロファイルを開発するための飛行質量分析(MALDI-TOF MS)のマトリックス支援レーザー脱離イオン化時間を採用しています。 大腸菌、ATCC 8739は、システムキャリブレーションに使用されます。<ol>
<li>プレート細菌は、5%の羊の血液を含むTSAプレート上に分離し、37°Cで5%の二酸化炭素で一晩インキュベートする。</li>
		<li>1 μLループを使用して、純粋な細菌の薄い層をMALDI-TOFターゲットスライドに適用します。MALDI-TOF MS CHCA マトリックス溶液(α-シアノ-4-ヒドロキシシンナミン酸)の1 μLは重ね合わされ、MALDI-TOF装置にスライドをロードする前に完全に空気乾燥させます。</li>
		<li>各分離は重複して発見されます。</li>
		<li>80%を超える確率スコアを含むレポートは、高い判別値を示し、信頼できる結果として受け入れられ、細菌同定が受け入れられます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Arpaia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+produced+by+commensal+bacteria+promote+peripheral+regulatory+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation.</a> Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).</li>
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</ol>

開示する利益相反はありません。

眼表面の小児性細菌状態のために、多くの研究室は、7、20の眼部の分離が困難であり、その結果、成長、低存在量、低多様性8の低いサンプル数を生じる。この方法は、濃縮工程の追加、およびMALDI-TOF MSによるアイスワブおよび同定を加えることによって、標準的な培養プラクティス4,21を大幅に改善する。濃縮工程は、細菌負荷を増幅することにより、低回収性に対処します。100未満のCFUsから野生型雄マウスの目の綿棒あたり2,500 CFUsの相対的な豊富さに回復可能な細菌の有意な増加は、栄養豊富な培地のインキュベーションが生存可能であるが、非耕作細菌22、23を再活性化し、休眠微生物の回復を可能にすることを示唆している。最近の培養ベースの濃縮工程は...

このプロトコルの目的は、眼のマイクロバイオームを特徴付けるために、眼結膜から実行可能でまれな有酸素性および気性嫌気性微生物の特異的な分離を強化することである。広範な研究は、皮膚、腸、呼吸器および生殖管上の経経膜粘膜群集をプロファイリングし、これらのコミュニティが免疫系および応答1、2、3の発達に影響を及ぼすことを示している。眼部の男性群は、ドライアイ病4、シェーグレン症候群5および糖尿病6などの特定の疾患病態の間に変化することが示されている。しかし、典型的な眼表面の連動性共同体を定義する能力は、他の粘膜部位6、7、8と比較して比較的少ない存在によって妨げられている。これは、常駐眼マイクロバイオームがあるかどうか、それが存在する場合、それが皮膚マイクロバイオームと異なるかどうか、そして結果的に、自然免疫系の発達と応答に対する局所的な影響があるかどうかについての論争を促す。このプロトコルは、この問題を解決するのに役立ちます。
一般に、連視ニッチを定義するアプローチは、シーケンシングと文化ベースの技術4、7、9に基づいています。16 S rDNAシーケンシングおよびBRISK分析7は、培養ベースの技術よりも広い多様性を示すが、生きた微生物と死んだ微生物を区別することができない。眼表面は、大量のDNA断片を生成する涙膜の抗菌特性4のために多くの微生物に敵対しているため、DNAベースのアプローチは、汚染物質ではなく常駐的な汚染物質として死んだ細菌の同定に向けてデータを歪める可能性のあるこれらのアーティファクトを検出します。これは、微生物の存在量および多様性10においてより高いとして眼空間の異常な分別識別および特徴付けをもたらす。これにより、DNAベースの方法を介して常駐眼マイクロバイオームを定義することが困難になります。一方、標準的な文化ベースの技術は、負荷が低すぎるため、コメンサルを検出することができません11.我々の方法は、結膜を標的とすることができる薄い綿棒を使用して、近隣の皮膚からの汚染を避けることによって、ならびに実行可能な生物が生存可能であるが非カルト的な、ならびに希少生存微生物を豊かにすることを目的に、栄養密度の高い培地の短い培養によって豊かにすることができるという概念を使用することによって、標準的な慣行を改善する。
結果は、眼綿棒あたりの眼のコメンの相対的な豊富さ、結膜の常駐微生物叢を特徴付け、比較目的のために重要である。我々のデータは、皮膚と結膜微生物叢の間に違いがあり、年齢の増加と性別固有の豊富な違いと共に多様性が高いことを示している。さらに、このアプローチは、ノックアウトマウス12における因果的な違いを再現的に発見した。このプロトコルは、ケージの慣行、地理、または疾患状態、および免疫系の発達および応答に対するコメンサル代謝産物および産物の局所的影響によって異なる可能性のある眼マイクロバイオームを記述するために適用することができる。

<table><tbody><tr><td>0.1〜10マイクロ;l ピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1110-300</td><td>オートクレーブ使用前</td></tr><tr><td>0.5 から 10 &micro;l エッペンドルフピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>13-690-026</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BD309623</td><td>各目の綿棒グループに 1 シリンジ</td></tr><tr><td>1.5 ml エッペンドルフチューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>オートクレーブ使用前</td></tr><tr><td>1000 &micro; ml ピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2021</td><td>オートクレーブ使用前</td></tr><tr><td>200 から 1000&マイクロ;l ギルソンピペットマン (P1000)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>25 G 針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-826AA</td><td>片目 1 針 スワブグループ</td></tr><tr><td>3 % 過酸化水素</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S25359</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;Cインキュベーター</td><td>ラボ機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%イソプロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>PX1840-4</td><td></td></tr><tr><td>アナセド注射(キシラジン100mg / ml)</td><td>サンタクルーズアニマルヘルス</td><td>SC-362949Rx</td><td></td></tr><tr><td>BD BBLグラムステインキット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>B12539</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td>ラボ機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クリーンペーパータオル</td><td>ラボ機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿中綿/滅菌ロールコットン</td><td>CVS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨て1mlピ</td><td>ペットフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-9AM</td><td>グラム染色およびカタラーゼテスト</td></tr><tr><td>用E.coli</td><td>ATTC</td><td>ATCC 8739</td><td></td></tr>スライド<tr><td>フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-A3</td><td>グラム染色およびカタラーゼテスト</td></tr><tr><td>用ケタミン(100mg/ml)</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>9950001</td><td></td></tr><tr><td>マックコンキー寒天プレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>4321270</td><td>4°C;C</td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>784641</td><td>mfrの指示に従ってプレートを準備し、4°Cで保管します。C 1週間マウス</td></tr><tr><td></td><td>ジャクソン研究所</td><td>C57/BL6J</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-757-12</td><td>マンニトール塩寒天プレート用</td></tr><tr><td>RPI 脳 心臓注入メディア</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-488525</td><td>指示に従って準備し、オートクレーブ</td></tr><tr><td>SteriFlip (0.22 & micro;m孔サイズポリエステルスルホン)</td><td>EMD /ミリポア、フィッシャーサイエンティフ</td><td>SCGP00525</td>麻酔を<td>滅菌する</td>滅菌</tr>コー<tr><td>ニング遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>430829</td><td>麻酔の準備</td></tr><tr><td>滅菌マウスケージ</td><td>ラボ機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>つまようじ(丸竹)</td><td>キッチンエッセンシャル使用</td><td></td><td>前のオートクレーブと綿棒の準備</td></tr><tr><td>トリプチカーゼ大豆寒天培地IIと5%羊の血液プレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>4321261</td><td>4°で保存。C</td></tr><tr><td>Vitekターゲットスライド</td><td>BioMerieux Inc. ダーラム、ノースカロライナ</td><td></td><td></td></tr>州 <tr><td>Vitek-MS</td><td>BioMerieux Inc. ダーラム、ノースカロライナ</td><td></td><td></td></tr>州 <tr><td>Vitek-MS CHCA マトリックスソリューション</td><td>BioMerieux Inc. ノースカロライナ州ダーラム</td><td>411071</td><td></td></tr><tr><td>単回使用点眼薬</td><td>CVS Pharmacy</td><td></td><td>Bausch, Lomb Soothe 潤滑剤 点眼薬、28バイアル、各0.02液量オンス</td></tr></tbody></table>

マウスにおける結膜経月の分離と同定

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

眼表面はかつて免疫特権と非生物性と考えられていたが、最近では小さいが持続的な経常存在があるように見える。眼粘膜における細菌種の同定とモニタリングは、その存在量が少なく、産経的成長と同定のための適切な方法論の利用可能性が限られているため、困難であった。培養法とDNAシーケンシング法の2つの標準的なアプローチがあります。第1の方法は、限られた回収可能な細菌のために問題であり、第2のアプローチは、眼空間の異常な表現につながる生きている細菌と死んだ細菌の両方を識別する。標準的な微生物培養技術を基に、細菌の分離のための堅牢で高感度な方法を開発しました。これは、下の結膜を標的とする「ラボ内」製の薄い綿棒を利用した綿棒ベースの技術であり、続いて有酸素性および好気性嫌気性性の生殖器の増幅ステップを利用する。このプロトコルは、 コリネバクテリウムspp.、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌spp.、ストレプトコッカス属などの結膜種を分離し、同定することを可能にしました。このアプローチは、異なる疾患条件下でのマウスの男性の多様性を定義するのに適している。

めっきのための異なる方法を示す目の綿棒板の代表的な結果は、C57BL/6マウスからの形態学的に多様な分離株を示す 図3A に示されている。各別個の分離物について、コロニーはストリップに数え、相対的な豊富さ、目の綿棒あたりのユニークなコロニー形成単位(CFUs)を計算し、比較目的でプロットした。微生物学的特徴付けのために、細菌を個々のマウスアイスワブプレートから摘み取り、マスターTSAプレートを生成した(各マウスアイ綿棒プレートから三重に形態学的に異なる分離株を選ぶことによって作成された)。マスタープレートから、その後の日または成長が現れたときに、微生物を特徴付けるか識別するために追加のテストが行われました。マスタープレートは、それぞれの分離株を拡大するのに十分な接種を提供するために使用された。
この種は微生物学的技術を用いて特徴付け、次いでMALDI-TOF MS分析によって同定された。マスタープレートから各分離を、カタラーゼ試験13、14により試験し、...

ここでは、微生物学的手法とMALDI-TOF質量分析によるその後の同定を用いたユニークな眼綿棒および培養ベースの濃縮ステップを用いた有酸素性および気性嫌気性マウスの結合性のコンメンサルト菌の分離と増幅のためのプロトコルを提示する。

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

この方法は、目の敵対的な環境のために挑戦している実行可能な眼結膜微生物を識別します。これは、眼マイクロバイオームが存在するかどうか、および細菌の存在が眼疾患でどのように変化するかを答えるのに役立ちます。生存可能な微生物と生存不可能な微生物の両方を識別するDNAシーケンシングとは対照的に、この方法は生存可能な微生物のみを識別し、眼部のコメンザルコミュニティを明確に理解する結果となる。研究は、非自己免疫および自己免疫ドライアイのような眼疾患を診断することは困難であり、独特の眼細菌存在を有することを示唆している。この方法は、特徴的な微生物シグネチャを持つ眼疾患を診断するために使用することができます。スワッピングするマウスの数に合わせて綿のバッティングと爪楊枝を適切な量に詰め込み、長さ1/2センチメートルの長い綿のバッティングをつまみ、端を引っ張ってバッティングがばらばらになる直前に平らな単一の多孔質層を形成していじめます。爪楊枝の鋭い端の1つの周りにバッティングを軽く持って、爪楊枝の先端に伸ばした部分をねじって回します。完成した目の綿棒は、先端から約1/2〜1センチメートル離れた先端の上に伸ばされた綿の非常に薄い層を持つことになります。小さなビーカーに綿棒を挿入し、綿棒の側面を下に置き、それらをカバーしてオートクレーブします。消毒剤で作業領域をきれいにして、0.5ミリリットルの無菌脳心注入、またはBHI培地を標識された1.5ミリリットルの無菌マイクロ遠心チューブに最小限に抑えます。チューブをラックにキャップし、ラックを氷の上に置く。実験マウス、空の滅菌ケージ、室温麻酔、25ゲージ針、1ミリリットルの注射器を備えたケージを含むマウス麻酔ステーションから左から右にワークフローを設定します。次に、氷の上に引用されたBHI、滅菌された目綿棒、潤滑点眼薬、バイオハザードコンテナ、きれいなペーパータオル、および70%イソプロパノールスプレーを含む目スワッピングステーションを準備します。最後に、常温の血液寒天プレート、10マイクロリットルピペット、10マイクロリットルの滅菌使い捨てチップ、およびバイオハザード廃棄物容器を備えためっきステーションを設置します。後ろ足パッドを絞ってマウスが正しく麻酔されていることを確認します。動きがない場合にのみ進みます。麻酔付きマウスを扱う片手と、目の綿棒と培養を処理するもう一方の手を割り当てます。ケージからマウスを取り出し、左目を露出させた状態で側面に配置された作業面の上に置きます。手袋をした手にイソプロパノールをスプレーし、ペーパータオルで乾かします。専用のメディアハンドリングハンドでラベル付きのBHIマイクロ遠心分離管をアンキャップし、ラックに戻します。BHIに目の綿棒の綿でコーティングされた先端を浸し、その後、余分な液体を取り除くために内側のチューブに対して2回渦巻きながら、チューブから綿棒を引き出します。マウスハンドで、首の擦り傷でマウスをそっと握りしめる。一方、左目の内側結膜領域に対して、目の先端をスワブに置きます。眼球を軽く押し下げ、下眼瞼と眼の間の洗浄運動で綿棒を10回動かし、一定の圧力を維持する。毛皮に触れることなく、綿棒の先端を挿入した場所に垂直にそっと取り除きます。綿棒綿を下に下に置き、BHI培地付きのラベル付きマイクロ遠心管に直接入れる。スワッピングアイに目のドロップを適用します。必要に応じて、コントロールサンプル用の皮膚または毛皮綿棒を取得し、各綿棒の間に適切に手袋を殺菌する。終了したら、マウスをケージに戻します。綿棒を氷の上で10〜15分間放置し、手袋をした手を殺菌し、10回転のためにメディアの先端を混合しながら綿棒を取り除きます。5回転のためにチューブの内壁に先端を旋回させることによって綿棒を引き出し、バイオハザード容器に処分します。各マウスに対してこの手順を繰り返します。37°Cで1時間静かにチューブをインキュベートしてサンプルを濃縮します。インキュベーション中に、マウスの目の綿棒またはコントロール綿棒ごとに1つの室温TSAプレートにラベルを付け、半分に分割します。濃縮されたサンプルをインキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。サンプルを簡単に渦を混ぜて混合し、次にサンプルの10マイクロリットルをTSAプレートにアリコートし、プレートを傾けてストリップを形成する。これを 2 回繰り返します。プレート分割線の反対側に、それぞれ10マイクロリットルのサンプルを含む10ドットを作成します。寒天プレートの乾燥を防ぐクリーンチャンバーで、18時間、2日、4日間、摂氏37度でプレートをインキュベートします。ストリップ内のコロニーを数えます。形態に注意し、形態学的に類似した分離物のための綿棒ごとのコロニー形成単位を計算する。ユニークな生物がストリップに捕獲されていない点を見てください。可視化を容易にするために、真ん中と右のプレートに細菌を密にメッキしました。典型的には、目の綿棒プレートの細菌がはるかに少ない観察を受けた。時折、目の綿棒は回復可能な細菌を得ることができないことに注意してください。C57ブラックシックスマウスからの形態学的に多様な分離株を有する代表的な眼綿棒板をここに示す。それぞれの異なる分離について、コロニーをストリップで数え、相対的な存在量を計算してプロットした。微生物学的特徴化のために、細菌は、マスターTSAプレートを生成するために、個々のマウス目綿棒プレートから選ばれた。成長が現れたとき、微生物を特徴付けるか、または識別するために追加のテストが行われました。マスタープレートは、それぞれの分離株を拡大するのに十分な接種を提供するために使用された。分離株を同定するために、TSAプレートをストリークして一晩インキュベートし、MALDI-TOF MSを実施した。ここに示す分離株の例は、レンサ球菌アシドミニムスおよびアエロコッカスビリダンとして同定された。男性および女性C57黒6匹のマウスから有意に異なるレベルのコメンザル生物が回収された。連鎖球菌酸菌、アエロコッカス・ビリダンスは、負のブドウ球菌および大腸菌をC57黒6Nマウスから単離した。このプロトコルを試みるとき、綿棒を薄くコーティングし、目の綿棒のステップの間に時間を取ることによって最良の結果が達成されることを覚えておいてください。MALDI-TOF MSへのアクセスが制限されている場合、分離株は微生物学的および生化学的試験によって同定され得る。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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結膜から細胞を単離して表現する非侵襲的方法

このプロトコルは、比較的無傷の位置でまぶた、眼表面、前部および後部セグメントを用いてマウス眼球を単離する方法を説明する。...

組織学的検査と免疫組織化学のための一体的な眼表面組織を得るための無傷の眼球の単離

ここでは、生きたマウス眼球表面イメージング用の多光子顕微鏡プラットフォームを紹介します。蛍光トランスジェニックマウスは、細胞核、細胞膜、神経線維および毛細血管を眼表面内で可視化します。コラーゲン構造に由来する非線形第二高調波生成信号は、間質アーキテクチャにラベルフリーイメージングを提供します。...

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マウスにおける結膜経月の分離と同定

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