Name: ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶヒト多能性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植法。ネコ大型動物モデルを用いた網膜変性疾患の細胞治療開発に向けた外科的手技を詳細に解説し、臨床応用への基盤を提供します。

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この研究は、NEI Fast-Track SBIR grant R44-EY027654-01A1 および SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones は共同 PI です)。著者らは、Janice Querubin氏(MSU RATTS)が、この研究に含まれる動物の麻酔と一般的なケア、および外科的設定と器具の準備/滅菌の支援を手伝ってくれたことに感謝します。著者らは、移植前日にオルガノイドを受け取り、培地に入れるのを手伝ってくれたPaige Winkler博士と、移植当日の助けに感謝したいと思います。著者らはまた、網膜オルガノイドの入念な出荷、荷送人の組み立て、および各出荷後の温度とGストレス記録のダウンロードについて、Randy Garchar氏(LCTX)に感謝しています。この作品は、作家のイゴール・ナソンキンがバイオタイム(現在のリネージュ)に雇われている間に行われました。

Ratnesh K. Singh, Ph.D.、Francois Binette, Ph.D.、Igor O. Nasonkin博士は、Lineage Cell Therapeutics, Inc.の従業員です。著者は利益相反を宣言しません。

hPSC由来の網膜組織(網膜オルガノイド)の網膜下腔への移植は、PR細胞死(重度または末期失明)によって引き起こされる後期網膜変性疾患の視力を回復するための有望な実験的アプローチです。提示されたアプローチは、ヒト胎児網膜組織片の網膜下移植に基づく以前に開発され、首尾よくテストされた実験的療法に基づいています23、24、25。それは、hPSCに由来する代替の、補充可能で倫理的に許容される網膜組織源の使用を提示します。大眼動物モデル51,55における治療の外科的実現可能性と眼の安全性を実証することは、臨床応用に向けたこの有望なアプローチの進歩に必要です。本稿では,正常網膜と変性網膜の両方を有する大型動物モデル(LCAのCrxRdy/+猫モデル)において,hPSC-3D網膜組織(網膜オ...

世界中の何百万人もの人々が網膜変性症(RD)の影響を受けており、その結果、光感知光受容体(PR)の喪失に関連する視覚障害または失明が生じています。加齢黄斑変性症(AMD)は、遺伝的危険因子と環境/ライフスタイル要因の組み合わせに起因する失明の主な原因です。さらに、200を超える遺伝子と遺伝子座が遺伝性RD(IRD)1を引き起こすことがわかっています。最も一般的なIRDである網膜色素変性症(RP)は遺伝的に不均一であり、約70の遺伝子で3,000を超える遺伝子変異が報告されています2,3,4。小児期に失明を引き起こすレーバー先天性アマウロシス(LCA)も遺伝的に異因性です5,6。遺伝子増強療法が開発され、少数のIRDを治療するための臨床試験が行われています3,7。ただし、IRDの異なる遺伝的形態ごとに治療し、それによって患者のごく一部のみを治療するために、個別の治療法を開発する必要があります。さらに、遺伝子増強は、救助可能な光受容体の集団の存在に依存しているため、進行した変性には適用できません。
したがって、進行性RDおよび重度の終末期失明に対処および治療する治療法の開発には、緊急でありながら満たされていない臨床的ニーズがあります。過去20年間、神経補綴インプラントは、人間が使用する前に、猫などの大型動物モデルで開発およびテストされてきました8,9,10,11,12,13,14。同様に、過去20年間で、網膜下に移植された胚性または成熟した哺乳類の網膜のシートを利用した網膜補充療法が開発され15,16,17,18,19,20,21,22、RD患者でも成功裏に試験されています23,24,25.どちらのアプローチも、新しいセンサー(神経補綴デバイスの場合は光起電力シリコンフォトダイオード26,27、網膜シート移植の場合はシートに編成された健康な突然変異のない光受容体)を変性PRの網膜に導入するというアイデアを利用しています。最近の研究では、ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜前駆細胞28,29、hPSC光受容体30、hPSC-網膜オルガノイド31,32,33の移植などの幹細胞ベースのアプローチの使用が調査されています。網膜オルガノイドは、ディッシュ内での網膜組織の形成と、発達中のヒト胎児網膜の光受容体層に似た数千の突然変異のないPRを有する光受容体シートの誘導を可能にします34,35,36,37,38,39,40.hPSC由来の網膜組織(オルガノイド)をRD状態の患者の網膜下腔に移植することは、新しく有望な治験細胞療法アプローチの1つであり、多くのチームによって追求されています31、32、41、42。(若い光受容体または網膜前駆細胞の)細胞懸濁液の移植と比較して、胎児の光受容体の移植シートは、臨床試験で視力の改善をもたらすことが実証されました23,24。
ここで提示されたプロトコルは、移植片の生存率を高め、シートの保存を改善するために、PRを備えた無傷の網膜シートを導入するための潜在的により良い方法として、網膜オルガノイド全体(オルガノイドリム33,41ではなく)の網膜下送達のための移植手順を詳細に説明しています。ヒト網膜の平らな部分とRPEパッチを導入するための手順が開発されていますが43、44、45、より大きな3D移植片の移植は調査されていません。幹細胞由来の網膜オルガノイドは、視力回復技術を開発するための光受容体シートの無尽蔵の供給源を提供し、倫理的制限がなく、進行性RDおよび終末失明の治療に焦点を当てた治療のためのヒト網膜組織の優れた供給源と考えられています46。宿主の網膜ニッチ(神経網膜、網膜色素上皮、網膜および脈絡膜血管系)への損傷を最小限に抑えて網膜オルガノイドを正確に網膜下移植するための外科的方法の開発は、そのような治療を臨床応用に向けて進めるための重要なステップの1つです31,32。ネコ、イヌ、ブタ、サルなどの大型動物モデルは、外科的送達方法を調査するための優れたモデルであることが証明されており、移植された組織シート(網膜色素上皮(RPE)細胞)の安全性を実証し、オルガノイドの使用を調査しています41、44、45、47、48、49、50.大きな動物の目は、人間の黄斑6,51,52に似た錐体(領域中心)を含む高い光受容体密度の領域の存在を含む、人間と同様の地球サイズと類似の解剖学的構造を持っています。
本稿では、ネコ大型動物モデル(野生型およびCrxRdy/+ネコ)の網膜下腔にhPSC由来の網膜組織(オルガノイド)を移植する技術について述べており、有望な有効性の結果32,53とともに、RD状態を治療するための臨床応用に向けたそのような治験療法のさらなる開発の基礎を構築します。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上PESメンブレン付きmポアシリンジ</td><td>フィルターCameo</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>拡張可能な41Gカニューレ付き23G網膜下インジェクター</td><td>DORC</td><td>1270.EXT</td><td></td></tr><tr><td>250 & micro;Lハミルトンガスタイトルアーロックシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>6-0シルク縫合糸</td>エ<td>チコン</td><td>707G</td><td></td></tr><tr><td>6-0 / 7-0ポリグラクチン縫合糸</td>エ<td>チコン</td><td>J570G</td><td></td></tr><tr><td>アセプロマジンマレイン酸500mg / 5mL(エースプロジェクト)</td><td>ヘンリーシャインアニマルヘルス</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr>ブ<tr><td>プレノルフィン0.3mg / mL</td><td>パー医薬品NA</td><td></td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>cSLO + SD-OCT</td><td>ハイデルベルクエンジニアリング</td><td>スペクトラリスHRA + OCT</td><td></td></tr><tr><td>シクロスポリン</td><td>ノバルティス</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>デキサメタゾン2mg / mL (アジウム)</td><td>ベトン</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>ドキシシリン25mg / 5mL</td><td>Cipla</td><td>NA</td><td>さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>致命的なプラス溶液 (ペントバルビタール溶液)</td> <td>ボルテック</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン 20mg/2mL</td><td>ホスピーラ</td><td></td><td>NAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー(薄肉シングルバレル標準ホウケイ酸(ショットデュラン) ガラス管</td><td>ワールド精密機器</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>メチルプレドニゾロンアクテテート40 mg / mL</td>ファイ<td>ザーNA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>OCT媒体(ティッシュテックOCT化合物)</td><td>さくら</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>オリンピックVac-PACサイズ23</td><td>Natus</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr>パラ<tr><td>ホルムアルデヒド16%溶液</td><td>EMS</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>塩酸フェニレフリン10%点眼液</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>プレドニゾロン15mg / 5mL</td><td>Akorn</td><td></td><td>NAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>Propofol 500mg / 50mL (10 mg / mL) (PropoFlo28)</td><td>Zoetis</td><td>NA</td><td>は、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>RetCam IIビデオ眼底カメラ</td><td>Clarity Medical Systems</td><td>NA</td><td>さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>トリアムシノロン 400mg/10 mL (Kenalog-40)</td><td>ブリストル -マイヤーズ スクイブ カンパニー</td><td>NA</td><td>さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>トロピカミド 1% 眼科用溶液</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr><tr><td>硝子体切除術 23G ポート</td><td>アルコン</td><td>アキュラス システム</td><td></td></tr><tr><td>硝子体切除機</td><td>アルコン</td><td>アキュラス システム</td><td></td></tr><tr><td>硝子体-網膜垂直80°Cスクイーズハンドル付きはさみ</td><td>Frimen</td><td>FT170206T</td><td></td></tr></tbody></table>

ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

加齢黄斑変性症(AMD)、網膜色素変性症(RP)、レーバー先天性アマウロシス(LCA)などの光受容体喪失に関連する網膜変性(RD)状態は、進行性および衰弱性の視力喪失を引き起こします。光受容体が失われた後に視力を回復させることができる治療法に対する満たされていないニーズがあります。ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織(オルガノイド)を高度なRDを用いて眼の網膜下腔に移植すると、何千もの健康な変異のない光受容体を備えた網膜組織シートが得られ、1つの承認されたプロトコルで光受容体変性に関連するほとんど/すべての失明性疾患を治療する可能性があります。動物モデルおよび進行RD患者の網膜下腔への胎児網膜組織の移植は成功裏に開発されているが、倫理的懸念および限られた組織供給のためにルーチン療法として使用できない。大眼遺伝性網膜変性症(IRD)動物モデルは、網膜細胞/組織を網膜下腔に移植するための高度な外科的アプローチを利用した視力回復療法の開発に価値があります。地球規模と視細胞分布の類似性(例えば、黄斑様領域 の中心の存在)と、ヒトIRDを厳密に再現するIRDモデルの入手可能性は、有望な治療法の臨床への迅速な翻訳を促進するでしょう。ここでは、hPSC由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する外科的手法を紹介し、動物モデルにおけるこの有望なアプローチの評価を可能にします。

この手順により、大型眼動物モデルの網膜下腔へのhPSC由来の網膜オルガノイドの移植に成功し、再現性のあるものが可能になります(ここでは、健康な光受容体(PR)を持つ野生型猫と、PRと網膜が変性したCrxRdy/+猫の2つの例を使用して示されています)。図1に示す手順を使用して、hPSC由来の網膜オルガノイドを調製し、オルガノイドが損傷しないように注入装置のホウケイ酸ガラスカニューレに装填します。これは、オルガノイドの装填中(ステップ2.10)および手術中(ステップ3.16)(図2A、B)、および手術終了時の眼底イメージング(ステップ3.23、図2C)によって直接視覚化することによって確認できます。この技術を用いた網膜下腔におけるオルガノイドの存在は、眼科検査と眼底イメージング(図3A)によって術後に確認され、オ...

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する手術手技について紹介する。

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

現在のプロトコルは、網膜変性に対する細胞治療アプローチの開発を目指して、大型動物モデルにおける網膜オルガノイド全体の網膜下送達を詳細に示しています。この技術の主な利点は、オルガノイドを標的組織である網膜に直接送達できることです。この技術は、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、レーバー先天性無気力症などの進行した盲検性網膜変性状態の治療を目的としています。手順を実演するのはピーターソン・ジョーンズ博士です。オルガノイドの網膜下移植では、スティーブンス腱切開術はさみを使用して、生後4か月の絶食麻酔をかけた猫に0.5〜1センチメートルの外側カントトミーを行い、適切なサイズのBarraquerまぶたの検鏡を切開部に配置してまぶたを開いたままにします手術助手は、手順全体を通して定期的に角膜をBSSで洗浄します。0.5カストロビエホ角膜結束鉗子と小さな蚊の止血剤を使用して、辺縁部の横にある球結膜をそっとつかみます。2つの6-0シルク縫合糸を4時位置と8時位置の縁のすぐ隣の結膜に配置して、目を主視線で保持し、3番目のまぶたを引っ込めます。縫合糸の端を小さな蚊の止血剤で固定して操作を助け、目を貫通しないように注意しながら、部分的に縁の厚さを通して縁部の12時の位置に別の縫合糸を置きます。縫合糸をゆるく結び、端を短く切り、4時の位置で縁のすぐ隣の結膜にステー縫合糸を置き、目と主視線を保持します。10時から2時の間に球結膜を反射し、腱切開はさみを使用して結膜を縁から2〜3ミリメートル切開します。結膜を弱体化させ、テノンのカプセルを取り除き、辺縁部から3〜5ミリメートルの2時と10時の硝子体切除ポートサイトの強膜を露出させます。キャリパーを使用して強膜切開の部位を特定し、猫で目立つ可能性のある主要な強膜血管を避けます。右利きの外科医のために10時の器具ポートに3ミリメートルの領域を計画し、提案された硬化切開部位で結ばずに6-0または7-0ポリグラクチン十字靭帯パターン縫合糸を事前に配置します。縫合糸が所定の位置に配置されたら、助手に12時のステー縫合糸をつかんでグローブを所定の位置に保ち、0.12ミリメートルのカストロビエホ鉗子を使用して硬化性部位の横にある組織を保持します。トロカールを使用して、レンズとの接触を避けるために視神経に向かって角度を付けた2時位置と10時位置の両方で強膜を通して23ゲージの硝子体切除ポートを導入し、結束鉗子を使用して灌漑ポートをそっと押して、先端を硝子体内で視覚化できるかどうかを判断します。アシスタントにMachemer拡大洗浄硝子体切除レンズを角膜に配置して目の後部を視覚化できるようにし、23ゲージの硝子体切除プローブカッターを機器ポートに通して部分的なコア硝子体切除術を実行してもらいます。次に、1ミリリットルのトリアムシノロン溶液を含む1ミリリットルのシリンジの針を計器ポートに導入し、250〜500マイクロリットルの結晶懸濁液を注入します。溶液が送達されたら、硝子体切除プローブを器具ポートに通し、ポートを網膜表面とは反対側に向けて視神経乳頭に近づけます。高真空を使用して硝子体の顔を網膜から外し、インジェクターを器具ポートから網膜表面に向かって挿入し、カニューレの先端を押し出します。網膜表面の先端をそっと押し、アシスタントにシリンジプランジャーをわずかにすばやく押して網膜剥離を開始し、注入圧力を下げて、目的のサイズが達成されるまで網膜剥離をゆっくりと増加させます。インジェクターの41ゲージのカニューレを使用して、網膜はさみを導入できるようになるまで剥離をわずかに拡大し、10時の強膜ポートを取り外します。次に、視神経に向けられたまっすぐな2.850ミリメートルのスリットナイフを使用して、レンズに触れないようにして、この部位の硬化性切開術を拡大します。移植領域に由来する網膜神経線維の損傷を避けるために視神経から離れたブレブの網膜切開を行い、出血のリスクを減らすために主要な網膜血管を切断しないようにします。オルガノイドを移植するには、拡大した強膜切開術を通してオルガノイドを搭載したガラス毛細管を網膜切開部位に向けて挿入し、毛細血管の先端を使用して網膜切開術をわずかに開き、網膜下ブレブ開口部にアクセスできるようにします。アシスタントにインジェクターのプランジャーをもう一度ゆっくりと押してもらい、オルガノイドを網膜下ブレブに注入します。.BSSはオルガノイド、臓器を進め、網膜切開術を開いて洗い流す必要があります。すべてのオルガノイドが送達されたら、ガラス毛細管を数秒間そのままにしてから、毛細血管を目からゆっくりと取り除き、液体が突然放出されないように注意します。毛細血管が取り外されたら、十字靭帯パターンで事前に配置された縫合糸を使用して強膜切開を閉じます。助手に輸口を取り外してもらい、強膜切開縫合糸をすばやく結び、ポリグラクチン縫合糸で腹膜を簡単な連続パターンで閉じます。6-0ポリグラクチン縫合糸と8の字型皮膚縫合糸で外側カントミーを閉じて外側眼窩を行い、単純な中断された皮膚縫合を使用して残りの傷を閉じます。次に、適切な術後ステロイドと抗生物質カクテルを投与します。ヒト多能性幹細胞由来網膜オルガノイド負荷は、注射装置のガラスカニューレ内および手術中に直接可視化して確認することができる。網膜下腔内のオルガノイドの存在は、眼科検査と眼底画像検査によって術後に確認できます。安楽死の前に、共焦点走査レーザー検眼鏡法およびスペクトルドメイン光干渉断層撮影イメージングを実行して、オルガノイドの位置を評価することもできます。これらの技術は、神経網膜とレシピエント眼の網膜色素上皮との間の網膜下空間における網膜オルガノイドの持続性を実証するために使用することができる。組織学的および免疫組織化学的分析を使用して、免疫抑制動物の大きな眼の網膜下腔内の異種グラフの生存を説明することができます。訓練を受けた獣医眼科医や硝子体網膜外科医など、硝子体網膜手術の熟練した人だけがこの手順を実施する必要があります。このビデオで紹介されている技術は、硝子体網膜手術技術を診療所に翻訳するために使用される他の大型動物モデルに適用できるはずです。

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