Name: 単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学ぶ単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析。エストロゲン受容体作動薬処理後の細胞固定と蛍光プローブハイブリダイゼーションを用いて、RNAレベルと局在を正確に定量化し、遺伝子発現ダイナミクスを解明する方法です。

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MAM、FS、MGMはNIEHS(プロジェクト4、P42ES027704、PI、ルシン)によって資金提供されています。MAM、FS、RMM、MGM、PKSは、CPRITが資金を提供するGCC先端顕微鏡・画像情報学センター(RP170719)によってサポートされています。イメージングは、NIH(DK56338、CA125123)、CPRIT(RP150578)、ダン・L・ダンカン総合がんセンター、ジョン・S・ダン・ガルフ・コースト化学ゲノミクス・コンソーシアムからの資金提供を受けて、ベイラー医科大学の統合顕微鏡コアによってもサポートされています。

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<li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li>
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<li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59, 209-221 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

記載されている smFISH の方法論は、以前に公開されたプロトコル7、12、14に基づいています。このプロトコルでは、ウェットラボ(播種密度、固定時間、透過性、プローブ濃度を含む)からイメージングおよび画像解析に最適化された重要なステップを説明し、遺伝子転写の単一細胞分析を行うことに興味を持つ研究所に完全な実験パイプラインを提供します。
単一細胞分析を容易にするためには、細胞境界を必要とせずに細胞境界が推定されるように、細胞がサブコンフルエントであり、重なり合わないことが重要です。実験期間中、広範囲の播種密度に及ぶ細胞増殖アッセイを完成させ、細胞密度を最適化することを提案します。
smFISH実験を成功させるには、最適な固定時間を決定することが重要です。我々は、VRCを含む滅菌PBSで氷上で30分間希釈した4%精製ホルムアルデヒドでサンプル...

遺伝子の転写と翻訳は、DNA配列からRNA、タンパク質1に移り、生物学の中心的な教義に関与する2つの主要なプロセスです。本研究では、転写中のメッセンジャーRNA(mRNA)の産生に焦点を当てます。新生RNA分子には、非コードイントロンとコーディングエキソンの両方が含まれます。イントロンは、mRNAが細胞質に移動してリボソーム2,3に翻訳する前に共転写される。
従来、mRNAの測定は、RT-qPCRまたはノーザンブロッティングなどの古典的なアッセイを用いて細胞のバルク集団(数百〜数百万)で行われます。非常に強力であるが、これらの方法は、細胞間変動(表現型ヘテロジェネリティ)、転写活性対立遺伝子の数の同定、そしておそらくより重要なことに、空間情報を欠いているという洞察を提供しないことから、限定的である。最近では、単一細胞RNAシーケンシング(RNAseq)を可能にするゲノムワイド技術は、イメージング法とシーケンシング4との間のギャップを埋め始めた。しかし、RNAseqは比較的低い検出効率に苦しんでおり、処理手順は空間情報5を完全に失う結果となる。単一細胞RNAEqは、同一性細胞の集団の中で表現型ヘテロジニアリティに関する洞察を提供することができるが、その現場でのRNA蛍光(RNA-FISH)は、空間レベルでの標的遺伝子発現のより完全な探索を促進し、かつアレル単位6,7に基づく。
RNA FISHは、固定細胞内の標的RNA分子の検出と局在化を可能にする技術です。従来とは異なり、骨状の方法、現在の最先端のRNA-FISHは、標的RNA配列と相補的である市販の核酸プローブを利用し、これらのプローブはWatson-Crick塩基対合体8によってそれらの標的にハイブリダイズする。初期のシチュハイブリダイゼーション技術は、1969年にGallとPardueによって確立された同様のプロトコルを含み、サンプルとして標的RNA9に特異的にハイブリダイズした核酸プローブで処理された。もともとアッセイは放射性または色分け検出を使用して行われました。しかし、1980年代には、DNA FISHおよび後のRNA FISHへの蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)プロトコルの開発は、より敏感な検出への経路を開き、10,11を多重化する可能性を秘めている。
RNA FISHのさらなる発展は、単一RNA分子(smFISH)12,13を検出し定量する能力をもたれている。直接検出は、プローブ自体がフルオロフォアで標識される方法です。smFISHの課題は、蛍光シグナルを明確で回折制限されたスポットとして検出するのに十分なハイブリダイジングプローブ/ターゲットが必要な点です。この問題に対処するために、1つは、標的RNA8、12、14の様々な領域に相補的な短い一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのプローブセットを使用することができる。複数のプローブの結合は、局所的な蛍光色素密度を増加させ、蛍光顕微鏡による明確で高強度のスポットとしてRNAを可視化します。この方法は、プローブセットプール内のオリゴヌクレオチドのオフターゲット結合は、真のシグナルとスプリアスオリゴヌクレオチド結合を区別するためにスポットサイズと強度を定量的に解析することによって真のRNAスポットシグナルと区別できるため有利であり、したがって偽陽性12を低減することによってより正確な分析を促進する。
mRNAを検出する代替方法は、古典的なBACクローンベースのニック翻訳法と、最近開発された分岐DNAシステムです。BACクローンのニック翻訳法では、標識されるDNAは酵素的にニックされ、新しいヌクレオチドが露出した3'末端に追加されます。DNAポリメラーゼIの活性は、所望のプローブ15,16に至る標識ヌクレオチドを付加する。分岐DNA技術は、RNA標的と対にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含み、これらのプローブは複数のシグナル増幅分子を利用して増幅される。この方法は、信号対雑音比を大幅に改善することができますが、蛍光スポットは大きく異なるサイズと強度17であるため、増幅は正確な定量を歪めることができます。
このプロトコルのモデルシステムとして、ガルベストンベイ/ヒューストンシップチャンネルにおける内分泌破壊化学物質の影響を定量化するためにNIEHSスーパーファンド研究プログラムの参加の一環として完全に採用され、エストロゲン受容体(ER)陽性乳癌細胞株MCF-7をERアゴニスト、17β-エストラジオール(E2)7,18,19で一晩投与した。E2は、原型的なER標的遺伝子を含む多くのER標的遺伝子を調節する、GREB17、20、21、22。ここで説明する smFISH プロトコルは、GREB1 を対象とする 2 つのスペクトル分離プローブ セットのセットを使用します。エキソンにハイブリダイズする1つとイントロンに他の1つを、成熟したRNAと新生RNA7の両方の測定を可能にする。次に、画像smFISH標識サンプルにデコンボリューションと相まって蛍光顕微鏡を使用し、画像分析ルーチンを適用して細胞当たりの活性対立胞および成熟RNAの数を定量化する。

<table><tbody><tr><td>17&ベータ;エストラジオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td>CAS 番号 50-28-2</td></tr><tr><td>Ambion SSC (20X) バッファー、Rnase フリー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Fisher</td><td>Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>ピルビン酸ナトリウムなし</td></tr><tr><td>デキストラン硫酸塩、50% 溶液 滅菌済み</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3730-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 Ca++/Mg++</td><td>Corning</td><td>21030CV</td><td>Calbiochem Ethanol 製</td></tr><tr><td>、200 プルーフ (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td><td>Corning</td><td></td><td>353047 Manufactured by Decon Laboratories</td></tr><tr><td>Fetalウシ血清(FBS)、500 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-753-2978</td><td>ジェミニバイオプロダクツ社製</td></tr><tr><td>GEヘルスケア デルタビジョンLIVE高解像度デコンボリューション顕微鏡</td><td>GEヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハイクロン水、分子生物学グレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH3053802</td><td></td></tr><tr><td>浸漬油 1.516</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>29162940</td><td>GE社製ヘルスケア バイオサイエンス</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT25005Cl</td><td>コーニング社製</td></tr><tr><td>MCF-7細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>分子グレードホルムアミド</td><td>プロメガ</td><td>PAH5051</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス 60倍/1.42 NA 対物</td>レンズ <td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ビーミス社</td><td>52858-076</td><td>VWR</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16%溶液、EMグレードの</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>MT3001Cl</td>コー<td>ニングリ</td></tr><tr><td>ボヌクレオシドバナジルコンプレックス</td><td>VWR101229-716</td><td></td>ニュー<td>イングランドバイオサイエンス</td></tr><tr><td>RNaseアウェイ</td><td>アンビオン</td><td>9780によって製造</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム、100 mM</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-360-070</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Thermo Scientific ガラスカバースリップ、#1.5</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-81P</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100、100 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP151-100</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 溶液 0.25%</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 退色防止封入剤 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9265087</td><td>Vector Laboratories 製</td></tr></tbody></table>

単一分子fishによる転写活性アレスの単一細胞解析

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

遺伝子転写は細胞生物学に不可欠なプロセスであり、細胞が内部および外部の手掛かりを解釈して応答することを可能にします。mRNA レベルを測定する従来のバルク集団法(ノーザンブロット、PCR、およびRNAseq)は、応答の細胞間変動に関する情報を提供する能力を欠いています。精密な単一細胞およびアレスリックな視覚化および定量は、単一分子RNA蛍光を使用して、その場合のハイブリダイゼーション(smFISH)で可能です。RNA-FISHは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的RNAをハイブリダイズすることによって行われる。これらは中/高スループットのモダリティで画像化することができ、画像解析パイプラインを通じて、成熟したRNAと新生のRNAの両方に関する定量的なデータを単一のセルレベルで提供します。固定、パーメアビライゼーション、ハイブリダイゼーション、イメージングのステップは、ここに記載されているモデルシステムを使用して長年にわたって実験室で最適化されており、smFISH標識の単一細胞分析が成功し、堅牢になります。サンプルの準備と処理の主な目的は、信号対雑音比が高く、誤検出を低減し、より正確なデータを提供する高品質の画像を生成することです。ここでは、サンプルの準備からデータ分析までのパイプラインを、特定のサンプルに合わせて調整するための提案と最適化手順と組み合わせて説明するプロトコルを紹介します。

smFISHを介したホルモン応答を分析するために、例として、NIEHSスーパーファンド研究プログラム7への参加の文脈で環境災害における内分泌破壊化学物質の存在を決定するために、高スループットアッセイに使用されるエストロゲン受容体(ER)モデルを選びました。本実験では、付着性MCF-7乳癌細胞を、ERアゴニスト17β-エストラジオール(E2,10nM)または車両(DMSO)で24時間治療した。GREB1イントロニック(Atto 647N、 図1の赤)とエキソン(図 1のクエーサー570、緑色)配列に対するスペクトル分離プローブセットは、新生および成熟したmRNAの同時可視化と定量を可能にする。重要なのは、エストロゲン応答時間コース7の一部であることが示されている各細胞における転写活性対立遺伝子の数をマーキングする。
完成したプロトコルは、対象領域ごとに 16 ビット最大強...

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

SM FISHは、特定のRNaseのレベルと局在を正確に定量します。この方法は、RNAの対立遺伝子変異による細胞間および対立遺伝子の分析に特に有用です。遺伝子の転写は細胞生物学において不可欠なプロセスであり、SM FISHは、単一細胞レベルでの外部刺激に応答したRNA含有量の調査を可能にし、空間情報を提供します。エストロゲン受容体アゴニスト治療後、カルシウムとマグネシウムを含む冷間滅菌PBSで細胞を洗浄し、500マイクロリットルの固定緩衝液で細胞を氷上に30分間固定します。インキュベーションの終了時に、カルシウムとマグネシウムを入れた冷間滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、各ウェルに500マイクロリットルの70%エタノールを加えます。次に、24ウェルプレートをパラフィンプラスチックフィルムで密封し、プレートを摂氏4度のローテーターに少なくとも4時間、最大16時間置きます。RNA FISHハイブリダイゼーションでは、インキュベーションの最後に、10%ホルムアミドを添加した500マイクロリットルの2X SSCバッファーで細胞を1回洗浄し、室温で5分間ローテーターで洗浄します。インキュベーション中に、RNA表面除染で洗浄したガラスシャーレに、パラフィンプラスチックフィルムを未露出面を上にして置き、ディッシュの端に沿って滅菌水飽和ペーパータオルを置きます。インキュベーションの終了時に、新たに調製したGREB1イントロンおよびGREB1エクソンプローブバッファーの30マイクロリットルの液滴を等間隔でパラフィンプラスチックフィルムのきれいな面に置き、滅菌鉗子を使用して、細胞側を下にして細胞のカバースリップを1つ気泡のない各液滴に静かに置きます。パラフィンプラスチックフィルムで皿を密封した後、プレートをホイルで覆い、回転しない平らな面で摂氏37度でプレートを一晩インキュベートします。翌朝、鉗子を使用してカバースリップを24ウェルプレートセル側に戻して、加熱されたローテーターで摂氏37度で10%ホルムアミドを添加した新鮮な2X SSCバッファー500マイクロリットルで15分間の洗浄を2回行います。2回目の洗浄後、2X SSCバッファー中の1ミリリットルあたり1μgのDAPIでローテーター上で室温で10分間DNAを対比染色し、続いて室温で2X SSCバッファーで5分間洗浄します。ペーパータオルを使用して余分な2X SSCバッファーを除去し、ヌクレアーゼフリーの水でサンプルをすすぎ、余分な塩分を除去します。次に、非硬化性の封入剤を使用してカバースリップをスライドガラスにマウントし、透明なマニキュアでカバースリップを密封します。サンプルイメージングでは、sCOMSカメラに60倍または100倍のオイル対物レンズを備えた広視野落射蛍光顕微鏡ステージに、予想される最大強度のスライドをロードし、対物レンズに液浸油の液滴を置きます。Zstackの取得では、DAPIチャネル内のサンプルに焦点を絞り、DAPI染色された核が焦点から外れる距離でZstackの上部と下部を選択します。スライドを使用して、光源からの照明量と各チャンネルの露光時間を最適化し、光の退色やカメラのピクセル飽和を回避する条件下ですべてのスライドから画像を取得します。取得後、10サイクルの積極的な修復アルゴリズムを使用して、画像をデコンボリューションし、使用するカメラのビット深度に従ってすべての投影画像を保存します。画像解析を行うには、まず GitHub から Jupiter Notebook をダウンロードし、Python Anaconda Distribution バージョン 3.6 以降をインストールします。Anacondaプロンプトを開き、インストールコマンドを入力してAnaconda用のSimpleITKをインストールします。Anaconda Navigatorを開き、Jupiter Notebookを起動します。Webブラウザが開き、ディレクトリとファイルが表示されます。ディレクトリ構造を参照して、GitHub からダウンロードした Jupiter Notebook を含むディレクトリにアクセスします。次に、ノートブックを開き、ShiftキーとEnterキーを押して各セルを実行します。この代表的な実験では、接着性乳がん細胞をエストロゲン受容体アゴニストまたはビヒクルで24時間治療しました。GREB1イントロン配列およびエクソン配列に対してスペクトル分離されたプローブセットにより、新生および成熟mRNAの同時可視化および定量化が可能になりました。重要なことに、エストロゲン応答時間コースの一部であることが示されている各細胞内の転写活性対立遺伝子の数をマークすることができます。重なり合うイントロンスポットとエクソンスポットをカウントすると、E2処理細胞は、ビヒクル処理細胞と比較して、2つ以上の活性GREB1対立遺伝子を示す細胞の割合が4倍増加していると判断されました。イントロンが新生mRNAからスプライシングされて、エクソン配列のみで構成される成熟mRNAを生成するため、グリーンスポットの数を定量化することで、細胞あたりの成熟mRNAの数をカウントできます。これらのデータをプロットすることで、成熟したGREB1 mRNA細胞の分布の変化と、E2処理後の細胞集団の凝集倍率変化を観察することができます。C-FISHは複数のRNA種を順次調べることができ、MERFISHはマルチプレックスを大幅に増やすバーコード技術、iFISHはRNAとタンパク質を同時に調べることができます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

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