金ナノ粒子とCucurbit[n]urilの凝集体内の正確なプラズモニックナノ接合の形成による尿酸の定量的SERS検出

このプロトコールは、尿酸を高感度に検出および定量するための汎用性の高い方法を提供します。したがって、これは診断および臨床アプリケーションのためのプロトコルです。このプロトコルは、体液などの複雑なマトリックス中のバイオマーカーを迅速に定量化できます。

この技術は、痛風、高血圧、心血管疾患など、尿酸をバイオマーカーとして使用する疾患の診断に拡張できる可能性があります。また、環境モニタリングのために他の有害物質を検出および定量化するためにも使用できます。このプロトコールを初めて試みるとき、研究者は CB7 と金ナノ粒子の安定した凝集体を形成するのに苦労するかもしれません。

超音波処理を使用してCB7溶液中の金ナノ粒子を混合することは、他の技術が凝集速度に影響を与える可能性があるため、推奨されます。CB7 混合剤を添加する重要なステップを示すビデオは、システムを初めて使用する研究者の成功と再現性を高めることができます。金種子の合成では、ガラスバイアル中の10ミリリットルの脱イオン水に98.5ミリグラムのオーリックを溶解して、ガラスバイアル中の500マイクロリットルの脱イオン水に25ミリモルのオーリン酸溶液と64.5ミリグラムのクエン酸ナトリウム粉末を得ます。

次に、250ミリリットルの青いキャップ付きボトルで1ミリリットルの塩化オーラ溶液を99ミリリットルの水で希釈して0.25ミリリットルのオーラ塩化物溶液を取得し、コンデンサーを装備した250ミリリットルの3ネック丸底フラスコに0.25ミリリットルのオーラクロリド溶液99.5ミリリットルを追加します。次に、15分間激しく攪拌しながら溶液を摂氏90度に加熱してから、500マイクロリットルのクエン酸ナトリウム溶液をフラスコに注入し、溶液がルビーレッドに変わるまで攪拌を続けます。金ナノ粒子の播種成長を開始するには、25ミリリットルの金種子溶液を50ミリリットルのチューブに移し、ThermoMixerで溶液を70度に冷却します。

溶液が冷却されている間に、3ミリリットルのルアーロック使い捨て注射器に2.5ミリリットルの25ミリモルオーラ塩化物溶液を充填し、さらに3ミリメートルのルアーロック使い捨て注射器に2.5ミリリットルの60ミリリットルのクエン酸ナトリウム溶液を満たします。.シリンジをシリンジポンプにセットし、Luer-to-MicroTightアダプターを使用して内径150マイクロモルのPEEKチューブをシリンジに接続します。ThermoMixerで冷却した金シード溶液を含む遠心分離チューブにチューブを挿入し、両方のシリンジポンプを167.5マイクロリットルの溶液を20分間分注するように設定します。

ThermoMixerの回転速度を毎分600回転に設定し、25ミリモルのオーラ塩化物溶液を含むシリンジポンプの[開始]を押します。2分後、60ミリモルのクエン酸ナトリウム溶液を含むシリンジポンプの[開始]を押します。.30分後、分析のために金ナノ粒子溶液のアリコートを取り出します。

0.4ミリモルのCB7溶液を調製するには、15ミリリットルのガラスバイアルに4.65ミリグラムのCB7を加え、バイアルに10ミリリットルの水を加えます。しっかりとキャッピングした後、CB7固体が完全に溶解するまでバイアルを室温で超音波処理します。0.4ミリモルの尿酸溶液を調製するには、2.69ミリグラムの尿酸を50ミリリットルの遠心分離チューブに加え、チューブに40ミリリットルの水を追加します。

しっかりとキャッピングした後、摂氏70度、毎分800回転に設定したサーモミキサーで混合物を2時間渦巻かせます。溶液が室温に冷えたら、0.4ミリモルの尿酸溶液1ミリリットルを9ミリリットルの水で15ミリリットルのガラスバイアルに希釈して、0.04ミリモルの尿酸溶液を得ます。.しっかりとキャッピングした後、バイアルを30秒間超音波処理します。

CB7-尿酸複合体を調製するには、750マイクロリットルの0.4ミリモルCB7溶液と750マイクロリットルの0.4ミリモル尿酸溶液を1.5ミリリットルのチューブに加え、混合物を30秒間超音波処理します。.次に、チューブを室温で30分間保持して、ホスト-ゲスト複合体の形成を確認します。ラマンシステムソフトウェアの分光法アプリケーションウィザードアイコンをクリックし、ラマンを選択します。

新しい集録を開始し、積分時間を30秒に、スキャンを平均に5、ボックスカーをゼロに設定します。次に、背景スペクトルを保存し、レーザー波長を入力します。SERS基板形成のためには、900マイクロリットルの40ナノメートル金ナノ粒子溶液と100マイクロリットルの予め形成されたCB7-尿酸錯体溶液を1.5ミリリットルのチューブに加え、溶液がルビーレッドから紫に変わるまで超音波処理する。

サンプル溶液をセミマイクロキュベットに移し、キュベットをラマンサンプルホルダーに入れます。カバーを閉じて測定を開始します。次に、自動保存を設定して、5つの連続したSERSスペクトルを記録します。

合成された金ナノ粒子の紫外可視スペクトルは、10の成長ステップ後に局在する表面プラズモン共鳴ピークが521ナノメートルから529ナノメートルにシフトするのに対し、動的光散乱データは、ナノ粒子のサイズが25.9ナノメートルから42.8ナノメートルに増加すると、狭いサイズ分布を示します。透過型電子像から測定したG0、G5、G10の平均サイズは、それぞれ約20ナノメートル、約33ナノメートル、40ナノメートルです。これらの代表的な解析では、空の CB7 が空の CB7 で形成され、SERS スペクトルの特徴的な尿酸シグナルによって支えられる金ナノ粒子 CB7 ナノ凝集体内に精密なプラズモンナノジャンクションが形成されました。

逆に、CB7 が存在しないと尿酸の SERS シグナルは観察されず、CB7 が金ナノ粒子凝集の引き金となる重要な役割を示しています。このプロトコルで提示された検出スキームの高い感度は、640 および 1130 逆センチメートルの尿酸ピークから 0.2 マイクロモルの検出限界までの明確な SERS 信号の観察によって実証されています。さらに、SERS強度と尿酸の対数濃度との間の非常に強い相関は、0.2〜2マイクロモルの範囲に見られる線形領域を持つ両方のピークについて、べき乗則によって得られました。

尿酸は水溶性が低いため、次のステップの前に尿酸粉末が柔らかくなっていることを確認する必要があります。高度なデータ解析が可能なため、マトリックス中に存在する複数のバイオマーカーを定量することが可能です。