Name: 眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学ぶ、眼の脈絡膜血管新生を研究するエキスビボアッセイ法。マウス組織を用いて微小血管増殖を評価し、加齢性黄斑変性症の治療薬スクリーニングや経路解析に応用できます。

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この研究は、鈴木マンペイ糖尿病財団(YT)、ボストン小児病院OFD/BTREC/CTREC教員キャリア開発助成金、ボストン小児病院眼科学財団、BCHパイロット賞、BCHマントンセンターフェローシップ、マントンセンターフェローシップの助成金によって支援されました。 そしてリトルキリン財団(ZF)、ドイツ研究財団(DFG;紀元前[CA1940/1-1])、NIH R24EY024868、EY017017、R01EY01717-13S1、EY030904-01、BCH IDDRC(1U54HD09025)、マサチューセッツ州ライオンズ財団(1U54HD09025)、マサチューセッツ州ライオンズ財団(1U54HD09025)、LEHS財団(

記載されているすべての動物実験は、ボストン小児病院の施設動物ケアおよび使用委員会(ARCHプロトコル番号19-04-3913R)によって承認されました。
1. 準備
<ol><li>ペニシリン/ストレプトマイシン(10000 U/mL)5 mLと5mLと10mLの市販サプリメントを、完全な古典的な培地の500 mLに血清で加えます。初期の培地のアリコート50mL。 注:汚染を避けるために、在庫に媒体を戻さないようにしてください。</li>
	<li>氷の上に完全な古典的な媒体のアリコートを置きます。</li>
	<li>70%エタノールを使用して、解剖顕微鏡、鉗子、ハサミを洗浄してください。</li>
	<li>解剖顕微鏡に1つ、氷の上に1つ、2つの細胞培養皿(10 cm)を準備します。各皿に完全な古典的な媒体の10 mLを入れてください。</li>
</ol>2. 実験ステップ (図 1)
<ol><li>75-100 mg/kgケタミンを使用した出生後(P)20の周りのC57BL/6Jマウスを犠牲にし、7.5-10 mg/kgキシラジンを腹腔内注射する。解剖する前に氷の上に完全な古典的な媒体で目を保ちます。</li>
	<li>結合組織(筋肉と脂肪組織)と眼の視神経を取り除きます。</li>
	<li>マイクロハサミを使用して角膜のリンブに0.5mm後部を円周的に切断します。角膜/虹彩複合体、ガラス状、レンズを取り除きます。</li>
	<li>1mm切開を視神経に向かって切り取りエッジに垂直にし、幅1mmの円周バンドを切断します。複合体の中央領域と周辺領域を分離します。鉗子を使用して、RPE/脈絡/強膜複合体からレチナを剥がします。</li>
	<li>氷の上に完全な古典的な媒体で末梢脈絡膜バンドを保ちます。もう一方の目を分離し、2番目のバンドを切断するプロセスを繰り返します。</li>
	<li>円形のバンドを6~等しい正方形(〜1mm×1mm)に切ります。 注意:どのエッジにも触れないでください。</li>
	<li>製造指図ごとに基底膜抽出物(BME)を解凍します。BMEの30 μL/wellを24ウェル組織培養プレートの各ウェルの中央に加えます。BMEの液滴が、エッジに触れることなくプレートの底部に凸型ドームを形成していることを確認してください。 注:冷蔵庫で一晩BMEを解凍してください。BMEは解凍後いつでも氷の上にあるべきです。</li>
	<li>BMEの真ん中に組織を置きます。 注意:脈絡膜の外植を平らにしないでください。一般に、組織をBME内で拡大させる。組織の向き(強膜側の上下)は、実験結果に影響を与えません。</li>
	<li>37°Cでプレートを10分間インキュベートし、ゲルを固化させます。</li>
	<li>完全な古典的な媒体/井戸の500 μLを加える。</li>
	<li>クラシックメディアを1日おきに変更します(500 μL)。脈絡芽は顕微鏡で3日後に観察することができる。 注:成長因子治療のために、4時間組織を飢えます。増殖因子還元培地で試験化合物を希釈する(1:50の代わりに1:200ブースト)。</li>
</ol>3.SWIFT-コロイドコンピュータ化定量方法17 (図2)
注:成長する船舶がカバーする面積を測定するためのコンピュータ化された方法が使用されました。ImageJ ソフトウェアへのマクロプラグインは、定量化の前に必要です (詳細については 補足情報 を参照してください)。
<ol><li>イメージJでチョロイドの発芽画像を開き、「画像|タイプ|グレースケールの 8 ビット "</li>
	<li>「 イメージ |に移動する|を調整する明るさ/コントラスト(Ctrl/シフト/C)を使用し、コントラストを最適化します。</li>
	<li>魔法の杖機能を使用して、新芽の中心に存在する脈絡膜組織を画像から外し、(ショートカットキーを使用してF1")(図2A,B)を使用します。 注:魔法の杖の許容率を20〜30%に設定します。</li>
	<li>自由選択ツール (図 2C)で画像の背景を削除します。「 イメージ |に移動する|を調整するしきい値 (Ctrl/シフト/T)"。閾値関数を使用して、背景および周辺に対する微小血管芽を定義する(図2D)。</li>
	<li>[F2]をクリックすると、概要が表示されます。[保存] をクリックして、選択した領域の画像を保存します。今後の参照のために、元の画像と同じフォルダに保存します。</li>
	<li>サンプルのグループを測定した後、データ分析のために記録されたデータをコピーします。 注:また、「分析|で面積(μm²)を測定することも可能です。スケールバー付きのイメージを使用してスケール " を設定します。</li>
</ol>

<ol><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li>
<li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li>
<li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).</li>
<li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+macular+edema%3A+Beyond+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).</li>
<li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC%3A+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li>
<li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells%3A+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939(2020).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+%28EMRA%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+sprouting+assay%3A+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552(2013).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7%2FmiR-126+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470(2019).</li>
<li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li>
<li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine+proliferated+CD34%28%2B%29+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li>
</ol>

著者らは財務上の開示を行っていない。コンピュータ化された方法は、著者を通じて学術機関に無料で利用可能です。

脈絡膜発芽アッセイは、新血管AMD9、10、18、19、20の研究を助ける。脈絡膜外植は、マウスだけでなく、ラットおよびヒト17、21から単離することができる。脈絡膜外植は、IC、マクロファージ、およびペリサイト17を含む。このアッセイでは、脈絡膜ECとRPE細胞などの隣接細胞との相互作用により、脈絡膜血管成長17に関与するメカニズムの解明に役立つ。さらに、この再現性と半自動評価方法は、観察者間変動性を減少させる17.
<p class="jove_...

脈絡膜血管新生調節異常は、新血管加齢黄斑変性症(AMD)1と関連している。脈絡膜は、網膜色素上皮(RPE)の下に存在する微小血管床である。脈絡膜における血流の減少は、AMD2の進行と関連することが示されている。血管内皮、RPE、マクロファージ、包皮細胞および他の細胞との間の複雑な関係は、組織3、4、5の恒常性を担う。従って、再生可能なアッセイは、新血管AMDの研究に重要な脈絡膜微小環境をモデル化する。
Ex vivo血管新生アッセイおよびインビトロ内皮細胞培養は、生体内の微小血管挙動の研究、新薬の試験、および病原性の研究を補完することができる。ヒトの眼内小血管内皮細胞(HRMEC)、ヒトアンビリカル静脈内皮細胞(HUVEC)、単離された原発性動物の脳または眼内脳の脳などの内皮細胞は、眼血管新生研究6、7、8の体外研究でしばしば使用される。特にHRMECは、内皮増殖、移動、管形成、および血管漏れを評価することによってインビトロ脈絡膜新血管新生(CNV)9のモデルとして広く使用され、介入を評価する6,10。しかし、培養中のECは、脈絡膜に見られる他の細胞型との相互作用が欠如し、これらのアッセイで使用されるほとんどのECが脈絡膜に由来しないため、CNVのモデルとして制限されています。マウス脈絡膜電子株は培養中に分離し維持することが困難である。
大動脈環アッセイは、マクロ血管増殖のモデルとして広く用いられている。大動脈外植植物からの血管芽は、IC、ペリサイトおよびマクロファージ11を含む。大動脈環アッセイは、大血管血管新生ウェル12、13、14をモデル化する。しかし、大動脈環としての脈絡膜新血管化のモデルとしての限界があり、特徴的な脈絡膜微小血管環境を欠いた大血管組織であり、大血管からの芽は微小血管病理に関与する毛細血管ネットワークとは異なる可能性がある。最近、グループは、元生体のレティナルアッセイ15、16を発表しました。しかし、それは、疾患性新血管疾患に適しているが、それはAMDに見られるほど脈絡膜新血管化に適していない。
マウスRPE、脈絡膜、および硬化分離組織を用いた脈絡膜発芽アッセイは、より良いモデルCNVのために開発された。組織はマウス(または他の種)の目17から容易に単離することができる。このアッセイは、薬理学的化合物のプロおよび抗血管新生電位の再現性評価及び遺伝子組換えマウスおよび対照18からの組織を用いた脈絡膜新生血管形成における特定の経路の役割の評価を可能にする。この脈絡膜発芽アッセイは、その後の多くの出版物9、10、18、19、20で参照されています。ここでは、このアッセイの使用に関与する方法が示される。

<table><tbody><tr><td>AnaSed(キシラジン)</td><td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>基底膜抽出物(BME) マトリゲル</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10cm</td></tr><tr><td>血清とCultureBoost細胞システムを備えた完全なクラシック培地</td><td></td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール 200 プルーフ</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>70%</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>組織培養プレート (24ウェル)</td><td>Olympus</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>VetaKet CIII (Ketamine)</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

加齢黄斑変性症の顕著な特徴である病的脈絡膜血管新生は、視力障害および失明を引き起こしうる。ヒトのレチナル微小血管内皮細胞(HRMEC)または単離された一次性の腎細胞を用いた内皮細胞(EC)増殖アッセイは、腎血管新生を研究するために、インビトロモデルで広く使用されている。しかし、純粋なマウスのレチナル内皮細胞を単離することは技術的に困難であり、RETINAL ECは脈絡膜内皮細胞および異なる細胞/細胞相互作用とは異なる増殖応答を有する可能性がある。脈絡膜微小血管増殖のモデルとして、再現性の高いex vivo脈絡膜発芽アッセイが開発された。このモデルには、脈絡膜血管系(EC、マクロファージ、ペリサイト)と網膜色素上皮(RPE)の相互作用が含まれます。マウス RPE/脈絡膜/鎖状外植体は、成長因子減少基底膜抽出物(BME)(0日目)で単離され、インキュベートされる。培地は1日おきに変化し、6日目に脈絡芽が定量される。個々のチョロイド外植の画像は反転した位相顕微鏡で撮影され、発芽領域は、本研究室で開発されたImageJソフトウェアへの半自動マクロプラグインを使用して定量化されます。この再現性ex vivo脈絡膜発芽アッセイは、潜在的な治療のための化合物を評価し、微小血管疾患研究のために、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた脈絡膜微小血管増殖に関与する経路を評価するために使用することができる。

1日あたりの脈絡芽成長の比較
BMEに埋め込まれた鎖骨で脈絡膜を解剖し、6日間培養した(図1)。C57BL/6Jマウスで3日目から6日目までの脈絡芽を顕微鏡で調べ、ImageJでの半自動定量法をSWIFT-チョロイドで定量した。代表的な場合、発脈芽領域(外植から伸びる血管は、外植自体を除く)は、3日目(図3A)、4日目(図3B)で1.47mm2、5日目(図3C)で5.62mm2、6日目に10.09mm2(図3D)で0.38mm(外植自体を除く)であった。 
遊離脂肪酸受容体(FFAR)4抑制は、...

このプロトコルは、微小血管増殖の元生体モデルである脈絡芽発芽アッセイを提示する。このアッセイは、脈絡膜微小血管の増殖に関与する経路を評価し、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた薬物治療を評価するために使用することができる。

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

この脈絡膜アッセイは、脈絡膜血管新生研究や加齢黄斑変性症、AMDの微小血管挙動のin vivo研究を補完することができるため、再現性が高く、関連性があります。このアッセイは、血管新生AMDの治療法として候補となる化合物のスクリーニングや、野生型および遺伝子改変マウス組織を用いた脈絡膜血管新生に関与する経路の評価に使用することができます。まず、5ミリリットルのペニシリン、ストレプトマイシン、10ミリリットルと5ミリリットルの市販サプリメントを500ミリリットルの完全なクラシック培地と血清を加え、50ミリリットルの培地をアリコートして、基底膜抽出物またはBMEを摂氏2〜8度の冷蔵庫で一晩解凍します。完全なクラシックメディウムのアリコートを氷の上に置きます。解剖顕微鏡、鉗子、はさみを70%エタノールで洗浄します。細胞培養皿を準備し、1つを解剖顕微鏡に、もう1つを氷上に置きます。次に、各皿に10ミリリットルの完全なクラシックミディアムを追加します。解剖する前に、氷上の完全なクラシックメディウムに目を保ってください。結合組織と視神経を切除し、マイクロハサミを使用して角膜輪部の後方0.5ミリメートルを円周方向に切ります。角膜虹彩複合体、硝子体、およびレンズに除去します。視神経に向かって切断端に対して垂直に1ミリメートルの切開を行い、円周方向に1ミリメートル幅のバンドを切断し、複合体の中央領域と周辺領域を分離します。鉗子を使用して、RPE脈絡膜強膜複合体から網膜を剥がします。末梢の脈絡膜バンドを氷上の完全なクラシックメディウムに保ちます。もう一方の目を分離し、このプロセスを繰り返して2番目のバンドを切断します。円形のバンドを5〜6個のほぼ等しい正方形にカットします。解凍したBMEを30マイクロリットルを24ウェル組織培養プレートの各ウェルの中央に加えます。BMEの液滴が端に触れずにプレートの底部に凸状のドームを形成していることを確認してください。組織をBMEの中央に置きます。脈絡膜Xの植物を平らにしないでください。組織をBME内で拡張させます。プレートを摂氏37度で10分間インキュベートしてゲルを固化させ、500マイクロリットルの完全クラシック培地を各ウェルに加えます。クラシックメディアは一日おきに交換してください。コロイドの発芽は、顕微鏡で3日後に観察できます。画像Jで脈絡膜発芽画像を開き、画像、タイプ、グレースケールで8ビットを確認します。次に、画像、調整、明るさのコントラストを選択して調整することにより、コントラストを最適化します。魔法の杖機能を使用して、芽の中心に存在する脈絡膜組織の輪郭を描き、除去します。無料の選択ツールで画像の背景を削除します。次に、画像に移動し、しきい値を調整し、しきい値機能を使用して、周辺部の背景に対して微小血管の芽を定義します。F2 をクリックすると、概要が表示されます。[保存]をクリックして、選択した領域の画像を元の画像と同じフォルダに保存し、後で参照できるようにします。サンプルのグループを測定したら、記録されたデータを分析用にコピーします。このプロトコルは、C 57、ブラック6 Jマウスの3日目から6日目までの脈絡膜の発芽を調べ、定量するために使用されました。代表的なケースでは、脈絡膜の発芽面積は、3日目、4日目、5日目、6日目でそれぞれ0.38、1.47、5.62、10.09ミリメートルでした。FFAR4の喪失が脈絡膜血管の発芽に及ぼす影響は、FFAR4 4ノックアウトマウスおよびFFAR4野生型マウスの脈絡膜発芽アッセイを使用して評価されました。FFAR4ノックアウトマウスの発芽領域は、6日目にFFAR4野生型と比較して脈絡膜血管の成長を増加させました。さらに、1マイクロモルFFAR4アゴニストによる治療は、6日目に未治療のマウスと比較して脈絡膜発芽面積を減少させました。このアッセイにより、遺伝子組み換えマウス組織を用いた脈絡膜新生血管新生における薬理学的化合物の抗血管新生能と特定の経路の役割の変動を再現可能な評価が可能になります。

an-ex-vivo-choroid-sprouting-assay-ocular-microvascular

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JoVE Journal

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生物学

角膜は、血管組織を欠いている点でユニークです。しかし、堅牢な血管の成長と生存が強力な血管新生因子によって角膜に誘導することができる。そのため、角膜は私達と血管新生の研究のための貴重なツールを提供することができます。このプロトコルは、角膜のポケットアッセイのマウスモデルを実行する方法と、このモデルを用いて血管新生因子によって誘導される血管新生を評価する方法を示しています。...

血管新生研究のための角膜ポケットアッセイのマウスモデル

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初期血管新生評価のためのビーズスプラウティングアッセイ:周皮細胞の存在下での内皮スプラウティングを研究するためのインビトロビーズベースモデル

このビデオは、眼の微小血管血管新生を研究するための脈絡膜発芽のex...

眼の微小血管増殖をex vivoで研究するための脈絡膜萌芽アッセイ

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

プロトコルは、マウスにおいて開発された角膜マイクロポケットアッセイを説明しています。...

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

血管新生は、生理学的に関連性のある環境で調査する必要があるマルチセル、マルチシステムの相互作用を含みます。この研究の目的は、ラット腸間膜培養モデルが血管新生中の無傷の微小血管ネットワークのタイムラプス比較を行う能力を実証することです。...

アン<em&gt; ex vivoで</em&gt;メソッド培養ラット腸間膜微小血管ネットワークのタイムラプスイメージングのための

In vitro血管芽腫 (HBs) と HBs におけるその役割の古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案します。結果は、HB 血管新生の複雑さを強調表示し、血管新生のこの共通の形態の HB...

発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

この方法は、標準化されたマイクロ流体プラットフォームにおける40の浸透した3Dマイクロ容器としてiPSC由来内皮細胞の培養を記述する。このプラットフォームは、アナストモシスや、スケーラブルで高スループットな方法での血管新芽の安定化を含む、3Dでの勾配駆動血管新生芽芽の研究を可能にします。...

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

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Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

発芽血管新生は、発生と疾患の基本であり、複雑な分子的および機械的プロセスに関与しています。ブタの頸動脈からの細胞芽を解析し、硬さ依存性の血管新生と明確なリーダーフォロワー細胞力学を明らかにする、汎用性の高い2.5D ex vivo...

生体組織における発芽血管新生の ex vivo 機械的特性評価のための2.5Dモデル

学ぶ、眼の脈絡膜血管新生を研究するエキスビボアッセイ法。マウス組織を用いて微小血管増殖を評価し、加齢性黄斑変性症の治療薬スクリーニングや経路解析に応用できます。

眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ

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