単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

SM FISHは、特定のRNaseのレベルと局在を正確に定量します。この方法は、RNAの対立遺伝子変異による細胞間および対立遺伝子の分析に特に有用です。遺伝子の転写は細胞生物学において不可欠なプロセスであり、SM FISHは、単一細胞レベルでの外部刺激に応答したRNA含有量の調査を可能にし、空間情報を提供します。

エストロゲン受容体アゴニスト治療後、カルシウムとマグネシウムを含む冷間滅菌PBSで細胞を洗浄し、500マイクロリットルの固定緩衝液で細胞を氷上に30分間固定します。インキュベーションの終了時に、カルシウムとマグネシウムを入れた冷間滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、各ウェルに500マイクロリットルの70%エタノールを加えます。次に、24ウェルプレートをパラフィンプラスチックフィルムで密封し、プレートを摂氏4度のローテーターに少なくとも4時間、最大16時間

RNA FISHハイブリダイゼーションでは、インキュベーションの最後に、10%ホルムアミドを添加した500マイクロリットルの2X SSCバッファーで細胞を1回洗浄し、室温で5分間ローテーターで洗浄します。インキュベーション中に、RNA表面除染で洗浄したガラスシャーレに、パラフィンプラスチックフィルムを未露出面を上にして置き、ディッシュの端に沿って滅菌水飽和ペーパータオルを置きます。インキュベーションの終了時に、新たに調製したGREB1イントロンおよびGREB1エクソンプローブバッファーの30マイクロリットルの液滴を等間隔でパラフィンプラスチックフィルムのきれいな面に置き、滅菌鉗子を使用して、細胞側を下にして細胞のカバースリップを1つ気泡のない各液滴に静かに置きます。

パラフィンプラスチックフィルムで皿を密封した後、プレートをホイルで覆い、回転しない平らな面で摂氏37度でプレートを一晩インキュベートします。翌朝、鉗子を使用してカバースリップを24ウェルプレートセル側に戻して、加熱されたローテーターで摂氏37度で10%ホルムアミドを添加した新鮮な2X SSCバッファー500マイクロリットルで15分間の洗浄を2回行います。2回目の洗浄後、2X SSCバッファー中の1ミリリットルあたり1μgのDAPIでローテーター上で室温で10分間DNAを対比染色し、続いて室温で2X SSCバッファーで5分間洗浄します。

ペーパータオルを使用して余分な2X SSCバッファーを除去し、ヌクレアーゼフリーの水でサンプルをすすぎ、余分な塩分を除去します。次に、非硬化性の封入剤を使用してカバースリップをスライドガラスにマウントし、透明なマニキュアでカバースリップを密封します。サンプルイメージングでは、sCOMSカメラに60倍または100倍のオイル対物レンズを備えた広視野落射蛍光顕微鏡ステージに、予想される最大強度のスライドをロードし、対物レンズに液浸油の液滴を置きます。

Zstackの取得では、DAPIチャネル内のサンプルに焦点を絞り、DAPI染色された核が焦点から外れる距離でZstackの上部と下部を選択します。スライドを使用して、光源からの照明量と各チャンネルの露光時間を最適化し、光の退色やカメラのピクセル飽和を回避する条件下ですべてのスライドから画像を取得します。取得後、10サイクルの積極的な修復アルゴリズムを使用して、画像をデコンボリューションし、使用するカメラのビット深度に従ってすべての投影画像を保存します。

画像解析を行うには、まず GitHub から Jupiter Notebook をダウンロードし、Python Anaconda Distribution バージョン 3.6 以降をインストールします。Anacondaプロンプトを開き、インストールコマンドを入力してAnaconda用のSimpleITKをインストールします。Anaconda Navigatorを開き、Jupiter Notebookを起動します。

Webブラウザが開き、ディレクトリとファイルが表示されます。ディレクトリ構造を参照して、GitHub からダウンロードした Jupiter Notebook を含むディレクトリにアクセスします。次に、ノートブックを開き、ShiftキーとEnterキーを押して各セルを実行します。

この代表的な実験では、接着性乳がん細胞をエストロゲン受容体アゴニストまたはビヒクルで24時間治療しました。GREB1イントロン配列およびエクソン配列に対してスペクトル分離されたプローブセットにより、新生および成熟mRNAの同時可視化および定量化が可能になりました。重要なことに、エストロゲン応答時間コースの一部であることが示されている各細胞内の転写活性対立遺伝子の数をマークすることができます。

重なり合うイントロンスポットとエクソンスポットをカウントすると、E2処理細胞は、ビヒクル処理細胞と比較して、2つ以上の活性GREB1対立遺伝子を示す細胞の割合が4倍増加していると判断されました。イントロンが新生mRNAからスプライシングされて、エクソン配列のみで構成される成熟mRNAを生成するため、グリーンスポットの数を定量化することで、細胞あたりの成熟mRNAの数をカウントできます。これらのデータをプロットすることで、成熟したGREB1 mRNA細胞の分布の変化と、E2処理後の細胞集団の凝集倍率変化を観察することができます。

C-FISHは複数のRNA種を順次調べることができ、MERFISHはマルチプレックスを大幅に増やすバーコード技術、iFISHはRNAとタンパク質を同時に調べることができます。